NUOVE ANALISI DI COAGULAZIONE PER UNA MIGLIORE DIAGNOSTICA DELLE COAGULOPATIE

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1 Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno Formazione tecnico in analisi biomediche NUOVE ANALISI DI COAGULAZIONE PER UNA MIGLIORE DIAGNOSTICA DELLE COAGULOPATIE Ramona Scolari Responsabile Dr. Mauro Imperiali Ospedale Regionale di Lugano

2 ABSTRACT INTRODUZIONE Negli ospedali dell Ente Ospedaliero Cantonale (EOC) per approfondirne la causa di un tempo di protrombina (PT) patologico il clinico richiedeva l analisi dei singoli fattori della via estrinseca che, assieme ai casi di sospetta emofilia A (per la cui diagnosi è necessaria l analisi del fattore VIII), venivano inviati al laboratorio Synlab di Savosa. Per ottenere più rapidamente il risultato si è deciso d introdurre l analisi dei fattori II, V, VII, VIII e X presso l Ospedale Regionale di Lugano (ORL). MATERIALI E METODI Sono stati analizzati venti campioni in plasma citrato forniti dal laboratorio dell Universitätspital di Zurigo, i controlli di qualità normale e patologico con due controlli esterni sull apparecchio CS2100i della ditta Sysmex (distribuito in Svizzera dalla ditta Siemens). Questi risultati sono stati confrontati con quelli di Zurigo. Entrambi i laboratori usano la stessa metodica. RISULTATI I CV intraserie ed interserie dei controlli di qualità normale e patologico risultano inferiori al 10 % ed i risultati dei controlli esterni rientrano negli ambiti dichiarati dalla ditta. Tramite l analisi statistica eseguita con il programma informatico Analyse it sono stati analizzati i dati dei campioni mediante Altman Bland e la regressione di Passing Bablok la quale indica che i risultati dei due apparecchi non hanno una differenza significativa. CONCLUSIONE Dopo i risultati ottenuti con l analisi statistica dal 15 marzo 2013 sono state introdotte le analisi per i fattori II, V, VII, VIII e X presso l Ospedale Regionale di Lugano. INTRODUCTION In the hospitals of Ente Ospedaliero Cantonale (EOC), in order to explore the cause of a pathological prothrombin time (PT), the clinician required the analysis of the individual factors of the extrinsic pathway which along with suspected haemophilia A (for which diagnosis analysis of the factor VIII is needed) were sent to the laboratory of Synlab in Savosa. To reduce the time needed to get the result it was decided to introduce an analysis of factors II, V, VII, VIII and X at the Regional Hospital in Lugano (ORL). MATERIALS AND METHODS Twenty samples of citrate plasma provided by the laboratory of the university hospital of Zurich, one "normal" and another "pathological" quality control, with two external controls, were analyzed using apparatus from Sysmex CS2100i (distributed in Switzerland by Siemens). These results were compared with those of Zurich. Both laboratories use the same methodology. RESULTS The CVs intraassay and interassay of normal and pathological quality controls result lower than 10% and external controls are in the range. Through the statistical analysis performed with the computer program Analyze it was decided to analyze the sample data obtained using the Altman Bland regression and the Passing Bablok regression. These show that the two machineries do not have a significant difference in the measurement. CONCLUSION After the results obtained with the statistical analysis from March 15, 2013 analyzes for factors II, V, VII, VIII and X have been introduced at the Regional Hospital of Lugano (ORL). 2

3 Ramona Scolari SOMMARIO 1. INTRODUZIONE EMOSTASI Emostasi primaria La coagulazione plasmatica Fibrinolisi VITAMINA K FATTORI DELLA COAGULAZIONE Via estrinseca/via comune Via intrinseca OBIETTIVO MATERIALI E METODI PREANALITICA ANALITICA Tempo di protrombina Metodo per la determinazione dei fattori II, V, VII e X Tempo di tromboplastina parziale attivata Metodo per la determinazione del F VIII RISULTATI CONTROLLI DI QUALITÀ INTRASERIE CONTROLLI DI QUALITÀ INTERSERIE CONTROLLO DI QUALITÀ ESTERNO CAMPIONI ANALIZZATI DISCUSSIONE CONCLUSIONE RINGRAZIAMENTI BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA ALLEGATI

4 1. INTRODUZIONE Con il termine emostasi s intende il complesso processo fisiologico che interviene in caso di lesione dei vasi sanguigni impedendo la fuoriuscita di sangue dagli stessi attraverso la formazione di un coagulo. Un punto fondamentale che porta alla formazione di un coagulo stabile è la coagulazione plasmatica che può essere valutata in laboratorio tramite diversi test come per esempio il tempo di protrombina (Quick o TP) o il tempo di tromboplastina parziale attivata (aptt). Grazie al TP si ha la possibilità di valutare la via estrinseca della coagulazione. Valori di riferimento: % (EOLAB) Quick spontanei patologici, in assenza di terapia anticoagulante dichiarata, vanno ulteriormente indagati per il potenziale pericolo di sanguinamento. A questo scopo, è di grande utilità l analisi dei fattori II, V, VII e X anche in urgenza. Un altro test che permette di valutare la coagulazione plasmatica è l aptt, ossia la valutazione del tempo di coagulazione della via intrinseca, in particolare del fattore VIII nel caso di sospetta emofilia A. Valori di riferimento: < 35 secondi (EOLAB) Attualmente presso i laboratori dell Ente Ospedaliero Cantonale (EOLAB) però, la determinazione singola di questi fattori viene fatta tramite un laboratorio esterno (Synlab a Savosa). Vista l importanza di queste analisi speciali, è utile poterle introdurre presso l Ospedale Regionale di Lugano (ORL). 1.1 EMOSTASI L emostasi è un processo particolarmente articolato il cui scopo è di garantire il flusso sanguigno nei vasi e di impedire la fuoriuscita di sangue in caso di lesione. Questo processo è reso possibile dall azione combinata di diversi fattori: vascolari, piastrinici, plasmatici e meccanismi regolatori che modulano l emostasi. Si può dividere in tre fasi: Emostasi primaria Nel momento in cui un vaso sanguigno viene leso (es. ferita, infiammazione, arteriosclerosi ) lo scopo dell emostasi primaria è di riparare la lesione e preparare il terreno per la coagulazione plasmatica. In questo primo momento vengono coinvolti endotelio, subendotelio e trombociti. L attivazione dei trombociti si può suddividere in quattro fasi susseguenti: contatto dei trombociti con il subendotelio; adesione tramite il F VIII con il recettore GP I dei trombociti al subendotelio. I trombociti si appiattiscono formando una prima barriera; secrezione di ioni calcio, serotonina, ADP, trombossano (accelera la secrezione di ADP con funzione aggregante), PGI2 (modula l aggregazione), PGD2 (inibitrice dell aggregazione); aggregazione di diversi trombociti tramite il ricettore GP IIb/IIIa, ioni calcio e fibrinogeno. Viene liberata ADP che attiva altri trombociti presenti nel sangue che formeranno pseudopodi e parteciperanno alla risposta. 4

5 1.1.2 La coagulazione plasmatica Cascata che comprende varie reazioni enzimatiche il cui scopo è la trasformazione di fibrinogeno in fibrina. Nel modello della coagulazione plasmatica in vitro possiamo distinguere due vie d attivazione tra di loro interdipendenti. VIA INTRINSECA: attivazione sulla superficie dei trombociti attivati. Sulla membrana dei trombociti è presente il fattore P3 (tromboplastina parziale) che crea sulla superficie una carica elettrica negativa che attiva i fattori della via intrinseca. VIA ESTRINSECA: attivazione dalle cellule tessutali con rilascio di tromboplastina che andrà ad attivare il F VII. Figura 1: schema della coagulazione plasmatica Entrambe le vie si congiungono nella via comune con l attivazione del F X che, con l aiuto dei F V e F VIII, attivano il F II. Dopo di che si prosegue con la formazione di fibrina dal fibrinogeno Fibrinolisi Parte dall attivazione del plasminogeno che porta allo scioglimento della fibrina permettendo l apertura di vasi occlusi o impedendo la formazione di un trombo. Questa fase dell emostasi non viene approfondita ulteriormente poiché non è tema di questo lavoro di diploma. 1.2 VITAMINA K La vitamina K, come tutte le vitamine, deve essere assunta tramite la dieta. È una vitamina liposolubile distinguibile in due forme: vitamina K 1 : si trova nei vegetali verdi come spinaci o broccoli; vitamina K 2 : prodotti dalla flora intestinale. BIOCHIMICA E FISIOLOGIA È necessaria al fegato per produrre i fattori II, VII, IX e X della coagulazione. Questi fattori sono dei proenzimi di proteasi a serina che contengono acido carbossiglutammico contenente due gruppi carbossilici legati al carbonio dell acido glutammico. Questo legame è possibile con l intervento della vitamina K che permette alla carbossilasi di aggiungere un gruppo carbossilico all estremità glutammina del fattore. Il gruppo carbossilico permette poi il legame con ioni di calcio e alla tromboplastina. Il fattore viene cosi attivato. In assenza di vitamina K non è più possibile legare il calcio interferendo quindi con il normale funzionamento della coagulazione (in laboratorio troviamo un TP allungato). 5

6 CARENZA DI VITAMINA K La carenza di questa vitamina è rara nell adulto poiché anche se non fosse possibile assumerla con la dieta, la flora intestinale sarebbe in grado di produrla e sarebbe facilmente riassorbita nelle cellule. Una carenza acquisita può avvenire in seguito, per esempio, ad un prolungato trattamento con antibiotici. Essendo una vitamina liposolubile, in caso di malassorbimento dei grassi, si può avere una carenza di vitamina K. Anche epatopatie possono portare ad una carenza di vitamina K. Nei casi di epatopatie gravi e disturbi nella coagulazione l analisi dei fattori II, V e VII possono aiutare nel distinguere un problema epatico da un malassorbimento della vitamina stessa. 1.3 FATTORI DELLA COAGULAZIONE Via estrinseca/via comune Tempo di protrombina In laboratorio viene eseguito di routine il TP per valutare la via estrinseca nelle seguenti situazioni: nella fase preoperatoria; per valutare la funzionalità epatica; sospetta carenza di vitamina K; per monitorare una terapia anticoagulante con inibitori della vitamina K; nel caso di un deficit congenito o acquisito dei fattori II, V, VII e X. L organizzazione mondiale della sanità (OMS) nel 1983 ha deciso di introdurre il valore di INR per confrontare i risultati dei pazienti con terapia anticoagulante monitorandone l andamento. Viene calcolata la ratio del tempo di protrombina (PR) dividendo il TP del plasma del paziente con il TP di un pool di plasma normali. Perché le tromboplastine utilizzate per l analisi del TP sono diverse nei vari laboratori si è deciso di creare International Sensitivity Index (ISI) che permette di confrontare la tromboplastina del laboratorio con quella standard di riferimento proposta dalla OMS. L ISI della tromboplastina ricombinante umana è molto vicino a 1. Ogni laboratorio per determinare l ISI deve comparare il suo lotto di reagente con un master lot calibrato in base alla tromboplastina di riferimento. Si otterrà quindi un valore di INR tenendo conto del lotto e del metodo. Tempi di protrombina prolungati possono essere causati da: terapie anticoagulanti con antagonisti della vitamina K; deficit di vitamina K; epatopatie. L analisi dei fattori II, V, VII e X permette di comprendere se il risultato del TP patologico è causato da un problema epatico, da un problema legato alla vitamina K (terapia anticoagulante, malnutrizione, malassorbimento, ) o una combinazione dei due fattori. Infatti, la sintesi di questi fattori è legata ad una produzione epatica, da un lato, e dalla presenza di vitamina K dall altro (fattori II, VII e X). Sono presenti in grande quantità nel plasma in forma inattiva. 6

7 definizione Tabella 1: caratteristiche principali dei fattori della via estrinseca F II F V F VII F X proenzima protrombina glicoproteina glicoproteina proenzima forma attiva FIIa trombina FVa FVIIa FXa coagulazione plasmatica Via comune Via comune Via estrinseca Via comune cromosoma peso molecolare Da Da Da Da emivita 57 ore 13 ore 3 5 ore 43 ore prodotto fegato fegato trombociti fegato fegato vitamina K dipendente dipendente dipendente Fattore II (F II) La protrombina è un proenzima, dipendente dalla vitamina K e viene prodotta dal fegato. Una sua diminuzione porta ad un aumentato rischio di sanguinamento. DIMINUZIONE Una carenza congenita isolata della protrombina è molto rara con una prevalenza di 1: Le cause di carenza acquisita sono epatopatie o carenza di vitamina K (anche nei casi di terapie anticoagulanti con antagonisti della vitamina K). AUMENTO Un aumento della concentrazione della protrombina può essere un indicatore di rischio per tromboembolie venose evidenziata in studi e osservazioni cliniche qui di seguito riportate: in situazioni di aumento dell emostasi primaria (es. dopo operazioni) o dopo emorragia; nelle iperlipidemie di tipo IIa, IIb e V secondo la classificazione di Fredrickson; nei casi di provette contenenti coaguli; nei casi di pazienti con la variante della protrombina G>A che porta ad un maggior rischio di trombosi familiare. Questa mutazione si trova in una regione che regola l espressione del gene che causa un aumentata produzione della protrombina. La prevalenza nella popolazione caucasica è del 2 4% Fattore V (F V) Glicoproteina non dipendente dalla vitamina K sintetizzata nel fegato ed in parte nei trombociti. DIMINUZIONE Una carenza congenita è molto rara, mentre una carenza acquisita è più frequente. La carenza congenita è molto rara in forma omozigote, mentre nella forma eterozigote è più frequente La diminuzione del F V possiamo trovarla nelle epatopatie e quando viene consumato massicciamente come nella coagulazione intravasale disseminata (DIC). AUMENTO L aumento della concentrazione del F V si trova in varie situazioni cliniche: dopo operazioni chirurgiche; 7

8 nelle coagulopatie, esclusivamente nella fase iniziale; come artefatto nei prelievi in cui viene attivata involontariamente la coagulazione. Un anomalia importante del F V è la mutazione del fattore V Leiden che è causata per il 95% dei casi da una mutazione puntiforme 1691 G>A nell esone 10 (1q21 25) che sostituisce l arginina con la glutammina. Questa mutazione autosomica dominante impedisce alla proteina C di inattivare il F V poiché non riesce a riconoscere la glutammina. Questa mutazione aumenta il rischio di trombosi giovanile familiare Fattore VII (F VII) Proenzima dipendente dalla vitamina K sintetizzato nel fegato. DIMINUZIONE Una carenza congenita in forma omozigote è rara, mentre in forma eterozigote risulta più frequente. Una carenza acquisita e spesso associata con la diminuzione di altri fattori a causa della carenza di vitamina K, oppure problemi epatici oppure ancora ad una terapia con antagonisti della vitamina K. AUMENTO Un aumento del F VII non ha probabilmente significato come fattore di rischio. Vi sono però alcuni studi che mostrerebbero una leggera correlazione con lo sviluppo di malattie cardio vascolari Fattore X (F X) Proenzima dipendente dalla vitamina K sintetizzato dal fegato. DIMINUZIONE Una carenza congenita nella forma omozigote ha una prevalenza di 1: , mentre nella forma eterozigote è la causa più frequente di TP patologici (tenendo conto che rimane comunque rara). AUMENTO Aumenti del F X non sono fattori di rischio di rilevanza clinica Via intrinseca Tempo di tromboplastina parziale attivata Questo test serve per valutare la via intrinseca della coagulazione e viene eseguito quando: si ricerca in casi di problemi di coagulazione congeniti o acquisiti (esempio per l emofilia A o B); valutazione della via intrinseca; si sospetta la presenza di inibitori patologici; monitoraggio della terapia con eparina. Tempi di aptt allungati possono indicare: pericolo di emorragia; pericolo di trombosi. 8

9 Fattore VIII (F VIII) F VIII è una proteina della fase acuta prodotta dal fegato ed in parte dalle cellule endoteliali (possiamo trovarlo anche in altri organi come ad esempio nella milza). È codificato sul cromosoma X e la sua sequenza primaria per il 40% è simile a quella del F V. Per questo motivo entrambi i fattori hanno la stessa funzione di accelerare la cascata enzimatica. Nel sangue il F VIII trasporta il fattore von Willebrand (vwf). Se manca il vwf l emivita del F VIII diminuisce da 10 a 2 ore. Con l attivazione del F VIII il vwf si stacca. In questo modo il sito di legame sul FVIII è libero di legarsi con i fosfolipidi. Viene poi eliminato legato al recettore della lipoproteina a basso peso molecolare (LRP) dalla circolazione sanguigna. La sua struttura può essere tagliata dalla proteina C, dalla plasmina o dai neutrofili. Il F VIII ha diverse caratteristiche: precipita a freddo con la conseguente separazione dal vwf; è labile al calore; aumenta in caso di somministrazione di adrenalina. DIMINUZIONE Diminuzioni del F VIII le possiamo riscontrare: nella coagulazione intravasale disseminata (consumo del fattore); dopo emorragie gravi; dopo trasfusioni massicce; emofilia A. Mutazioni del gene che codifica per il F VIII sul cromosoma X può portare all emofilia A. L emofilia A è una malattia legata al cromosoma X recessiva che porta ad una diminuzione dell attività del F VIII. Poiché la mutazione si trova sul cromosoma X di regola gli uomini sono ammalati mentre le donne ne sono portatrici. A seconda della diminuzione dell attività del fattore possiamo distinguere tre gradi di gravità: emofilia leggera: attività del F VIII >5 40%; media gravità: attività del F VIII 1 5%; grave: attività del FVIII <1%. Questa mutazione porta come conseguenza un rischio maggiore di emorragia. AUMENTO Aumento del F VIII si trova nei seguenti casi: prelievi in cui è attiva la coagulazione involontariamente; in varie malattie acute o croniche in quanto proteina della fase acuta; nei danni epatici (come le transaminasi); nelle coagulopatie; nelle patologie dei vasi sanguigni (es. nel diabete mellito). Barthels, M. (s.d.). Das Gerinnungskompendium (2. Auflage). Thieme, Labormedizin Diagnostiche Hämatologie Universitätsspital Basel. (s.d.). Die Hämostase einfach und verständlich. Marie Christine Trzeciak, M. H. D. (s.d.). L'hémostase en question. Biomériuex dispense ematologia TAB Dr. Scali OBIETTIVO Introduzione dei fattori II, V, VII e X della coagulazione all Ospedale Regionale di Lugano per meglio esplorare la causa di un tempo di protrombina spontaneo patologico e del fattore VIII per meglio supportare la diagnostica di emofilia A. 9

10 2. MATERIALI E METODI 2.1 PREANALITICA Per tutte le analisi di coagulazione viene scelto di usare come anticoagulante il citrato in quanto, chelando i cationi bivalenti come il calcio, blocca l attivazione della coagulazione. Per questo lavoro sono stati raccolti 40 campioni di pazienti presso l EOC i cui medici avevano richiesto l analisi di uno di questi fattori. Da questi pazienti è stata fatta un aliquota di plasma citrato centrifugato e conservato a 30 C (stabilità a temperatura ambiente 4 ore, 20 C 4 settimane, 70 C 6 mesi). In seguito sono stati richiesti altri 20 campioni da un laboratorio di Zurigo. Anch essi sono stati conservati in aliquote di plasma citrato a 80 C. Per la validazione delle analisi di questi fattori sono stati presi in considerazioni i campioni provenienti dal laboratorio di emostasi dell ospedale universitario di Zurigo perché la conservazione, il tempo intercorso tra il congelamento e l analisi è uguale per tutti i campioni. L analisi viene eseguita su apparecchi diversi ma che usano gli stessi reagenti utilizzati all ORL. 2.2 ANALITICA Tempo di protrombina Al plasma citrato del paziente viene aggiungo il fattore III (tromboplastina tissutale) e ioni calcio. L apparecchio misura, in secondi, il tempo impiegato alla formazione del coagulo di fibrina. Il risultato ottenuto viene convertito in percentuale assieme al valore di INR (rapporto internazionale normalizzato) Metodo per la determinazione dei fattori II, V, VII e X REAGENTI (ditta Siemens) Plasma carente del FII/V/VII/X Dade Innovin Dade Tampone Veronal di Owren Plasma umano standard Plasma di controllo N Plasma di controllo P METODO L analisi dei quattro fattori II, V, VII e X viene eseguita con lo stesso metodo del TP. Viene eseguita una misurazione del TP del plasma citrato del paziente combinato con del plasma carente del fattore di cui vogliamo conoscere l attività. Viene aggiunta della tromboplastina (Dade Innovin ), incubato a 37 C e poi viene aggiunto del cloruro di calcio. A questo momento l apparecchio misura il tempo necessario alla formazione del coagulo tramite un coagulometro a principio di misura ottico. Il risultato ottenuto viene estrapolato da una curva di calibrazione eseguita con diluizioni di plasma umano standard. L apparecchio impiegato per analizzare i fattori in modo automatico è il CS2100i della ditta Sysmex. Nel caso in cui il paziente avesse una carenza per il fattore in analisi otterremo un TP allungato poiché il plasma carente non riesce a compensare quello del paziente. 10

11 2.2.3 Tempo di tromboplastina parziale attivata Il plasma citrato del paziente viene incubato a 37 C con un reattivo Actin FS e viene poi aggiunto del cloruro di calcio. Dopo di che si misura il tempo necessario alla formazione del coagulo Metodo per la determinazione del F VIII REAGENTI (ditta Siemens) Plasma carente del FX Dade Actin FS Soluzione di cloruro di calcio Dade Tampone Veronal di Owren Plasma umano standard Plasma di controllo N Plasma di controllo P METODO In questa analisi viene aggiunto al plasma citrato del paziente del plasma carente per il FVIII, del reattivo Actin FS, viene poi incubato a 37 C e poi si aggiunge cloruro di calcio. A questo momento viene misurato il tempo impiegato dal plasma per formare il coagulo. L apparecchio impiegato per analizzare i fattori in modo automatico è il CS2100i della ditta Sysmex. 11

12 3. RISULTATI Nelle tabelle 2 e 3 sono stati riportati i valori della ditta per il controllo di qualità normale, ossia con risultati che rientrano nei valori di riferimento, e quelli per il controllo di qualità patologico, ossia con valori inferiori al 70%. Tabella 2: valori della ditta per il controllo di qualità normale F II F V F VII F VIII F X range % target % Tabella 3: valori della ditta per il controllo di qualità patologico F II F V F VII F VIII F X range % target % Come prima analisi dei risultati ottenuti per i controlli di qualità è stato il calcolo del coefficiente di variazione (CV) in percentuale. Il CV ci da l informazione della precisione dell analisi in esecuzione, ossia la riproducibilità di un risultato utilizzando lo stesso campione misurato con gli stessi reagenti sullo stesso apparecchio. Sono stati misurati i controlli di qualità normale e patologico varie volte di fila lo stesso giorno ed in giorni diversi. Normalmente nelle analisi di chimica clinica si vuole ottenere un CV attorno al 10%. Il CV viene calcolato dividendo la deviazione standard con la media e moltiplicando il risultato per cento. CV=(DS/media).100 La deviazione standard (DS) è calcolata come la radice quadrata della varianza, e ci dice quale è la dispersione dei valori rispetto alla media. Per tutti i cinque i fattori è stata calcolata l accuratezza tramite la divisione della media con il valore dichiarato, il tutto moltiplicato per cento. 3.1 CONTROLLI DI QUALITÀ INTRASERIE Nelle seguenti tabelle sono riportati i valori misurati del controllo di qualità normale e quelli per il controllo di qualità patologico intraserie eseguiti nello stesso giorno per dieci misurazioni consecutive per tutti i cinque fattori. Tabella 4: valori ottenuti per il controllo normale F II F V F VII F VIII F X media DS CV % accuratezza

13 Tabella 5: valori ottenuti per il controllo patologico F II F V F VII F VIII F X media DS CV % accuratezza CONTROLLI DI QUALITÀ INTERSERIE In queste due tabelle sono riportati i valori misurati per il controllo di qualità normale e per quello patologico analizzati in giorni diversi con dieci misurazioni per i fattori II, V e VII. Per il fattore VIII sono state eseguite nove misurazioni per il controllo normale e otto per il controllo patologico in giorni diversi. Per il fattore X sono stati misurati sette volte sia il controllo normale che quello patologico in giorni diversi. Tabella 6: valori ottenuti per il controllo normale F II F V F VII F VIII F X media DS CV accuratezza Tabella 7: valori ottenuti per il controllo patologico F II F V F VII F VIII F X media DS CV % accuratezza CONTROLLO DI QUALITÀ ESTERNO Per avere ulteriori campioni sono stati misurati anche due controlli di qualità esterni dai Ringversuch di Instand ottenendo i risultati riportati nelle tabelle 8 e 9. Tabella 8: valori del controllo esterno CQ 61 target range risultato ORL F II F V F VII F VIII F X

14 Tabella 9: valori del controllo esterno CQ 62 target range risultato ORL F II F V F VII F VIII F X CAMPIONI ANALIZZATI I venti campioni provenienti dal laboratorio di Zurigo sono stati conservati a 80 C per poi essere analizzati in parallelo lo stesso giorno. I dati ottenuti per tutti e cinque i fattori sono stati analizzati per vedere se la distribuzione fosse normale o meno con il programma statistico Analyse it. La curva di Gauss viene utilizzata in statistica per valutare la distribuzione normale dei dati. Dalla curva Gaussiana a campana sappiamo che il 68.3% dei dati si troverà nell intervallo media ± DS, il 95,5% nell intervallo media ± 2 DS e il 99,7 % dei dati tra l intervallo media ± 3 DS. Nei grafici riportati possiamo notare che i dati ottenuti per i cinque fattori non sono perfettamente distribuiti come la curva di Gauss e la causa è da implicare allo scarso numero di campioni analizzati. Figura 2: distribuzione dei dati del F II rispetto alla curva di Gauss Figura 3: distribuzione dei dati del F V rispetto alla curva di Gauss 14

15 Figura 4: distribuzione dei dati del F VII rispetto alla curva di Gauss Figura 5: distribuzione dei dati del F VIII rispetto alla curva di Gauss Figura 6: distribuzione dei dati del F X rispetto alla curva di Gauss La prima analisi che è stata scelta è quella di Altman Bland (AB). Questa analisi si basa non sui dati originali ma sulle loro differenze e ci da un informazione su una possibile presenza di un bias (scostamento) tra i dati misurati nel laboratorio di Zurigo rispetto all ORL. Ci indica anche il suo intervallo di confidenza del 95% dello scostamento rispetto alla media (vedi tabella 10). Sono qui di seguito riportati i due grafici del plot e del difference plot per ogni fattore che viene fatto da Analyze it.. Tabella 10: valore dello scostamento della media dato da Altman Bland F II F V F VII F VIII F X bias % CI

16 Nel grafico del plot sull ascissa troviamo i dati misurati nel laboratorio di Zurigo, mentre sull asse dell ordinata troviamo i dati misurati all ORL. Sono distribuiti attorno ad una retta bisettrice (identity) che mostra come dovrebbe essere la distribuzione dei dati in un confronto tra due laboratori i cui apparecchi misurano uguale. Assieme a questi grafici ci sono quelli che mostrano la differenza di misurazione tra i due laboratori rispetto alla media per ogni fattore. Figura 7: plot di AB per il F II Figura 8: difference plot di AB per il F II Figura 9: plot di AB per il F V Figura 10: difference plot di AB per il F V Figura 11: plot di AB per il F VII Figura 12: difference plot di AB per il F VII 16

17 Figura 13: plot di AB per il F VIII Figura 14: difference plot di AB per il F VIII Figura 15: plot di AB per il F X Figura 16: difference plot di AB per il F X Per tutti e cinque i fattori il metodo di BA ci mostra che mediamente il laboratorio ORL ottiene risultati più bassi rispetto al laboratorio di Zurigo. Bisogna anche dire però che l intervallo di confidenza contiene sempre lo zero ed è quindi accetta l ipotesi che i due apparecchi non hanno una differenza significativa nella misurazione. La seconda analisi scelta è quella di Passing Bablok (PB). Questo tipo di regressione non prende a confronto i dati ottenuti ma assegna ad ogni valore un rango. Per non escludere che i nostri dati rispetto a quelli del laboratorio di Zurigo siano uguali poniamo come ipotesi iniziale che l intercetta sia uguale a 0 e la pendenza sia uguale a 1 ottenendo una retta di regressione x=y. Per valutare se le ipotesi sono confermate si devono guardare gli intervalli di confidenza al 95% che ci danno tutte le possibili rette per i dati in analisi. Gli intervalli per l intercetta devono contenere lo 0 e quelli per la pendenza 1. Nel grafico della Passing Bablok possiamo vedere sull asse dell ascissa i valori ottenuti al laboratorio di Zurigo, mentre sull asse dell ordinata si trovano quelli misurati all ORL. La bisettrice (identity) mostra la retta nel caso in cui i due apparecchi misurano perfettamente nello stesso modo. La retta di colore blu è quella dei dati ottenuti che assieme agli intervalli di confidenza (rette tratteggiate) possono essere comparate con la bisettrice. Tabella 11: valori ottenuti con la PB per il FII FII INTERCETTA PENDENZA PB 8.97 ( ) 0.91 ( ) 17

18 Figura 17: grafico con PB per il F II Tabella 12: valori ottenuti con la PB per il FV FV INTERCETTA PENDENZA PB 12.82( ) 1.07( ) Figura 18: grafico con PB per il F V Tabella 13: valori ottenuti con la PB per il FVII FVII INTERCETTA PENDENZA PB 0.72 ( ) 0.94( ) Figura 19: grafico con la PB per il F VII 18

19 Tabella 14: valori ottenuti con la PB per il F VIII F VIII INTERCETTA PENDENZA PB 2.49 ( ) 0.86 ( ) Figura 20: grafico con la PB per il F VIII Tabella 15: valori ottenuti con la PB per il FX FX INTERCETTA PENDENZA PB 0.82 ( ) 0.83 ( ) Figura 21: grafico con la PB per il F X Secondo l analisi statistica di PB per tutti e cinque i fattori non possiamo quindi escludere che i risultati ottenuti dall apparecchio dell ORL confrontati con quelli ottenuti nel laboratorio di Zurigo siano uguali. Per quanto riguarda l analisi statistica il metodo utilizzato non è l unica possibilità in quanto i dati possono essere analizzati in altri modi. In un altra statisica utile è quella dei box plot, anche chiamati grafico a scatola. Questo tipo di grafici è utile per verificare la presenza di outliers nei dati. Tramite questa analisi viene messa in evidenza degli outliers per il F II e il F VIII. Figura 22: box plot per il F II 19

20 Per il F II; V; VII non ci sono outliers. Figura 23: box plot per il F VIII Figura 24: box plot per il F V Figura 25: box plot per il F VII Figura 26: box plot per il F X 20

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