CITOGENETICA e CITOGENOMICA

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1 CORSO INTEGRATO DI GENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE GENETICA A.A.2015/2016 Prof Alberto Turco Ma Lezioni 13 e 14 CITOGENETICA e CITOGENOMICA

2 Candy Chromosomes

3 Un po di storia. 1956: IDENTIFICAZIONE DEL NUMERO CORRETTO DI CROMOSOMI NELL UOMO (46 non 48) PS Nel 1953 (tre anni prima) identificata la struttura molecolare a doppia elica del DNA.

4 Avvolgimento e condensazione cromatina 50:1 5000:1

5 PREPARAZIONE CARIOTIPO STANDARD (Citogenetica convenzionale) -Cc somatiche nucleate (es.linfociti sangue periferico, fibroblasti) -Mitogeno (PHA fitoemoagglutinina) -Colchicina (blocco in metafase - inibizione del fuso) -Soluzione ipotonica -Fissazione -Colorazione (bandeggio)

6 Anatomia di un cromosoma umano Regione subtelomerica Regione subtelomerica

7 Cariotipo umano

8 COLORAZIONI E BANDEGGIO CROMOSOMICO REGIONI SUBTELOMERICHE = RICCHE DI GENI. ANOMALIE DI QUESTE REGIONI (DELEZIONI, RIARRANGIAMENTI) SONO ASSOCIATE A FENOTIPI PATOLOGICI (ES.RITARDO MENTALE)

9 Cariotipo:esempi di colorazione G (Giemsa) a 550 bande Esempio di referto di analisi citogenetica standard per infertilità (Thompson & Thompson, 2016)

10 «Bandeggio Cromosomico» (standard) Braccio Regione Banda Sottobanda Sotto-sottobanda Es 12q24.32

11 Morfologia/anatomia dei cromosomi umani (dimensioni e posizione centromero)

12 CARIOTIPO STANDARD UMANO (G-banding pattern) CROMOSOMI ACROCENTRICI Satelliti = geni in tandem per rrna

13 Cariotipo (assetto cromosomico) FEMMINILE normale 13

14 Cariotipo (assetto cromosomico) MASCHILE normale 14

15 ALTA RISOLUZIONE CROMOSOMICA (CROMOSOMI ALLUNGATI PROMETAPHASE BANDING)

16 Genoma paradossale - la complessità biologica non correla con il numero di cromosomi. Chi offre di più?... Cane 78. Germano reale 80. Pesce rosso 94. Equiseto (coda di cavallo) 216. Lysandra atlantica (farfalla) 250. Ophioglossum (felce) anche >1400! Il più elevato numero conosciuto in natura.

17 EVOLUZIONE DELLA CITOGENETICA La Citogenetica Classica (convenzionale, standard) permette di identificare riarrangiamenti cromosomici fino a circa 5-10 Mb La Citogenetica Molecolare (Citogenomica) permette di identificare riarrangiamenti fino a poche Kb

18 Livelli di risoluzione delle analisi cromosomiche e genomiche (Thompson & Thompson, Genetics in Medicine, 8th Ed, 2016)

19 CITOGENETICA MOLECOLARE (Citogenomica, «chromonomics») Livello di risoluzione< 4-5Mb (4-5 milioni di basi) F.I.S.H. (Fluorescent In Situ Hybridization) Array CGH (acgh) (array-based Comparative Genomic Hybridization)

20 FISH Anni 90, nasce la citogenetica molecolare Marcatura fluorescente (sonde centromeriche locus-specifiche, painting) Elevata risoluzione rispetto a citogen.tradizionale Rapidità Nuclei in interfase Marcature multiple Elaborazione computerizzata immagini

21 F.I.S.H.

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23 Multicolor FISH (Painting) Cariotipo di una cellula tumorale

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25 S.da microdelezione: es. S.Wolf - Hirschhorn

26 NB In alcuni casi la delezione nella s.di Wolf in 4p è talmente estesa da essere visibile al cariotipo standard

27 Microarray CGH (vd oltre) (WHS = Wolf Hirnschorn Syndrome)

28 Williams syndrome

29 1/10.000, ipercalcemia infantile, facies caratteristica (ponte nasale, narici anteverse, guance paffute, bocca larga, labbra carnose. Anomalie dentali.) Vomito frequente. Insonnia. Cocktail party manner (bambini): socialità, logorrea, amicalità, iperattività.. Iperacusia. Ritardo mentale e disabilità intellettiva che impedisce indipendenza. SVAS (stenosi sopravalvolare aortica). Stenosi periferiche polmonari. Bassa statura

30 La microdelezione in 7q coinvolge circa 20 geni (CGS =Contiguous Gene Syndrome) compreso, sempre, ii gene per l elastina (espressione nella parete aortica)

31 Sindromi da microdelezione (CGS*) * = Contiguous Gene Syndrome (Jorde et al., 2010)

32 FISH interfasica multicolor in DIAGNOSI GENETICA PREIMPIANTO (PGD) P.G.D.

33 Ibridazione Genomica Comparativa (convenzionale) Ricerca di (micromicro) delezioni e/o duplicazioni..

34 CGH convenzionale e microarray (arraycgh: acgh) Screening dell intero genoma Cianine, sostanze fluorescenti

35 acgh: UTILITA E INDICAZIONI Identificazione di copy number differences tra un DNA test e un DNA di riferimento: -Monosomie parziali (microdelezioni) -Trisomie parziali (microduplicazioni o amplificazioni) -Valutazione di pazienti con ritardo mentale/disabilità intellettiva e/o malformazioni congenite/dismorfismi non ben inquadrati dal punto di vista diagnostico -Valutazione di riarrangiamenti genetici nei tumori

36 o CMA (Chromosomal MicroArray)

37 Le dimensioni di un microarray (DNA chip)

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39 acgh: DNA chip

40 Microchip di DNA (Microarray) Permettono in tempi brevi e a bassi costi l analisi dell intero genoma Possono contenere fino a 1 milione di «sonde» (brevi sequenze di DNA) 40

41 acgh: alcuni esempi applicativi Identificazione di una microdelezione nel cromosoma 11 del(11)(q13.2-q13.4) mediante acgh

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