POSSIBILI PRODOTTI. - Anticorpi - Proteine di interesse farmaceutico - Vaccini edibili - Metaboliti secondari - Polimeri biodegradabili

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2 POSSIBILI PRODOTTI - Anticorpi - Proteine di interesse farmaceutico - Vaccini edibili - Metaboliti secondari - Polimeri biodegradabili

3 Produzione di proteine in pianta

4 Produzione di proteine in pianta L integrazione del DNA nelle piante è stabile; nei microrganismi può non essere stabile Le modificazioni post-traduzionali sono più simili a quelle che hanno luogo nelle cellule animali Il costo per la produzione in pianta è molto minore che per la produzione in cellule animali La produzione nei semi rende possibile il mantenimento della proteina per lunghi periodi di tempo

5 Produzione di proteine in pianta la purificazione delle proteine da tessuto vegetale è molto più problematica che non da cellule animali (presenza della parete, polifenoli interferenza con le tecniche di purificazione) E necessario che i livelli di espressione siano molto elevati per avere rese soddisfacenti

6 Produzione di proteine di interesse farmaceutico

7 Produzione di proteine in pianta Malattia di Gaucher Alterazione del metabolismo degli sfingolipidi Malattia da accumulo lisosomiale Accumulo di glucosilceramide nei lisosomi dei macrofagi

8 Produzione di proteine in pianta Per aumentare la resa della purificazione si possono esprimere proteine di fusione con tag che permettano una facile purificazione mediante cromatografia di affinità

9 sito proteolitico Produzione di proteine in pianta oleosina-pro oleosina irudina ter trasformazione Brassica napus estratto vegetale centrifugazione espressione nei corpi oleosi corpi oleosi purificazione dei corpi oleosi trattamento con proteasi centrifugazione digestione proteolitica irudina

10 Produzione di Anticorpi SISTEMI DI ESPRESSIONE - Cellule di mammifero - Latte di animali transgenici

11 - Cellule di mammifero producono l anticorpo autentico soprattutto in termini di glicosilazione SVANTAGGI: costi elevati possibile contaminazione con patogeni umani - Latte di animali transgenici SISTEMI DI ESPRESSIONE alta resa; le proteine possono essere recuperate periodicamente SVANTAGGI: necessità di produrre animali transgenici possibile contaminazione con patogeni umani

12 Produzione di Anticorpi in pianta Plantibodies Vantaggi Il costo per la produzione in pianta è molto minore che per la produzione in cellule animali - La produzione nei semi rende possibile il mantenimento della proteina per lunghi periodi di tempo Non ci sono rischi di contaminazione con patogeni umani Il pathway di sintesi proteica è conservato tra piante e animali (corretto folding delle immunoglobuline) Le modificazioni post-traduzionali sono simili (glicosilazione)

13 Preparazione del costrutto per l espressione di anticorpi in pianta - Isolamento dell opportuno cdna da una linea cellulare di ibridoma anticorpi in pianta - Inserimento nel vettore promotore costitutivo: CaMV 35S (dicotiledoni) Ubiquitina (cereali) promotore specifico per il seme (per evitare l accumulo nei tessuti verdi qualora l anticorpo interferisca con la crescita e lo sviluppo)

14 anticorpi in pianta - Utilizzo di sequenze specifiche per il targeting cellulare anticorpi ricombinanti sono più stabili in alcuni compartimenti piuttosto che in altri le immunoglobuline full-length devono essere glicosilate: pathway di secrezione il targeting appropriato può facilitare l isolamento e la purificazione rese volte superiori se l anticorpo è accumulato nell ER aggiunta della sequenza di ritenzione nell ER (KDEL)

15 Plantibodies scopo diagnostico e terapeutico CaroRx CEA: glicoproteina tumorale scopo diagnostico applicazione topica previene la trasmissione del virus

16 CaroRx Fase II clinical trials

17 VACCINI EDIBILI I vaccini attuali sono costosi Sono richieste infrastrutture per il trasporto e la somministrazione (problemi logistici ed economici) Problema per i paesi poveri

18 Vantaggi della produzione in piante transgeniche: Coltivazione in loco; basso costo Non è necessario personale per la somministrazione del preparato VACCINI EDIBILI Disponibili indefinitamente (ogni anno si riseminano)

19 VACCINI EDIBILI

20 VACCINI EDIBILI Trasformazione stabile Espressione transiente VETTORI VIRALI

21 Sistema di espressione del polipeptide Sistema di presentazione dell epitopo VACCINI EDIBILI

22 VACCINI EDIBILI Topi nutriti con i pomodori transgenici risultano immunizzati e producono sia IgG che IgA

23 VACCINI EDIBILI

24 Proteine espresse in piante transgeniche con applicazioni come vaccini animali e umani

25 SVANTAGGI DEI VACCINI EDIBILI VACCINI EDIBILI le piante sono organismi viventi che cambiano: la continuità nella produzione del vaccino può non essere garantita i vaccini edibili possono essere confusi con frutti normali e consumati senza controllo il dosaggio è variabile e difficile da controllare: frutti di dimensioni diverse conterranno quantità diverse di antigene il pattern di glicosilazione è simile, ma non identico, a quello delle cellule animali; ciò può influenzare la funzionalità del vaccino

26 La plastica biodegradabile POLI- IDROSSI-BUTIRRATO (PHB) è prodotta per fermentazione dal batterio Alcaligenes eutrophus. Il PHB è biodegradabile, ma impermeabile all acqua: è però molto piu costoso della plastica convenzionale.

27 Operone batterico phb phba: β-chetotiolasi phbb: AcetoacetilCoA-reduttasi phbc: PHB polimerasi

28 Vettore per la trasformazione plastidica Costrutto nel genoma plastidico

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30 Ruolo dei metaboliti secondari nelle piante MOLECOLE DI INTERESSE FARMACOLOGICO

31 E possibile aumentare i livelli di specifici metaboliti secondari attraverso l ingegnerizzazione del pathway biosintetico - sovraespressione di geni codificanti enzimi limitanti nella via biosintetica In pomodoro la sovraespressione della licopene β-ciclasi porta ad un aumento del 50% dei livelli di β-carotene

32 I livelli di flavonoidi possono essere aumentati aumentando l espressione di geni codificanti enzimi della via biosintetica

33 Geni DEL e ROS sotto il controllo del promotore frutto-specifico E8 Sintesi di antocianine in pomodoro esprimendo specifici fattori di trascrizione che attivano la trascrizione del gene PAL

34 I livelli di specifici metaboliti possono essere aumentati alterando il flusso di carbonio da una via metabolica a un altra

35 l estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta generalmente la distruzione della pianta stessa problema se: RARA (difficile da reperire, protetta) DI DIFFICILE COLTIVAZIONE A CRESCITA LENTA (piante legnose)

36 VANTAGGI DELLA PRODUZIONE IN VITRO DI METABOLITI SECONDARI Stabilizzazione ed ottimizzazione della produzione variando le condizioni colturali e nutrizionali Indipendenza dalla stagione vegetativa Selezione di specifiche linee cellulari con alta produttività Produzione di molecole nuove Possibilità di evitare la deforestazione e la perdita di biodiversità

37 Espianti fogliari callogenesi pianta Prelievo degli espianti Sterilizzazione Inoculo in mezzo callogenico Inoculo in mezzo liquido callo Espianti caulinari callogenesi SOSPENSIONE CELLULARE BIOREATTORE

38 Intrappolamento delle cellule in gel (agar, agarosio, acrilammide, gelatina) Riutilizzo della biomassa attraverso la ritenzione delle cellule nel bioreattore e il recupero del prodotto nel mezzo di coltura Utilizzo del sistema in continuo Separazione delle cellule dal mezzo di coltura, quindi dai prodotti rilasciati LIMITE: il metabolita deve essere secreto nel mezzo di coltura

39 alcuni metaboliti secondari sono prodotti dalle piante in risposta a stress di tipo biotico l aggiunta di elicitori (sostanze che mimano l attacco di un patogeno) a cellule in coltura può indurre o aumentare la sintesi di metaboliti principali elicitori utilizzati: chitosano, acido salicilico, acido jasmonico

40 Taxolo estratto dalla corteccia di Taxus brevifolia e Taxus baccata principio attivo utilizzato come antitumorale cancro del polmone, mammella, ovaio sarcoma di Kaposi il taxolo inibisce la depolimerizzazione della tubulina, provocando il blocco della mitosi tubulina microtubulo polimerizzazione depolimerizzazione

41 Taxolo Il taxolo è accumulato soprattutto a livello della corteccia, la sua estrazione diretta comporta la distruzione della pianta il tasso è una SPECIE PROTETTA (rischio estinzione) e a CRESCITA LENTA (gimnosperma legnosa) Per ottenere una quantità sufficiente di taxolo a trattare ogni paziente sono necessari 8 alberi di circa 60 anni il taxolo è una molecola complessa, la sintesi chimica risulterebbe troppo dispendiosa produzione di taxolo per via biotecnologica (da cellule di tasso in coltura)

42 Via biosintetica del taxolo Taxolo Alcuni degli enzimi della via biosintetica vengono indotti in seguito a elicitazione

43 Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i metaboliti di interesse. Alcune vie biosintetiche sono: cellula-specifiche: sono attive solo in alcune cellule specializzate (ghiandole, latticiferi, ecc.) tessuto-specifiche: sono attive solo in alcuni tessuti (epitelio di dotti e cavità secretorie, parenchima corticale, tegumento) organo-specifiche: sono localizzate solo in uno specifico organo (radice, foglia, fiore, frutto, ecc.)

44 un esempio di biosintesi cellulo-specifica In Hypericum perforatum, ipericina e iperforina sono prodotte esclusivamente in cellule secretorie localizzate nella foglia Hypericum perforatum iperforina cellule indifferenziate in coltura non sono in grado di sintetizzare questi composti

45 un esempio di biosintesi organo-specifica In Atropa belladonna gli alcaloidi scopolammina e atropina sono prodotti esclusivamente nella radice Atropa belladonna atropina anche in questo caso, cellule indifferenziate in coltura non producono tali metaboliti

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48 L infezione con A. rhizogenes già di per sé induce un aumento della sintesi di metaboliti secondari Con A. rhizogenes possono essere trasformate piante che esprimano geni eterologhi che alterino la produzione di metaboliti secondari nelle hairy root

49 Alcaloidi indolici Vinblastina e vincristina Catharanthus roseus bloccano la mitosi arrestando il ciclo in metafase Si legano alla tubulina e ne impediscono la polimerizzazione Farmaci antitumorali utilizzati nella cura di linfomi, leucemie, cancro al seno e all utero

50 Alcaloidi indolici La vinblastina e la vincristina derivano dalla strictosidina, precursore di tutti gli alcaloidi indolici Principale alcaloide della china. Usato per la cura della malaria Estremamente tossica Eccita il sistema nervoso Si lega ai recettori della glicina

51 Alcaloidi indolici TDC (triptofano decarbossilasi) insensibile al feedback negativo AS (Antranilato sintasi) e STR (Strictosidina sintasi) overespressione

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53 Proteine ricombinanti prodotte in colture di hairy roots