Lo Splicing dell RNA. Geni non interrotti
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1 Lo Splicing dell RNA I geni interrotti negli eucarioti si ritrovano in ogni classe: geni nucleari codificanti per proteine, rrna e trna. I geni interrotti sono presenti anche nei mitocondri e nei cloroplasti, in misura estremamente ridotta nei batteri e nei batteriofagi. Geni non interrotti
2 La scoperta dello splicing Lo splicing fu scoperto nel 1977 attraverso studi di ibridazione DNA-RNA nell adenovirus. La comparazione della mappa di restrizione eseguita sul cdna e quella sul DNA genomico confermò l esistenza principalmente nei eucariotici dei geni interrotti.
3 Caratteristiche generali 1) I Geni sono spaccati più che dispersi 2) Stessa struttura in tutti i tessuti 3) Gli introni presentano codoni di stop in tutti e tre i frames di lettura (UAA-UGA-UAG) Gli esoni sono mediamente circa 150 nucleotidi Gli introni vanno da 200 a nucleotidi, In media circa basi
4 Il paradosso del valore-c Il DNA genomico totale (aploide) caratteristico di un organismo è detto volore-c. Una relazione diretta tra contenuto di DNA e complessità dell organismo si riscontra fino ai nematodi. In alcuni phyla evolutivi si hanno grosse variazioni del contenuto di DNA tra organismi che mostrano la stessa complessità. Comparazione mrna DNA genomico Geni molto complessi sono il risultato di numerosi e lunghi introni e non di prodotti proteici molto lunghi Species Average exon N Average gene length (Kb) Average mrna length (kb) S. cerevisiae 1 1,6 1,6 Fungi 3 1,5 1,5 10 C. elegans ,0 times D. melanogaster 4 11,3 2,7 Chicken 9 13,9 2,4 Mammals 7 16,6 2,2
5 Il rimescolamento degli esoni Modello degli introni precoci: perdita degli introni nei batteri Modello degli introni tardivi: comparsa degli introni durante l evoluzione Probabilmente proteine formate da subunità ripetute come le immunoglobuline si sono evolute per duplicazione e divergenza degli esoni Gli esoni codificano per domini funzionali LDL (plasma low density lipoprotein) EGF (epidermal growth factor).
6 Organizzazione dei geni per l actina Probabilmente alcuni introni sono andati perduti. Il gene primordiale aveva circa 20 introni. 19 differenti posizioni degli introni in differenti organismi
7 La Chimica dello Splicing Lo splicing avviene mediante 2 reazioni di transesterificazione in cui un gruppo OH libero attacca un legame fosfodiesterico. Le sequenze più conservate sono: GU (sito 5 ), AG (sito 3 ) e la A della branch site. 1 Attacco nucleofilo 2 Attacco nucleofilo degradazione Teoricamente ogni sito di splicing 5 potrebbe reagire con qualunque sito di splicing 3 ma normalmente lo splicing avviene tra i siti 5 e 3 dello stesso introne.
8 Struttura della giunzione a tre vie che si forma durante la reazione di splicing Punto di ramificazione C-2 Sito 5 (GU) C-3 Nelle due reazioni di esterificazione non vi è dispendio di energia. L ATP viene poi consumata nell assemblaggio e nel funzionamento del complesso macchinario di splicing.
9 snrna (Fattori di splicing) U1 U2 U5 Il Macchinario dello Spliceosoma Un singolo small nuclear RNA ( basi) + diverse proteine formano lo small nuclear ribonuclear protein (snrnp, snurp ). Lo spliceosoma è formato da circa 150 proteine. U4/U6 Struttura secondaria del U1 snrna umano I domini identificati dalle strutture stem-loop A,B,C e D forniscono i siti di legame per proteine specifiche del U1 snrnp. Il dominio Sm è richiesto per l interazione con proteine comuni. La regione a singolo filamento è complementare al sito 5 di splicing dell introne. Struttura dell snrna U1
10 Le interazioni RNA-RNA e RNA-proteina sono fondamentali per il funzionamento dello spliceosoma U1 e U6 legano il sito 5 di splicing U2 riconosce il punto di ramificazione (branch site) Branch-point binding protein Interazione U2-U6
11 Le fasi della reazione di splicing U1 lega il sito 5 mentre il fattore ausiliario 2AF65 contatta il tratto di pirimidine e il sito 3 di splicing Legame di U2 con il sito di ramificazione (rimozione di BBP) Complesso E (early) U6 lega il sito 5 di splicing Tripla Complesso A La A della branch site viene spinta fuori dal RNA e resa disponibile per la reazione con il sito 5 di splicing U1 viene rilasciato Complesso B Avvicinamento dei siti di splicing U4 viene rilasciato, U6 interagisce con U2 formando il sito attivo in cui avviene la I reazione di transesterificazione (formazione della lariat) Complesso C U5 promuove la II reazione di transesterificazione tra i siti 5 e 3 con conseguente unione dei 2 esoni Degradazione dell introne
12 Formazione del centro catalitico L appaiamento U6-U4 nella tripla è incompatibile con l appaiamento U6-U2. U5 è invece legato alla tripla mediante interazioni proteina-proteina. Il rilascio di U4 permette un cambiamento conformazionale di U6 dove una parte della sequenza rilasciata forma una forcina mentre l altra parte si appaia con una sequenza complementare di U2. Il fattore U2 lega la branch site. Rilascio U4 Spliceosoma di mammifero contenente U1, U2, U4, U5, U6 e proteine addizionali (25 nm x 50 nm). Lo spliceosona è equivalente per grandezza ad una subunità del ribosoma.
13 Self- Splicing (introni del gruppo I e II) Splicing nucleare:richiede il complesso apparato di splicing ed è tipico degli eucarioti. Introni del gruppo II: la chimica e gli intermedi di reazione sono simili ai pre-mrna nucleari. La reazione produce una lariat (introne a cappio). Si ritrova nei geni mitoncondriali ed in alcuni geni procariotici. Introni del gruppo I: un nucleoside libero G con il suo 3 -OH attacca il sito 5 di splicing. La seconda reazione procede normalmente ed il sito 3 dell esone 1 attacca sito 3 di spicing il (5 dell esone 2). L introne rilasciato è lineare. Si ritrova nei geni mitoncondriali ed in alcuni geni procariotici. La struttura secondaria dell RNA negli introni di gruppo I e II è cruciale (non puo essere mutata) per la loro funzione ( nt). In vitro ad opportune concentrazione di ioni positivi si osserva self-splicing.
14 La struttura del sito catalitico formata da U6 ed U2 nello spliceosoma è molto simile alla struttura secondaria intramolecolare che si forma negli introni di gruppo II. Gli introni del gruppo I possono formare riboenzimi
15 Affidabilità del sistema di splicing Un gene umano contiene circa 9 esoni. Gli esoni sono in media 150 nucleotidi mentre gli introni (circa 3000 nt) possono arrivare a molte migliaia di nucleotidi. Di conseguenza gli esoni sono dispersi tra un oceano di sequenze introniche. Meccanismo 1 La subunità maggiore della RNA Polimerasi II ha una coda (CTD) formata dall esapeptide Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser che va incontro a fosforilazione. Il grado di fosforilazione controlla il richiamo di fattori di splicing e della maturazione dell RNA. La RNA Pol II trasferisce i fattori di splicing sul sito 5 che poi interagiscono con quelli al sito 3 successivo appena questo viene trascritto. Questo meccanismo diminuisce la possibilità di salto degli esoni.
16 Meccanismo 2 Le proteine SR (ricche in Ser ed Arg) si legano agli esoni alle sequenze dette ESE (exonic splicing enhancer) e reclutano alcuni componenti (U1 e U2AF) dello spliceosoma alle giunzioni 5 e 3. Questo meccanismo evita l uso di siti di splicing non corretti. Lo splicing alternativo (troponina T) Lo splicing alternativo può generare centinaia o migliaia di prodotti proteici differenti (gene slo di ratto o DSCAM di Drosophila). Splicing alternativo della troponina T, proteina muscolare di mammifero. Le due forme differiscono per un esone (3 o 4).
17 Cinque modi differenti di splicing alternativo per un mrna Lo splicing alternativo costitutivo Il gene per l antigene T del virus SV40 di scimmia codifica per due proteine: Large T e Small t che sono il risultato dell uso di 2 siti 5 differenti. Rappresenta un caso di estensione dell esone. Si osserva l estensione dell esone 1. Vengono usati i siti di splicing 5 sst e 3 SST. L esone 1 viene fuso con l esone 2. Vengono usati i siti di splicing 5 SST e 3 SST. Entrambe le forme vengono prodotte in una cellula infettata da SV40 ma elevati livelli di SF2/ASF (SR protein) favoriscono l uso dei siti di splicing più vicini e quindi la formazione dello small t
18 Lo splicing alternativo regolato da attivatori e repressori Regolatori: Splicing regolato - Momenti diversi - Condizioni diverse - Diversi tessuti o tipi cellulari ESE o ISE exonic-intronic splicing enhancers ESS o ISS exonic-intronic splicing silencers Proteine SR - Il dominio C-terminale (SR) interagisce con il macchinario di splicing - Il dominio RRM riconosce l RNA
19 Determinazione del sesso in Drosophila Regolazione del gene Sxl Pm Promotore mantenimento Pe Promotore embrionale Nei maschi se la proteina Sxl precoce venisse sintetizzata risulterebbe abortiva per la presenza di un codone di stop Nel moscerino il sesso è determinato dal rapporto tra cromosomi X ed autosomi. Due attivatori SisA e SisB trascrizionali codificati dal cromosoma X stimolano la trascrizione del gene Sxl (Sex-Lethal). Un repressore Dpn (Deadpan), codificato da cromosoma 2, inibisce la trascrizione del gene Sxl. Negli embrioni future femmine si ha un espressione piu elevata degli attivatori SisA-SisB e quindi della proteina Sxl.
20 Inizialmente la proteina Sxl precoce promuove lo splicing alternativo del suo stesso gene (rimozione dell introne che contiene il sito di stop) determinando la formazione di una proteina Sxl attiva. 150 a.a. al CTD 30 a.a. al CTD Altri due regolatorari Tra e Dsx sono coinvolti nella cascata regolativa dello splicing alternativo che determina il sesso nella Drosophila. Sxl promuove l eliminazione dell esone che contiene il sito di stop e favorisce lo splicing alternativo del gene tra. A sua volta il regolatore Tra con Tra-2 stimolano lo splicing alternativo del gene dsx (Double sex). Le proteine Dsx che differiscono per il C- terminale nel maschio e nella femmina controllano i geni del differenziamento del sesso.
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