Key words: Peripheral neuroglia; Dorsal root ganglia; Laminin; Fibronectin; Neuron-glia interactions.

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1 Rend. Fis. Acc. Lincei s. 9, v. 10: (1999) Istologia e citologia. Il microambiente perineuronale dei gangli spinali di coniglio contiene laminina e fibronectina. Nota di Maria Ledda, Patrizia Procacci e Ennio Pannese, presentata (*) dal Corrisp. E. Pannese. Abstract. The perineuronal microenvironment of rabbit spinal ganglia contains laminin and fibronectin. In the spinal ganglia of the rat and guinea pig, the perineuronal microenvironment contains laminin and fibronectin, two glycoproteins reported to promote the growth of axonal processes from sensory ganglion neurons. The present study shows that laminin and fibronectin are also present in the perineuronal microenvironment of rabbit spinal ganglia, where they are localized close to the satellite cells and also in the gaps of the satellite cell sheath, i.e. in close apposition to the nerve cell body surface. Since the slender projections emerging from the perikaryon of spinal ganglion neurons are abundant on the neuronal surface covered by satellite cells and are absent from the portions of the neuronal surface in direct contact with the extracellular matrix, the result of the present study suggests that in the spinal ganglia of adult rabbits laminin and fibronectin are not in themselves able to promote the outgrowth of the projections emerging from the neuronal perikaryon. The result of the present study also suggests that the outgrowth of axons and the outgrowth of perikaryal projections are under the control of different mechanisms. Key words: Peripheral neuroglia; Dorsal root ganglia; Laminin; Fibronectin; Neuron-glia interactions. Riassunto. Ilmicroambiente perineuronale dei gangli spinali di ratto e di cavia contiene laminina e fibronectina, due glicoproteine che sono in grado di favorire l accrescimento degli assoni dei neuroni dei gangli sensitivi. Le presenti ricerche dimostrano che laminina e fibronectina sono presenti anche nel microambiente perineuronale dei gangli spinali di coniglio e che sono localizzate non soltanto a livello delle cellule satelliti, ma anche in corrispondenza delle interruzioni dell involucro formato da tali cellule; in quest ultima sede tali glicoproteine si trovano a contatto diretto con la superficie del corpo dei neuroni sensitivi. Poiché lepropaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali sono numerose nelle porzioni di superficie del corpo del neurone che si trovano in rapporto con le cellule satelliti, mentre sono assenti nelle porzioni di superficie che sono a diretto contatto con la matrice extracellulare, i risultati della presente ricerca fanno ritenere che laminina e fibronectina non esercitino nessuna influenza diretta sullo sviluppo delle suddette propaggini. Tali risultati suggeriscono anche che l accrescimento degli assoni e quello delle propaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali siano controllati da meccanismi differenti. Introduzione Nel corso di precedenti ricerche abbiamo dimostrato che lo sviluppo delle sottili propaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali è influenzato dal microambiente circostante (Pannese et al., 1994, 1995). Quest ultimo è costituito dalle cellule satelliti e dalla matrice extracellulare immediatamente adiacente ad esse. Nella matrice extracellulare perineuronale dei gangli spinali di ratto e di cavia è stata dimostrata la presenza di laminina e fibronectina (Bannerman et al., 1986; Schiff e Rosenbluth, 1986; Warburton e Santer, 1997). In considerazione del ruolo che queste due glicoproteine svolgono nell accrescimento dell assone dei neuroni dei gangli sensitivi (Baron-Van (*) Nella seduta del 17 giugno 1999.

2 102 m. ledda et al. Evercooren et al., 1982; Carbonetto et al., 1983; Manthorpe et al., 1983; Rogers et al., 1983; Hammarback et al., 1985; Madison et al., 1985; Unsicker et al., 1985; Gundersen, 1987; Orr e Smith, 1988; Kuecherer-Ehret et al., 1990; Itoh et al., 1991; Delrée et al., 1993; Tomaselli et al., 1993; Tonge et al., 1997), una ragionevole ipotesi è quella che l influenza esercitata dal microambiente perineuronale sullo sviluppo delle propaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali sia da attribuire proprio alla presenza di tali molecole nel suddetto microambiente. Tuttavia, nei gangli spinali di coniglio, nei quali l involucro di cellule satelliti presenta a volte interruzioni che lasciano la superficie del corpo del neurone direttamente in rapporto con la matrice extracellulare (Pannese, 1981; Pannese et al., 1996), le propaggini sono numerose nelle porzioni di superficie del corpo del neurone che si trovano in rapporto con le cellule satelliti, mentre sono assenti nelle porzioni di superficie che sono a diretto contatto con la matrice extracellulare (Ledda et al., 1998). Questa osservazione potrebbe essere compatibile con l ipotesi che laminina e fibronectina favoriscono lo sviluppo delle propaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali se nel coniglio la matrice extracellulare dei gangli spinali fosse priva di tali glicoproteine sull intera superficie del corpo dei neuroni o almeno in corrispondenza delle aree prive di cellule satelliti. La stessa osservazione risulterebbe invece incompatibile con la suddetta ipotesi nel caso in cui tali glicoproteine fossero presenti nei gangli spinali di coniglio. Per chiarire se laminina e fibronectina svolgono o non un ruolo nello sviluppo delle propaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali, abbiamo quindi cercato di stabilire se tali glicoproteine sono presenti nella matrice extracellulare perineuronale dei gangli spinali di coniglio. Materiale e metodi Le ricerche furono condotte su 4 conigli (Oryctolagus cuniculus) di entrambi i sessi (2 animali giovani adulti di 12 e 15 mesi e 2 animali vecchi di 69 e 70 mesi). Immunocitochimica al microscopio ottico. Due conigli (1 giovane adulto e 1 vecchio), anestetizzati con Nembutal, furono perfusi con una soluzione salina in tampone fosfato (PBS 0,1 M, ph 7,4). I gangli spinali toracici furono isolati rapidamente, fissati per 4haT ambiente in formalina neutra tamponata (10%) e quindi inclusi in paraffina. Sezioni di 5 mm furono sparaffinate in xilolo e reidratate in soluzioni di metanolo a concentrazione decrescente; nel corso della reidratazione, le sezioni furono trattate con H 2 O 2 (5%) in metanolo per inibire l attività della perossidasi endogena. Nelle sezioni da incubare con l antisiero antifibronectina, gli antigeni furono smascherati utilizzando un forno a microonde (Panasonic, modello NN 6371 WM), seguendo le indicazioni di Cattoretti et al. (1993) e di Gown et al. (1993). Per prevenire la formazione di legami aspecifici, tutte le sezioni, sia quelle da incubare con l antisiero antilaminina, sia quelle da incubare con l antisiero antifibronectina (precedentemente trattate con il forno a microonde), furono incubate per 20 con albumina serica bovina (BSA) al 5% in TBS. Le sezioni furono poi incubate per 12 h a 4 C con i rispettivi antisieri primari (antisiero

3 il microambiente perineuronale dei gangli spinali di coniglio ::: 103 monoclonale antilaminina, prodotto in topo, Boehringer Ingelheim, oppure antisiero monoclonale antifibronectina, prodotto in topo, Boehringer Mannheim), entrambi diluiti 1:50 in PBS contenente BSA (5%) e sodio azide (0,05%). Le sezioni furono quindi incubate per 1 h a T ambiente con un primo antisiero secondario coniugato con perossidasi (rabbit antimouse IgG, Dako, diluito 1:50 in TBS) e successivamente con un secondo antisiero secondario coniugato con perossidasi (swine antirabbit IgG, Dako, diluito 1:50 in TBS). L attività della perossidasi fu messa in evidenza usando come cromogeno il tetracloruro di 3,3 diaminobenzidina (DAB). Le sezioni furono infine contrastate con ematossilina e montate con Eukitt (Agar Scientific Ltd.). Le sezioni di controllo furono incubate seguendo il medesimo protocollo, ma omettendo l antisiero primario. Immunocitochimica al microscopio elettronico. Due conigli (1 giovane adulto e1vec- chio), anestetizzati con Nembutal, furono perfusi con PBS. I gangli spinali toracici furono isolati rapidamente e fissati per 30 a T ambiente in una soluzione di paraformaldeide (4%) e glutaraldeide (0,075%) in tampone fosfato (PB 0,1 M, ph 7,4). Dopo un lavaggio di 2 h in PBS, i gangli furono inclusi in agar e tagliati in sezioni di mm per mezzo di un vibratomo. Le sezioni furono incubate con H 2 O 2 (3%) in PBS per inibire l attività della perossidasi endogena, lavate in PBS e quindi incubate per 12 ha4 Cinuna soluzione contenente BSA (8%), sodio azide (0,01%) e Triton X100 (0,05%) in PBS allo scopo di prevenire la formazione di legami aspecifici e di facilitare la penetrazione degli antisieri. Le sezioni furono successivamente incubate per 12 h a 4 C con i medesimi antisieri usati per la microscopia ottica (antilaminina o antifibronectina), entrambi diluiti 1:50 in PBS contenente BSA (5%) e sodio azide (0,05%); dopo un lavaggio con PBS contenente BSA (1%), le sezioni furono incubate per 12 ha4 C con i medesimi antisieri secondari usati per la microscopia ottica, diluiti 1:30 in PBS contenente BSA (5%) e sodio azide (0,05%). Infine, le sezioni furono lavate in PBS e poi in tampone TRIS HCl (0,1 M, ph 7,6). L attività della perossidasi endogena fu messa in evidenza usando come cromogeno la DAB. Le sezioni furono immerse per 1 h in glutaraldeide (2,5%) in PBS, lavate per 30 in PB, postfissate per 15 in una soluzione di OsO 4 (1%) in PB, disidratate in etanolo e finalmente incluse in una miscela di Epon-Araldite. Sezioni sottili ottenute da questo materiale furono esaminate al microscopio elettronico dopo essere state contrastate con acetato di uranile e piombo citrato. Le sezioni di controllo furono incubate seguendo il medesimo protocollo, ma usando antisieri primari antilaminina o antifibronectina preadsorbiti con un eccesso di laminina (DBA) o, rispettivamente, con un eccesso di fibronectina (DBA). Risultati Microscopia ottica. Sia nei preparati per la dimostrazione della laminina, sia in quelli per la dimostrazione della fibronectina la reazione risultò positiva lungo l intero contorno di ciascuna unità neuro-gliale (costituita dal corpo di un neurone sensitivo e dal suo involucro di cellule satelliti). La reazione per la laminina presentava l aspetto di una

4 104 m. ledda et al. Fig. 1. Immunoreattività per la laminina in un ganglio spinale di coniglio (microscopia elettronica). Il prodotto di reazione, che è presente in corrispondenza della superficie dell unità costituita dal neurone sensitivo (NE) e dal suo involucro di cellule satelliti, è associato con la lamina basale. n, nucleo di una cellula satellite. Coniglio di 12 mesi, linea ben definita, mentre quella per la fibronectina appariva più diffusa nel tessuto connettivo interstiziale circostante. Microscopia elettronica. Sia nei preparati per la laminina, sia in quelli per la fibronectina l intensità della reazione diminuiva progressivamente procedendo dalla periferia all interno del campione a causa della limitata penetrazione dei reagenti. Nonostante il danno causato alle strutture dai procedimenti tecnici impiegati, nei preparati era possibile identificare i corpi dei neuroni e delle cellule satelliti e riconoscere i loro rapporti reciproci. Nei preparati per la laminina il prodotto di reazione era presente lungo l intera superficie dell unità neuro-gliale, compresi i tratti corrispondenti alle interruzioni dell involucro di cellule satelliti. Il prodotto di reazione era sempre associato con la lamina basale (fig. 1). Anche nei preparati per la fibronectina il prodotto di reazione era evidente lungo l intera superficie dell unità neuro-gliale, compresi i tratti corrispondenti alle interruzioni dell involucro di cellule satelliti. Il prodotto di reazione presentava, però, una distribuzione più estesa di quello per la laminina e appariva associato non soltanto con la lamina basale, ma anche con il materiale amorfo situato esternamente a quest ultima (fig. 2). Sia nei preparati per la laminina, sia in quelli per la fibronectina il prodotto di reazione non fu mai osservato nei corpi dei neuroni, nelle cellule satelliti, negli spazi interposti fra le cellule satelliti adiacenti e nello spazio situato fra il corpo del neurone e il suo involucro gliale. L esame dei preparati positivi per la laminina e di quelli positivi

5 il microambiente perineuronale dei gangli spinali di coniglio ::: 105 Fig. 2. Immunoreattività per la fibronectina in un ganglio spinale di coniglio (microscopia elettronica). Il prodotto di reazione, che è presente in corrispondenza della superficie dell unità costituita dal neurone sensitivo (NE) e dal suo involucro di cellule satelliti (sc), è associato non soltanto con la lamina basale, ma anche con il materiale amorfo adiacente a quest ultima. Coniglio di 69 mesi, per la fibronectina non rivelò differenze fra conigli giovani adulti e conigli vecchi. Infine, nei preparati di controllo non fu mai osservata alcuna positività. Conclusioni I risultati delle presenti ricerche permettono di trarre le seguenti conclusioni. (1) La matrice extracellulare perineuronale dei gangli spinali di coniglio contiene laminina e fibronectina. (2) Tali glicoproteine sono presenti non soltanto a livello delle cellule satelliti, ma anche in corrispondenza delle interruzioni dell involucro formato da tali cellule, dove sono a contatto diretto con la superficie del corpo dei neuroni sensitivi. (3) Laminina e fibronectina non esercitano nessuna influenza diretta sullo sviluppo delle propaggini che emergono dal corpo dei neuroni dei gangli spinali di coniglio. Poiché numerose ricerche hanno dimostrato che tali glicoproteine favoriscono l accrescimento degli assoni dei neuroni dei gangli sensitivi (Baron-Van Evercooren et al., 1982; Carbonetto et al., 1983; Manthorpe et al., 1983; Rogers et al., 1983; Hammarback et al., 1985; Madison et al., 1985; Unsicker et al., 1985; Gundersen, 1987; Orr e Smith, 1988; Kuecherer-Ehret et al., 1990; Itoh et al., 1991; Delrée et al., 1993; Tomaselli et al., 1993; Tonge et al., 1997), è verosimile che negli stessi neuroni l accrescimento degli assoni e quello delle propaggini che emergono dal pericarion siano controllati da meccanismi differenti. Bibliografia Bannerman P. G. C., Mirsky R., Jessen K. R., Timpl R., Duance V. C., Light microscopic immunolocalization of laminin, type IV collagen, nidogen, heparan sulphate proteoglycan and fibronectin in the enteric nervous system of rat and guinea pig. J.Neurocytol., 15:

6 106 m. ledda et al. Baron-Van Evercooren A., Kleinman H. K., Ohno S., Marangos P., Schwartz J. P., Dubois-Dalcq M. E., Nerve growth factor, laminin, and fibronectin promote neurite growth in human fetal sensory ganglia cultures.j.neurosci. Res., 8: Carbonetto S., Gruver M. M., Turner D. C., Nerve fiber growth in culture on fibronectin, collagen, and glycosaminoglycan substrates. J.Neurosci., 3: Cattoretti G., Pileri S., Parravicini C., Becker M. H. G., Poggi S., Bifulco C., Key G., D Amato L., Sabattini E., Feudale E., Reynolds F., Gerdes J., Rilke F., Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. J.Pathol., 171: Delrée P., Ribbens C., Martin D., Rogister B., Lefebvre P. P., Rigo J. M., Leprince P., Schoenen J., Moonen G., Plasticity of developing and adult dorsal root ganglion neurons as revealed in vitro. Brain Res. Bull., 30: Gown A. M., de Wever N., Battifora H., Microwave-based antigenic unmasking. A revolutionary new technique for routine immunohistochemistry. Appl. Immunohistochem., 1: Gundersen R. W., Response of sensory neurites and growth cones to patterned substrata of laminin and fibrinectin in vitro. Dev. Biol., 121: Hammarback J. A., Palm S. L., Furcht L. T., Letourneau P. C., Guidance of neurite outgrowth by pathways of substratum-adsorbed laminin. J.Neurosci. Res., 13: Itoh T., Sobue G., Yasuda T., Mitsuma T., Takahashi A., Kimata K., Geometry of adult rat sensory neurons in culture; its modulation by laminin. Neurosci. Lett., 123: Kuecherer-Ehret A., Graeber M. B., Edgar D., Thoenen H., Kreutzberg G. W., Immunoelectron microscopic localization of laminin in normal and regenerating mouse sciatic nerve. J. Neurocytol., 19: Ledda M., Procacci P., Pannese E., Influenza delle cellule satelliti sullo sviluppo delle propaggini del corpo dei neuroni dei gangli spinali di coniglio. Rend. Fis. Acc. Lincei, s. 9, v. 9: Madison R., da Silva C. F., Dikkes P., Chiu T.-H., Sidman R. L., Increased rate of peripheral nerve regeneration using bioresorbable nerve guides and a laminin-containing gel. Exp. Neurol., 88: Manthorpe M., Engvall E., Ruoslahti E., Longo F. M., Davis G. E., Varon S., Laminin promotes neuritic regeneration from cultured peripheral and central neurons. J.Cell Biol., 97: Orr D. J., Smith R. A., Neuronal maintenance and neurite extension of adult mouse neurones in non-neuronal cell-reduced cultures is dependent on substratum coating. J.Cell Sci., 91: Pannese E., The Satellite Cells of the Sensory Ganglia. Advan. Anat. Embryol. Cell Biol., vol. 65, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York. Pannese E., Rigamonti L., Ledda M., Arcidiacono G., Perikaryal projections of spinal ganglion neurons: quantitative differences between membrane domains in contact with different microenvironments.j.anat., 185: Pannese E., Ledda M., Conte V., Rigamonti L., Procacci P., On the influence of the perineuronal microenvironment on the outgrowth of perikaryal projections of spinal ganglion neurons. J.Submicrosc. Cytol. Pathol., 27: Pannese E., Procacci P., Ledda M., Conte V., Age-related reduction of the satellite cell sheath around spinal ganglion neurons in the rabbit. J.Neurocytol., 25: Rogers S. L., Letourneau P. C., Palm S. L., McCarthy J., Furcht L. T., Neurite extension by peripheral and central nervous system neurons in response to substratum-bound fibronectin and laminin. Dev. Biol., 98: Schiff R., Rosenbluth J., Ultrastructural localization of laminin in rat sensory ganglia. J.Histochem. Cytochem., 34: Tomaselli K. J., Doherty P., Emmett C. J., Damsky C. H., Walsh F. S., Reichardt L. F., Expression of β1 integrins in sensory neurons of the dorsal root ganglion and their functions in neurite outgrowth on two laminin isoforms.j.neurosci., 13: Tonge D. A., Golding J. P., Edbladh M., Kroon M., Ekström P. E. R., Edström A., Effects of extracellular matrix components on axonal outgrowth from peripheral nerves of adult animals in vitro. Exp. Neurol., 146:

7 il microambiente perineuronale dei gangli spinali di coniglio ::: 107 Unsicker K., Skaper S. D., Davis G. E., Manthorpe M., Varon S., Comparison of the effects of laminin and the polyornithine-binding neurite promoting factor from RN22 Schwannoma cells on neurite regeneration from cultured newborn and adult rat dorsal root ganglion neurons. Dev. Brain Res., 17: Warburton A. L., Santer R. M., The hypogastric and thirteenth thoracic ganglia of the rat: effects of age on the neurons and their extracellular environment. J.Anat., 190: Pervenuta il 16 aprile 1999, in forma definitiva il 23 aprile Istituto di Istologia, Embriologia e Neurocitologia Università degli Studi di Milano Via L. Mangiagalli, Milano ennio.pannese@unimi.it