Metodologie statistiche per l analisi del rischio PROGETTAZIONE ED ANALISI DEGLI ESPERIMENTI PER L ANALISI DEL RISCHIO

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1 Corso di Laurea in Sicurezza igienico-sanitaria degli alimenti Metodologie statistiche per l analisi del rischio PROGETTAZIONE ED ANALISI DEGLI ESPERIMENTI PER L ANALISI DEL RISCHIO Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Padova Docente: Dott. L. Corain SOMMARIO Definizioni, principi e fasi del DoE (Design of Experiments) Blocco e covariata ANOVA a due vie ANOVA multivia Piani k Fattori fissi e fattori casuali Studi di ripetibilità e riproducibilità

2 PRINCIPI E FASI DEL DOE Un esperimento è una serie di prove in cui lo sperimentatore fa variare deliberatamente dei fattori (controllabili) di input di un processo/sistema, osserva la risposta in un uscita e quindi, grazie ad opportune elaborazioni statistiche inferenziali, determina quali fattori inducono una variazione significativa nella risposta. Nell esperimento sono sempre presenti anche dei fattori (fonti di variabilità) non controllabili (strumenti di esecuzione/misurazione della prova, materiale sperimentale non omogeneo/uniforme, campionamento, ecc.) i quali inducono una variabilità ulteriore alla risposta che si somma a quella determinata dai fattori controllabili. 3 PRINCIPI E FASI DEL DOE Si noti che mentre la variabile risposta (ad es. il grado di contaminazione) deve necessariamente essere una misura di tipo numerico, i fattori controllabili di input di un processo/sistema possono essere sia qualitativi (tipo di reagente, materiale di confezionamento, ecc.) sia quantitativi (% di additivo, quantità di ossidante, ecc.). In un esperimento fattoriale, tutte le possibili combinazioni dei livelli dei fattori (detti trattamenti) vengono testati, generalmente ciascuno per un uguale numero di volte pari ad n (esperimento bilanciato). In un piano fattoriale frazionato invece non tutte le combinazioni dei trattamenti vengono testate, ma sono una loro parte (detta frazione del piano). Se i trattamenti vengano testati una sola volta, si parla di esperimento/piano fattoriale non replicato. Esso ha il forte limite di non consentire una analisi inferenziale. 4

3 PRINCIPI E FASI DEL DOE Grazie ad un opportuno modello statistico di rappresentazione dei dati sperimentali è possibile formalizzare il ruolo sia dei fattori controllabili sia di quelli non controllabili: Y = µ + ε, dove Y è la risposta, µ rappresenta il valore medio della risposta, che può dipendere (linearmente) dai livelli (cioè dai valori) dei fattori controllabili. Ad es. µ = µ + τ i (ANOVA ad una via) µ = µ + τ i + β j (ANOVA ad una via con blocco) µ = µ + τ i + β j + (τβ) ij (ANOVA a due vie) ε rappresenta il termine di errore sperimentale, dove confluiscono tutte le fonti (fattori) di variabilità non controllabile e che si assume indipendente ed identicamente distribuito secondo una v.a. gaussiana: ε IIN(,σ ). 5 PRINCIPI E FASI DEL DOE Gli esperimenti sono largamente utilizzati nel campo dell analisi del rischio microbiologico, ad esempio allo scopo di stabilire se il grado di contaminazione microbica può essere messo in relazione ai livelli di alcuni fattori di interesse (tipo di materiale/luogo/temperatura di produzione/conservazione/trasporto degli alimenti); confrontare i pattern di trasferimento di batteri in base a diversi aspetti (strumenti di lavorazione, processi di sanitizzazione, ecc.); validare un protocollo di laboratorio e studiarne la sua ripetibilità e riproducibilità. In generale, tutti gli esperimenti sono progettati ed i dati ottenuti elaborati con metodi statistici, tuttavia solo alcuni in modo preciso, altri invece sono pianificati poco e male ed analizzati in modo improprio. 6 3

4 PRINCIPI E FASI DEL DOE È importante sottolineare che l esperimento deve essere debitamente progettato prima della sua esecuzione. In particolare bisogna stabilire: l idonea risposta (conta dei batteri, quantità di una certa sostanza, ecc.) al luce del problema in oggetto; i fattori ed i rispettivi livelli che si vogliono manipolare nell esperimento e che ci si aspetta possano influenzare la risposta; esiste un ovvio trade-off tra numero di fattori/livelli e tempi/costi dell esperimento; il numero n di prove per trattamento (numero di repliche); in generale si preferisce far sì che ogni trattamento abbia lo stesso numero di prove (esperimento bilanciato); una appropriata assegnazione del materiale sperimentale ai trattamenti; un idoneo ordine di esecuzione delle prove. 7 PRINCIPI E FASI DEL DOE I principi basilari del DoE sono tre: randomizzazione, replicazione e blocco. Randomizzazione: sia l ordine di esecuzione delle prove sia l assegnazione del materiale sperimentale ai trattamenti deve avvenire in modo completamente casuale (randomizzato); questo consente di mediare gli effetti di fattori non controllabili sempre presenti (ma nascosti ) che vanno così ad incidere in modo uniforme sui vari trattamenti. Replicazione: significa che ogni trattamento deve essere eseguito in più di una prova indipendente; questo consente di migliorare la precisione della stima dell effetto dei fattori, riducendo nel contempo la stima dell errore e del rumore di fondo (si ricordi che l errore standard della media campionaria è uguale a σ, scarto quadratico medio della popolazione, diviso n). 8 4

5 PRINCIPI E FASI DEL DOE Blocco: si tratta di un fattore di disturbo noto e controllabile che quasi certamente produce sulla risposta un effetto, che non interessa però allo sperimentatore. Tuttavia la variabilità che trasmette alla risposta deve essere minimizzata. Tipici fattori di disturbo/blocco sono: lotti di materiale grezzo, operatori, provini, attrezzature, il fattore temporale (turni, giorni, ecc.). Se la variabilità del disturbo è nota e controllabile, si può usare la tecnica dei blocchi; se il fattore di disturbo è noto, osservabile ma non controllabile, si può usare l analisi di covarianza per rimuovere l effetto del fattore di disturbo dall analisi. Se il fattore di disturbo non è né noto né controllabile (a variabile nascosta ), si spera che la randomizzazione equilibri la sua influenza nei confronti dell esperimento. 9 PRINCIPI E FASI DEL DOE Le linee guida per la pianificazione ed analisi degli esperimenti sono le seguenti: Identificazione e formulazione del problema. Scelta dei fattori, livelli ed intervalli. Identificazioni dei blocchi e delle covariate. Selezione della variabile di risposta. Scelta del piano sperimentale: determinazione del numero di repliche; assegnazione del materiale sperimentale ai trattamenti; definizione dell ordine di esecuzione delle prove. Esecuzione dell esperimento. Analisi statistica dei dati mediante metodi ANOVA (Analysis of Variance). Conclusioni e raccomandazioni (eventuale pianificazione di un nuovo esperimento sulla base dei risultati ottenuti). 5

6 ANOVA A DUE VIE Nell ANOVA a due vie si vuole stabilire se l effetto dei due fattori di interesse A e B e della loro interazione ha un impatto significativo sulla risposta. Si definisce interazione la possibile sinergia dei due fattori che si verifica quando l effetto del fattore A sulla risposta è diverso a seconda dei livelli del fattore B. Il modello di rappresentazione dei dati è il seguente: Y ijk = µ + τ i + β j + (τβ) ij + ε ijk, con i=,...,a, j=,...,b, k=,...n. Le analisi inferenziali di interesse corrispondono alle verifiche d ipotesi: H A : τ = =τ a = contro H A : τ i per almeno un livello i; H B : β = =β b = contro H B : β j per almeno un livello j; H AB : (τβ) = =(τβ) ab = contro H AB : (τβ) ij per almeno una combinazione di livelli ij. ANOVA A DUE VIE Ad esempio, in uno studio sulle frodi alimentari, si vuole stabilire se i due fattori origine della produzione (due livelli: standard o commerciale) e tipo di produzione (due livelli: allevamento o pescato) e la loro interazione hanno un impatto significativo sulla quantità di grasso nella carne di branzino. I valori medi campionari della risposta, per ciascun livello dei singoli fattori (main effect plot) e per i 4 trattamenti in questione (interaction plot), possono fornire una preliminare indicazione descrittiva sul problema. Main Effects Plot (fitted means) for grasso Interaction Plot (fitted means) for grasso 6. Origine Tipo Prod 6 Origine Comm Std Mean of grasso Mean Allevam Pescato Comm Std Allevam Pescato Tipo Prod 6

7 ANOVA A DUE VIE Per sviluppare una formale verifica di ipotesi, per ciascuna delle tre ipotesi H di interesse, è necessario considerare la seguente scomposizione della somma dei quadrati della risposta. a b n a b ( yijk y... ) = bn ( yi.. y... ) + an ( y. j. y... ) i= j= k= i= j= a b a b n + n ( yij. yi.. y. j. + y... ) + ( yijk yij. ) i= j= i= j= k= SST = SS A + SSB + SS AB + SSE df gradi di libertà: abn = a + b + ( a )( b ) + ab( n ) 3 ANOVA A DUE VIE Grazie all assunzione di normalità del termine di errore casuale, è possibile considerare tre statistiche test di tipo F, riassunte nella usuale tabella ANOVA. Qualora uno o più p-value fossero inferiori al livello α prefissato, si potrebbe rigettare la corrispondente ipotesi H e concludere che i relativi effetti sono significativi. 4 7

8 ANOVA A DUE VIE Se applichiamo l analisi inferenziale ANOVA al caso studio sulle frodi alimentari dei branzini otteniamo i seguenti risultati. Fissato il livello α al 5%, si può concludere che sia il tipo di produzione, sia l origine sia la loro interazione ha un effetto significativo sulla quantità di grasso nella carne. Factor Type Levels Values Origine fixed Comm; Std Tipo Prod fixed Allevam; Pescato Analysis of Variance for grasso, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Origine Tipo Prod Origine*Tipo Prod Error Total S =.776 R-Sq = 4.5% R-Sq(adj) =.3% 5 ANOVA A DUE VIE Grazie all applicazione della procedura dei confronti multipli a coppie (metodo di Tukey) possiamo concludere che solamente lo standard/pescato differisce (ha meno grasso, si veda l interaction plot) rispetto agli altri 3 trattamenti, che presentano invece tra loro uguale valore medio di grasso. Tukey Simultaneous Tests Response Variable grasso All Pairwise Comparisons among Levels of Origine*Tipo Prod Origine = Comm, Tipo Prod = Allevam subtracted from: Difference SE of Adjusted Origine Tipo Prod of Means Difference T-Value P-Value Comm Pescato Std Allevam Std Pescato Origine = Comm, Tipo Prod = Pescato subtracted from: Difference SE of Adjusted Origine Tipo Prod of Means Difference T-Value P-Value Std Allevam Std Pescato Origine = Std, Tipo Prod = Allevam subtracted from: Difference SE of Adjusted Origine Tipo Prod of Means Difference T-Value P-Value Std Pescato

9 ANOVA A DUE VIE L analisi dei residui indica che l assunzione di normalità del termine di errore è ragionevole, mentre qualche perplessità rimane sull assunzione di omogeneità dalla varianza (ipotesi di omoschedasticità). Plots for grasso Normal Probability Plot of the s s Versus the Fitted Values Percent Fitted Value 4 Histogram of the s s Versus the Order of the Data Frequency Observation Order 7 ANOVA A DUE VIE E importante notare che la procedura dell ANOVA tratta ogni fattore come se fosse qualitativo, indipendentemente dal fatto che sia qualitativo o quantitativo. A volte un esperimento può coinvolgere sia fattori quantitativi che qualitativi. Questo fatto può essere considerato nell analisi statistica in riferimento ad un modello di regressione, per i fattori quantitativi a ciascun livello (o combinazione dei livelli) dei fattori qualitativi. Si tratta di una analisi aggiuntiva (e seguente a quella ANOVA) che può essere implementata sugli stessi dati sperimentali. Queste curve e/o superfici di risposta sono spesso un aiuto considerevole nell interpretazione pratica dei risultati. 8 9

10 ANOVA A DUE VIE Si consideri uno studio sulla contaminazione di Escherichia coli in funzione della temperatura di conservazione dell alimento (fattore A) ed il tipo di materiale di conservazione (fattore B). In questo caso, separatamente per ciascun materiale, è possibile applicare anche un modello di regressione, ad es. Y i = β + β T i + β T i + ε i. 9 ANOVA A DUE VIE L applicazione dell analisi inferenziale ANOVA al caso studio sulla contaminazione di Escherichia coli mette in luce i seguenti risultati. Fissato il livello α al 5%, si può concludere che sia il materiale sia la temperatura di conservazione, così come la loro interazione, hanno un effetto significativo sulla contaminazione batterica. Factor Type Levels Values Materiale fixed 3 ; ; 3 Temper fixed 3 5; 7; 5 Analysis of Variance for Batteri, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Materiale Temper Materiale*Temper Error Total S = R-Sq = 76.5% R-Sq(adj) = 69.56%

11 ANOVA A DUE VIE Analizzando i main effect e interaction plot (dopo l analisi inferenziale) possiamo stabilire quale sia il materiale migliore e peggiore ( e 3) e quale sia l effetto della temperatura (correlazione diretta con contaminazione). Inoltre si desume che al variare del materiale, l effetto della temperatura non è lo stesso (ogni materiale ha un proprio profilo di contaminazione in funzione della temperatura). Mean of Batteri Main Effects Plot (fitted means) for Batteri Materiale Temper Mean Interaction Plot (fitted means) for Batteri Materiale Temper ANOVA A DUE VIE L analisi dei residui non evidenzia alcuna criticità rispetto alle tre assunzioni (normalità, indipendenza ed omoschedasticità) sul termine di errore casuale del modello. Plots for Batteri Normal Probability Plot of the s s Versus the Fitted Values Percent Fitted Value 5 Frequency Histogram of the s s Versus the Order of the Data Observation Order

12 ANOVA A DUE VIE Dal momento che uno dei due fattori è di tipo quantitativo (temperatura) è possibile stimare una curva di risposta (polinomiale di grado) per ciascuno dei tre materiali. Dai risultati si possono desumere delle importanti indicazioni sul profili di contaminazione per i tre materiali. 5 Scatterplot of Batteri vs Temper Materiale 3 Batteri Temper 4 3 ANALISI DELLA VARIANZA MULTIVIA Modello statistico (3 fattori) Numero di osservazioni totali: abcn i =,,..., a j =,,..., b Yijkl = µ + τ i + β j + γ k + ( τβ ) ij + ( τγ ) ik + ( βγ ) jk + ( τβγ ) ijk + εijkl k =,,..., c l =,,..., n Yijkl è variabile casuale che indica l ijkl esima osservazione µ è il valore atteso totale, è un parametro comune a tutti i livelli dell esperimento τ è l effetto dell i esimo livello del fattore A i β è l effetto del j esimo livello del fattore B j γ k è l effetto del k esimo livello del fattore C τβ è l effetto dell interazione tra il fattore A e il fattore B ( ) ij ( τγ ) ik è l effetto dell interazione tra il fattore A e il fattore C ( βγ ) jk è l effetto dell interazione tra il fattore B e il fattore C ( τβγ ) ijk è l effetto dell interazione tra il fattore A, il fattore B e il fattore C ε ijkl rappresenta la componente dell errore casuale avente distribuzione normale con media zero e varianza σ. 4

13 ANALISI DELLA VARIANZA MULTIVIA La procedura di base è simile al caso a due fattori; tutti le abc k combinazioni dei fattori (trattamenti), ciascuna replicata n volte, vengono realizzate in ordine casuale. Anche l analisi ANOVA è simile e si basa sulla scomposizione della somma dei quadrati del tipo: SST = SS A + SSB + + SS AB + SS AC + + SS + + SS + SS ABC AB K E Per quanto riguarda l analisi inferenziale, si avranno tante verifiche di ipotesi (cosiddette sugli effetti principali) quanti sono i k fattori, così come si andrà a testare la significatività delle interazioni a due, a tre e così via. 5 PIANI K Lo studio sulle frodi alimentari è un esempio di piano, ovvero di piano k con k=. In generale, un piano k èun caso particolare di piano multivia quando si considerano k fattori, ciascuno dei quali su livelli (detti convenzionalmente alto / basso o presenza / assenza, rispettivamente per fattori quantitativi o qualitativi). Si noti che il modello di rappresentazione dei dati include k k k effetti principali, e interazioni a e a 3 e così via. Il piano k 3 è particolarmente utile nelle fasi iniziali della sperimentazione quando è probabile che ci siano molti fattori da analizzare. Dato che tale piano determina un numero di trattamenti che il minimo valore possibile per lo studio di k fattori, il piano k viene ampiamente utilizzato negli esperimenti di screening. Dato che si considerano solamente due livelli per fattore, si assume implicitamente che la risposta vari linearmente nel range dei livelli scelti del fattore. 6 3

14 PIANI K Esempio: si consideri il processo di riempimento di una bevanda gasata dove la risposta (differenza dell altezza del livello target) è in funzione di 3 fattori, quali A: % di carbonazione, B: pressione e C: velocità del macchinario. Per ciascuno degli 8 trattamenti sono state realizzate n= repliche. 7 PIANI K Risultati dell analisi inferenziale. Term Effect Coef SE Coef T P Constant A B C A*B A*C B*C A*B*C S = R-Sq = 93.59% R-Sq(adj) = 87.98% Analysis of Variance for Y (coded units) Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Main Effects Way Interactions Way Interactions Error Pure Error Total

15 PIANI K Main effect e interaction plot. Interaction Plot (data means) for Y A 4 A Main Effects Plot (data means) for Y B 4 B 5 3 A B C Mean of Y C PIANI K Surface e contour plot. Surface Plots of Y Y - A B 5. Y - - A 4 C Hold Values A B 5 C Contour Plots of Y Y C 7.5 B 3. B*A C*A C*B 4 Y < > Hold Values A B 5 C

16 FATTORI FISSI E FATTORI CASUALI Negli esperimenti che abbiamo considerato finora i fattori si assumono come fissi: ciò significa che lo sperimentatore può fissare a propria scelta i livelli del fattore stesso. L analisi inferenziale mira a stabilire se quei specifici livelli del fattore inducono una variazione significativa nella risposta. Talvolta invece i livelli dei fattori non possono essere considerati fissi, ma sono di fatto estratti casualmente da una più ampia popolazione di possibili livelli (ad es. alcun tra tutti i possibili laboratori, operatori, ecc.). Parliamo in questo caso di fattori casuali. L obiettivo è stabilire se l intera popolazione di un dato fattore casuale ha un effetto significativo sulla risposta. 3 FATTORI FISSI E FATTORI CASUALI Nei disegni con fattori casuali spesso l obiettivo è anche quello di isolare e stimare la parte della variabilità imputabile al fattore casuale, separandola dalla variabilità non controllabile (rappresentata dal termine casuale ε). Nel caso di un singolo fattore casuale, il modello statistico è definito come y i =,,..., a = µ + τ + ε j =,,..., n ij i ij sia τ i sia ε i sono variabili casuali, ovvero εij IIN σ τ IIN στ (, ) e i (, ) da cui, la variabilità totale della variabile casuale che rappresenta ciascuna osservazione è data da V( yij ) = σ + σ τ 3 6

17 FATTORI FISSI E FATTORI CASUALI La variabilità totale delle osservazioni è scomposta in una componente che misura la variabilità tra i trattamenti e una che misura la variabilità all interno dei trattamenti. La verifica di ipotesi sugli effetti di un trattamento individuale è priva di significato, pertanto vengono valutate le ipotesi sulle componenti di varianza: H : στ = H : στ > Se σ τ= tutti i trattamenti sono identici; se invece σ τ> c è variabilità tra i trattamenti (e quindi un effetto sulla risposta). I valori attesi delle somme dei quadrati portano a E( MSE ) = σ e E( MSTreatments ) = σ + nσ τ Bisogna quindi valutare la statistica test F con a- e N- gradi di libertà:. F MS MS = Treatments / E 33 FATTORI FISSI E FATTORI CASUALI Gli stimatori dei componenti della varianza sono: ˆ σ = MS e ˆ ˆ E σ + nστ = MSTreatments MSTreatments MSE ˆ στ = n ˆ σ = MS Nel caso di due o più fattori (tutti od in parte) di tipo casuale, si possono ricavare opportuni stimatori dei componenti della varianza e stimare il peso che ciascuno di questi ha sulla variabilità (e quindi sulla riproducibilità) dell intero sistema/protocollo di misurazione. Si noti che talvolta il metodo di analisi della varianza può condurre ad una stima negativa (ovviamente priva di significato) di un componente della varianza. E 34 7

18 STUDI DI RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ Spesso risulta di interesse validare/studiare un protocollo di laboratorio mediante un esperimento pianificato al fine di studiare/stimare le componenti di variabilità di un determinato sistema di misurazione. Si parla di ANOVA Gauge R&R (Repeatability & Reproducibility). Per ripetibilità si intende la variazione nelle misure prese da una sola persona o strumento sulla stessa unità e alle stesse condizioni. Si tratta della variabilità attribuibile esclusivamente all errore sperimentale (σ relativo ad ε). Con riproducibilità ci si riferisce invece alla componente della variabilità che può essere attribuita all operatore (inteso quindi come fattore casuale, come se un operatore venisse estratto da una ipotetica popolazione). Nel caso si considerasse anche il fattore laboratorio, saremmo di fronte ad un modello con due fattori casuali, entrambi con un possibile impatto sulla riproducibilità. 35 STUDI DI RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ Si noti che il fattore operatore risultata nidificato (nested) all interno del fattore laboratorio; questo perché ovviamente un operatore opera solamente all interno di un dato laboratorio; in presenza di fattori nested, il numero di trattamenti e di gradi di libertà si calcolano in modo diverso dal caso standard. Un ulteriore fattore che viene spesso considerato negli studi Gauge R&R è rappresentato dalle parti (parts) o campioni (samples), ovvero ciò che viene misurato. Spesso le parti/campioni sono estratti (trattasi di un fattore casuale) dalla medesima popolazione (ad es. lotto di prodotto o materia prima) e ci si aspetta che tra le diverse parti/campioni non vi sia una differenza significativa. Anche l effetto delle parti/campioni può avere un potenziale impatto sulla riproducibilità del sistema. 36 8

19 STUDI DI RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ Esempio: uno studio inter-laboratorio, dove la risposta è il conteggio delle colonie batteriche aerobiche, è stato condotto in laboratori in ciascuno dei quali analisti hanno provato campioni di uno stesso lotto, facendo le analisi in doppio per ogni campione. Quindi, ogni laboratorio ha effettuato xx=8 analisi e il numero totale di prove è pari ad 8. Si tratta di uno studio Gauge R&R con 3 fattori (full nested). Dall analisi della tabella ANOVA, fissato il livello α=5%, si evince che sia tra laboratori sia tra campioni esiste una differenza significativa. Analysis of Variance for Log(counts), using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Laboratory Analyst(Laboratory) Sample(Laboratory Analyst) Error Total S =.7835 R-Sq = 96.53% R-Sq(adj) = 93.6% 37 STUDI DI RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ Mean of Log(counts) Log(counts) Dotplot of Log(counts) vs Laboratory; Analyst; Sample Sample Analyst Laboratory Main Effects Plot (data means) for Log(counts) Laboratory Variance Components % of Source Var Comp. Total StDev Laboratory Analyst Sample Error Total Ripetibilità =.4 (6.4%) Riproducibilità = =.4(93.6%) Percent Frequency Plots for Log(counts) Normal Probability Plot of the s s Versus the Fitted Values Fitted Value Histogram of the s s Versus the Order of the Data Observation Order 38 9

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