INDICE DEI CAPITOLI. CAPITOLO 1: Requisiti ambientali e controlli, disegno del laboratorio (Aldo Volpes, Palermo)

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1 INTRODUZIONE Il recente recepimento nella normativa italiana delle Direttive Europee su cellule, tessuti e cellule riproduttive pone il settore della procreazione medicalmente assistita di fronte a nuove e importanti sfide. In particolare il Decreto Legislativo 16/2010, così come aggiornato dal D. Lgs. 85/2012, entra nel merito di requisiti di qualità e sicurezza per il laboratori di PMA, che si vanno ad affiancare e integrare a quelli già previsti dalle leggi esistenti e dalle buone pratiche di laboratorio cui tutti quelli che lavorano in questo settore si riferiscono da tempo. A questo va aggiunto il fatto che spesso i requisiti richiesti non sono sempre semplici da raggiungere e raramente sono indicate le modalità per arrivare a questo risultato. Il Centro Nazionale Trapianti (CNT), organismo di riferimento per l applicazione nei tissues establishments dei Decreti Legislativi 191/2007 e 16/2010 e la SIERR (Società Italiana di Embriologia, Riproduzione e Ricerca), che rappresenta la maggior parte degli embriologi italiani, hanno pensato di collaborare per un progetto comune. Abbiamo voluto scrivere un manuale che affronti e approfondisca i requisiti di qualità e sicurezza richiesti dalla norma, traducendoli nella realtà specifica dei laboratori di PMA. I capitoli, che affrontano diverse tematiche difficili, come la sanitizzazione e la pulizia degli ambienti, la vestizione corretta, la movimentazione del personale nel laboratorio, la gestione delle apparecchiature, è stato scritto da esperti che lavorano nel settore, che volontariamente hanno offerto la loro disponibilità, con il coordinamento e il supporto degli esperti del Centro Nazionale Trapianti per una corretta interpretazione dei requisiti normativi. Si fa riferimento alle esperienze pregresse anche di altri paesi e di settori affini, come quello dei tessuti e delle GMP, nell idea di arrivare a definire alcune procedure di buona pratica di gestione del laboratorio, che non hanno la pretesa di essere la norma ma solo dei suggerimenti di riferimento per chi quotidianamente si trova ad affrontare le difficoltà nel proprio lavoro. Come abbiamo voluto più volte sottolineare, questo manuale vuole suggerire un opzione possibile, non l unica opzione, per raggiungere i requisiti che la norma richiede. Ogni Centro di PMA dovrà poi trovare il modo più adatto per applicare queste procedure nella propria realtà, personalizzandole sulla base dell attività che svolge, dei materiali che lavora, del personale che ha a disposizione e degli ambienti in cui può operare, tenendo però sempre presente l obiettivo di dare ai pazienti il massimo della qualità e della sicurezza possibili. Abbiamo raggiunto il primo degli obbiettivi, che era quello di rendere disponibile a tutti l elaborato finale del nostro lavoro: sarà necessario rivedere tutto il lavoro periodicamente e integrarlo sia con altri capitoli, ancora in discussione, che con nuovi argomenti.

2 MANUALE PER LA GESTIONE DI UN LABORATORIO DI PMA Strumenti per l applicazione dei D. Lgs. 191/2007 e 16/2010 nei laboratori di procreazione medicalmente assistita INDICE DEI CAPITOLI CAPITOLO 1: Requisiti ambientali e controlli, disegno del laboratorio (Aldo Volpes, Palermo) o o o Controlli particellari Controlli microbiologici Strutturazione di un Laboratorio di PMA CAPITOLO 2: Accesso al laboratorio, flussi di entrata/uscita di personale e materiali (Lucia De Santis, Milano) o Limitazioni o Abbigliamento o Comportamento, come ci si muove sotto cappa in ambiente A + D CAPITOLO 3: Pulizie e sanificazione dei locali e delle attrezzature (Roberta Barbaro Rosanna Ciriminna, Palermo) o o o o Modalità operative Pulizia ordinaria e straordinaria (come, con che frequenza, con quali materiali/prodotti) Come validare la procedura di pulizia Esempi di gestione della modulistica CAPITOLO 4: Gestione attrezzature e strumentazione, taratura e calibrazione strumenti (Catello Scarica, Roberta Maggiulli, Stefania Romano, Antonio Capalbo, Filippo Maria Ubaldi e Laura Rienzi, Roma) o o o o Normative, requisiti e linee guida Attrezzatura e strumentazione Modalità di manutenzione e taratura Esempi di modulistica CAPITOLO 5: Lo stoccaggio in azoto liquido (Cristina Bottazzi, Genova) o Approccio organizzativo delle biobanche o Problematiche relative alla sicurezza CAPITOLO 6: Tracciabilità nel laboratorio e codifica (Sandrine Chamayou, Catania) o o o Tracciabilità di materiali, gameti, embrioni, operatori, dati ambientali e di strumentazione utilizzata Esempi di codifica Scheda di laboratorio (esempi) CAPITOLO 7: Movimentazione e trasporto di gameti ed embrioni tra centri (Patrizia Maria Ciotti, Bologna) o o Procedure per il rilascio e la movimentazione di gameti ed embrioni Documentazione (esempi)

3 CAPITOLO 8: La gestione della qualità (Annalisa Sebastianelli Rocco Rago, Latina) o o Struttura del Sistema Gestione Qualità Esempi di documentazione CAPITOLO 9: Strumenti per la gestione della qualità nell ottica del miglioramento continuo (Simone Palini Silvia De Stefani, Cattolica) o o Indicatori Strumenti per l analisi dei processi (FMEA/FMECA, esempi) CAPITOLO 10: Gestione dei materiali infetti (in corso di pubblicazione) Sara Chigioni, Milano Elena Gismano, Manchester o o Impianto ed organizzazione del laboratorio nella gestione di materiali infetti Gestione pratica del trattamento di coppie infette o sierodiscordanti CAPITOLO 11: Validazioni di processi e dei materiali (in corso di pubblicazione) Paolo Giovanni Artini, Pisa o Cocktail decontaminanti, terreni di coltura o Esempi

4 Cap 1 Requisiti ambientali e controlli di qualità ambientale Aldo Volpes Centro Andros s.r.l. Unità di Medicina della Riproduzione, Palermo 1

5 I requisiti minimi, per quanto riguarda la qualità dell aria, che un laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) deve possedere sono descritti nell allegato V, del decreto legislativo 25 gennaio 2010 n. 16. Il paragrafo D, punto 3 recita:.per la qualità dell aria è previsto quale requisito un numero di particelle e un numero di colonie microbiche equivalente a quelli di grado A di cui all allegato 1 della guida europea alle buone pratiche di fabbricazione (Good Manufacturing Practice: GMP),.con un ambiente di fondo adeguato alla lavorazione dei tessuti/cellule interessati ma almeno equivalente a GMP di grado D in termini di particelle e di colonie microbiche. Il paragrafo D, punto 4 recita: Condizioni ambientali meno rigorose di quelle sopraindicate possono essere accettabili qualora:...b) sia dimostrato che il contatto con un ambiente di grado A ha effetti nocivi sulle proprietà richieste per i tessuti o cellule di cui si tratta, oppure c) sia dimostrato che le modalità e il percorso di applicazione di tessuti o cellule al ricevente comportano un rischio di trasmettere al ricevente infezioni batteriche o fungine, notevolmente inferiore rispetto al trapianto di cellule e tessuti, oppure d) non sia tecnicamente possibile eseguire il procedimento richiesto in un ambiente di grado A (ad esempio perchè nella zona di lavorazione occorrono attrezzature specifiche non del tutto compatibili con il grado A). Una classificazione della qualità dell aria deve essere fatta inizialmente, dopo l installazione e la pulizia degli ambienti e poi monitorata periodicamente, mediante: - la conta delle particelle aerodisperse - la conta delle contaminazioni microbiologiche. CONTA PARTICELLARE Per quanto concerne la conta particellare, vengono di seguito riportati i limiti descritti nelle EU Guidelines to Good Manufacturing Practice (GMP) Annex 1 (update 2008). 2

6 Maximum permitted number of particles per m 3 equal to or greater than the tabulated size At rest In operation Grade 0.5 µm 5.0 µm 0.5 µm 5.0 µm A B C D Not defined Not defined Lo stato at rest del laboratorio vuol dire che gli strumenti sono installati e operativi, ma non è presente, all interno del laboratorio, il personale. La valutazione della conta particellare at rest dovrebbe essere effettuata dopo un periodo di minuti dalla fine delle attività. La condizione in operation prevede, oltre le condizioni degli strumenti nello stato at rest, che il personale sia presente e operante all interno del laboratorio. Se le operazioni di controllo dell aria possono essere dannose per le cellule in lavorazione, tale controllo può essere effettuato in corso di una simulazione, dove però devono essere rispecchiate le condizioni abituali di lavoro. Per i laboratori di PMA deve essere effettuato un controllo particellare dell aria in operation solo all interno delle cappe a flussi laminari (grado A): non essendo definito il limite di particelle per il grado D (vedi tabella) tale tipo di controllo non è richiesto per il locale circostante. Poiché talvolta i certificati rilasciati dalle ditte che effettuano i controlli della qualità dell aria riportano valori riferiti alla norma ISO, riportiamo di seguito la classificazione ISO , norma che descrive nel dettaglio anche le modalità di esecuzione di tali controlli. 3

7 Classe 0.1 µm 0.2 µm 0.3 µm 0.5 µm 1 µm 5.0 µm ISO ISO ISO ISO ISO ISO ISO ISO ISO Comparando le due tabelle si può notare che il grado A della classificazione GMP equivale circa alla classe ISO 5, mentre il grado D della classificazione GMP equivale circa, nello stato at rest, alla classe ISO 8. Si consiglia di richiedere un certificato in cui sono riportati i parametri GMP. Strumenti per la conta particellare Lo strumento per la conta particellare utilizzato per le rilevazioni deve essere corredato di un certificato di taratura rilasciato da una struttura autorizzata e accreditata (es.: SIT), copia del quale deve essere rilasciato insieme ai risultati del controllo. Numero di rilevazioni Il numero delle rilevazioni deve essere di almeno due punti; per ambienti con una superficie superiore ai 4 m 2 il numero dei punti da campionare deve essere calcolato secondo la seguente formula (vedi norme ISO ): N L = A dove N L è il numero minimo di rilevazioni A è l area del laboratorio espressa in metri quadrati 4

8 Volume di aria da campionare Per il grado A, la rilevazione per ogni punto deve essere effettuata su almeno un m 3 di aria, mentre per il grado D il volume dei campioni prelevati in corrispondenza di ciascun punto deve essere pari ad almeno 2 litri, con un tempo di campionamento minimo di 1 min per ogni punto (ISO B 4.2.2). Posizionamento dello strumento per la conta particellare Premesso che i parametri di numero di particelle (e anche di colonie microbiche, vedi di seguito) previsti per il grado A dalle GMP possono essere rispettati solo utilizzando una cappa a flusso laminare, a tale scopo rilevazioni della conta particellare vanno effettuate solo all interno delle stesse. Per quanto riguarda invece le rilevazioni delle particelle che devono essere effettuate per il rispetto dell ambiente di fondo (grado D), il responsabile del laboratorio identifica le zone critiche in cui tali rilevazioni devono essere effettuate (in vicinanza degli incubatori, delle cappe stesse, del micromanipolatore, zone di passaggio, aree potenzialmente più sporche, etc.). Frequenza dei controlli E consigliabile una frequenza minima annuale. In caso di eventi particolari (contaminazioni, installazione di nuove apparecchiature) sarà cura del responsabile del laboratorio attivare i controlli senza attendere la scadenza annuale. La frequenza deve comunque essere stabilita anche sulla base del volume di attività svolta nel laboratorio. In caso ci si appresti a fare la rilevazione in un nuovo laboratorio o per la prima volta o in caso di presenza in laboratorio di nuovo personale, sarebbe opportuno effettuare rilevazioni ravvicinate nel tempo, in presenza di processazioni analoghe e uguale composizione dello staff di laboratorio, per poi decidere una tempistica (semestrale o annuale) sulla base dei risultati ottenuti. Al fine di una significatività statistica, dovrebbero essere campionati per questa fase iniziale di convalida almeno tre punti per ogni controllo. 5

9 CONTA MICROBIOLOGICA Vengono di seguito riportati i limiti di contaminazione microbiologica raccomandati nelle EU Guidelines to Good Manufacturing Practice (GMP) Annex 1 (update 2008). Recommended limits for microbial contamination (a) Grade Air sample cfu/m 3 Settle plates (diameter 90 mm) Cfu/4 hours (b) Contact plates (diameters 55 mm) Cfu/plate Glove print 5 fingers Cfu/glove A <1 <1 <1 <1 B C D (a) (b) These are average values Individual settle plates may be exposed for less than 4 hours Metodi di campionamento Possono essere utilizzati vari tipi di campionamento: Valutazione Air sample Si effettua tramite campionamenti attivi aerei e a tale scopo sono utilizzati particolari aspiratori che permettono all aria di passare attraverso piastre di coltura montate sull apparecchio (Campionatore SAS). Parametro: CFU/m 3 Valutazione Settle plates Si effettua tramite campionamenti passivi aerei e a tale scopo sono utilizzate piastre di coltura del diametro di 90 mm che vengono mantenute aperte per tutta la durata della lavorazione, se questa è inferiore alle 4 ore. Se la lavorazione richiede tempi più lunghi il controllo deve essere di almeno 4 ore; tuttavia, le piastre esposte sotto cappa per un periodo così lungo potrebbero disidratarsi non 6

10 consentendo quindi un risultato valido; per tale motivo si consiglia di esporre eventualmente in sequenza due piastre, ciascuna per 2 ore. Parametro: Cfu/4 hours Valutazione Contact plates Si effettua per il campionamento delle superfici e a tale scopo sono utilizzate piastre di coltura del diametro di 55 mm che vengono messe a contatto diretto con i siti di campionamento. Parametro: Cfu/plate Per siti di campionamento particolari, poco compatibili con la rilevazione mediante piastre a contatto, è possibile utilizzare tamponi sterili. Il campione è poi seminato successivamente sulle piastre di coltura. Terreni di coltura utilizzati Sono utilizzati terreni di coltura semplici e/o arricchiti e/o selettivi per la conta microbiologica totale o per ricerche microbiche specifiche (es.: lieviti e muffe). Numero di rilevazioni Per determinare il numero di campioni per il controllo della contaminazione dispersa nell aria a riposo si deve tener conto del volume dell ambiente: N. campioni = 3 A (dove A = volume del locale espresso in m 3 ) Per determinare il numero di campioni per il controllo della contaminazione delle superfici si deve tener conto dell area del locale o della stazione di lavoro espresso in m 2 e a questo valore è stata applicata la formula: N. campioni = 2 A x 2 (dove A = superficie dell area espressa in m 2 ). Siti del laboratorio dove effettuare la conta microbiologica La conta microbiologica deve essere effettuata all interno delle cappe a flusso laminare per la valutazione del rispetto del grado di contaminazione (grado A). Per quanto riguarda invece la valutazione del rispetto dei parametri dell ambiente di fondo (grado D), il responsabile del laboratorio identifica i punti in cui effettuare le verifiche, in funzione della struttura del laboratorio 7

11 stesso, del tipo di strumenti presenti, e dell impatto che possono avere in termini di rischio di contaminazione alcuni passaggi di lavorazione, la presenza di personale o di altro materiale. La conta microbiologica deve essere effettuata comunque all interno degli incubatori. Frequenza dei controlli E consigliabile una frequenza semestrale. In caso di eventi particolari (contaminazioni, installazione di nuove apparecchiature, nuovo personale) sarà cura del responsabile del laboratorio attivare i controlli senza attendere la scadenza semestrale. La frequenza deve comunque essere stabilita anche sulla base del volume di attività svolta nel laboratorio. In caso ci si appresti a fare la rilevazione in un nuovo laboratorio o per la prima volta, sarebbe opportuno effettuare rilevazioni ravvicinate nel tempo, in presenza di processazioni analoghe e uguale composizione dello staff di laboratorio, per poi decidere una tempistica sulla base dei risultati ottenuti. Al fine di una significatività statistica, dovrebbero essere campionati per questa fase iniziale di convalida almeno tre punti per ogni controllo. Se la verifica di grado non risultasse idonea (per la conta particellare e/o per la carica microbica), verrà eseguita una manutenzione straordinaria degli ambienti fino al ripristino delle condizioni richieste, che devono essere documentate. Gli eventuali ceppi microbici rilevati sono identificati. Vengono di seguito riportate, come esempio, le piantine di due laboratori di PMA con le specifiche dei punti di campionatura per il controllo particellare e microbiologico. 8

12 9

13 C C Controlli microbiologici (aria) Controlli microbiologici (superfici) Controlli particellari Controlli particellari C 10

14 Strutturazione di un laboratorio di PMA La strutturazione di un nuovo laboratorio di PMA dovrebbe prevedere determinate caratteristiche per facilitare il rispetto dei limiti imposti per legge. In fase realizzativa, il laboratorio di PMA dovrebbe essere progettato in maniera tale da facilitare la pulizia, e quindi, per esempio, con pareti a superficie liscia e regolare con raccordi con il pavimento arrotondati, prese elettriche da incasso, controsoffitti sigillati, lampade complanari. Per evitare alte concentrazioni di VOC (Volatile Organic Compounds) nell aria all interno del laboratorio, bisognerebbe tener conto del tipo di colle e di vernice utilizzate (basse emissioni di VOC). Per mantenere una qualità dell aria controllata non devono esserci aperture verso l esterno (finestre). E auspicabile che nel locale sia ridotta il più possibile la presenza di superfici o di recessi in cui possa accumularsi polvere, così come dovrebbe essere introdotto nel locale solo il materiale di volta in volta necessario per la lavorazione, evitando quanto più possibile il deposito anche di documenti cartacei. La disposizione della strumentazione deve essere tale da permettere facilmente la pulizia sia degli ambienti che degli strumenti stessi. Il laboratorio dovrebbe essere ubicato in contiguità con la sala adibita ai prelievi degli ovociti per consentire un passaggio diretto delle provette contenenti il liquido follicolare in laboratorio. L aerazione dovrebbe essere strutturata in modo che, all interno del laboratorio, la pressione dell aria sia superiore a quella dei locali adiacenti meno puliti, con una differenza di almeno 10 pascal, al fine di creare un flusso di aria a pressione positiva dall interno verso l esterno. L aria dovrebbe essere immessa in laboratorio dopo che è stata sottoposta ad un filtraggio con filtri assoluti ad alta efficienza (HEPA: High Efficiency Particulate Air con un filtraggio aria del 99.97% e che trattiene particelle con diametro >0.3µ; oppure ULPA: Ultra-Low Penetration Air con un filtraggio aria del % e che trattiene particelle con diametro >0.12 µ). Per ridurre la percentuale di VOC, sia nell aria del laboratorio che all interno degli incubatori, 11

15 è possibile utilizzare un ulteriore sistema di filtraggio a base di carbonio attivato e permanganato di potassio. Altrettanto importante è il ricambio dell aria. Facendo riferimento alle normative EN ISO , il numero di ricambi di aria/ora nella classe ISO 8 (che, come detto, corrisponde al grado D delle GMP) dovrebbe essere 10. Per quanto riguarda i valori di temperatura ambiente, questi dovrebbero essere compresi tra 20 C e 24 C, mentre l umidità dovrebbe essere compresa tra il 40% ed il 60%. Bibliografia EU Guidelines to Good Manufacturing Practice (GMP) Annex 1 (update 2008) UNI EN ISO Cleanrooms and associated controlled environments UNI EN ISO Cleanrooms and associated environments- Biocontamination control Manuale per le Banche dei Tessuti (I edizione settembre 2009) 12

16 CAPITOLO 2 ACCESSO AL LABORATORIO, FLUSSI DI ENTRATA/USCITA DI PERSONALE E MATERIALI Lucia De Santis Laboratorio Scienze della Natalità, Ospedale San Raffaele, Milano

17 Il laboratorio di Fecondazione Assistita costituisce il cuore dove si svolge la parte più delicata dell attività di un centro per la cura dell infertilità. Pertanto rivestono una grandissima importanza gli aspetti legati alla gestione degli accessi (e conseguenti uscite) sia per quanto concerne il personale che il materiale. Affinché i flussi possano essere gestiti adeguatamente in piena conformità a quanto suggerito dai documenti di riferimento nazionali ed internazionali pre-esistenti (EUTCD 2004/23, DE 2004/23/CE, DE 2006/17/CE, DE 2006/86/CE, DL 191 e DE 2006/17 e 86) che regolano la donazione, la lavorazione ed il trasferimento di cellule e tessuti all interno della Comunità Europea, è necessario che il laboratorio sia dotato di un layout funzionalmente adeguato (Vedi CAP 1). La Società Europea di Riproduzione Umana ed Embriologia (ESHRE), ha pubblicato nel 2008 un esaustivo documento - ESHRE guidelines for good practice in IVF laboratories - (Magli et al. 2008) che sintetizza bene i punti della normativa tessuti che coinvolgono un centro di riproduzione assistita; tuttavia il documento manca di alcuni dettagli pratici che dovrebbero rispondere alle domande degli operatori in special modo riguardo a punti specifici quali, appunto, i flussi di entrata ed uscita, di personale e materiali con particolare riguardo alle limitazioni, all abbigliamento ed al comportamento. LIMITAZIONI L accesso al laboratorio deve essere di norma limitato alle sole persone direttamente coinvolte nell attività. Qualora ci sia la necessità di far accedere personale o persone esterne, devono essere messe in atto tutte quelle procedure che limitino il più possibile l eventualità di introdurre, anche se involontariamente, perturbazioni esterne di tipo contaminante o che influiscano sul processo lavorativo (introduzione di patogeni, perturbazione dei flussi di aria, urto con strumentazioni o personale che maneggia gameti o embrioni). Durante l attività clinica è frequente che il personale medico od ostetrico/infermieristico debba accedere al laboratorio ovvero che durante le procedure di prelievo ovocitario e trasferimento

18 embrionario lo stesso personale entri in laboratorio ove esista una contiguità tra i due ambienti laboratorio e sala. Quando questo avviene è importante che l abbigliamento del personale che proviene dalla sala operatoria sia conforme alle richieste dell ambiente di laboratorio (anche se teoricamente queste dovrebbero essere coerenti, garantite e soprattutto rispettate). E necessario sottolineare questo aspetto poiché non è infrequente che il personale ausiliario di sala, ma spesso anche i medici, si rechino con le medesime calzature ed abbigliamento in aree esterne o in ambulatori ove sussistono condizioni ambientali fortemente diverse da quelle richieste nel laboratorio di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Negli anni passati è stato spesso suggerito l utilizzo di tappetini adesivi (detti tacky mats o sticky mats) all ingresso del laboratorio. L utilizzo, però è utile e finalizzato alla sola rimozione di elementi adesi alla superficie delle calzature ma non riveste alcun ruolo nel controllo di tipo infettivo/contaminante. A questo proposito va ricordato che la letteratura in merito non è recente e che già con la fine degli anni novanta il ruolo dei tacky mat è stato ridimensionato (Traore, Eschapasse, and Laveran 1997) così come è avvenuto recentemente rispetto all uso dei telini sterili plastificati rispetto alla teleria standard ipotizzati inizialmente come elementi in grado di ridurre le infezioni chirurgiche (Webster J 2011) (Rutala and Weber 2001). Limitazioni estremamente severe debbono essere stabilite per l ingresso dei materiali nell area di laboratorio. Posto che il laboratorio deve essere dotato di arredi consoni ed in linea con le esigenze di qualità ambientale e sanificazione dei locali (vedi CAP 1, 3 e 5), occorre ricordare che all interno del laboratorio devono giungere le confezioni di materiali necessari alla routine di breve periodo. Lo stoccaggio delle scorte dovrebbe avvenire in un deposito collocato fuori dall area chirurgica e di laboratorio. In ogni caso le confezioni che giungano direttamente dalle spedizioni (imballi di cartone, plastica rigida e polistirolo con o senza elementi raffreddanti all interno) non devono MAI essere introdotti all interno del laboratorio. Il carico/scarico delle quantità a magazzino deve essere effettuato in questa fase esternamente all area laboratorio o successivamente solo registrando le bolle di consegna. In casi eccezionali - ove l imballo debba fino all ultimo rimanere a protezione del materiale - è necessario che la confezione sia pulita esternamente e che non venga mai comunque appoggiata ai piani di lavoro; per nessuna ragione deve essere disperso in laboratorio il polistirolo o

19 l espanso antiurto poiché essendo molto elettrostatico tende ad attaccarsi alle superfici. Il materiale tolto dall imballo segue poi il percorso destinato all interno degli arredi dedicati o dei frigoriferi e la registrazione secondo le procedure stabilite (vedi CAP 7). All interno del laboratorio (eccetto i contenitori ECO per i materiali di scarto dell attività di PMA, che comunque devono stazionare il meno possibile nell area) dovrebbero essere ridotti al minimo i cestini generici per la raccolta della carta o degli imballi della plasticheria. Nella zona filtro di uscita deve essere posto un idoneo contenitore che accolga il cambio sporco (mascherine, copricapi, camici o sovrascarpe) che si siano indossati entrando; questo punto vale in special modo per gli accessi occasionali di personale che indossa vestizioni monouso e sovrascarpe. ABBIGLIAMENTO Al laboratorio si deve accedere in divisa ospedaliera/da laboratorio con manica lunga e pantalone di lunghezza adeguata, senza però toccare terra. In caso di utilizzo di divisa ospedaliera a manica corta, va indossato sopra un camice in tessuto non tessuto a manica lunga. La divisa non deve avere alcun elemento di sporgenza (es. tasche voluminose o asole) per evitare l involontario aggancio e deve essere realizzata in tessuto liscio a basso rilascio di fibre. E infatti noto che le telerie spesso generano con lo strofinio una dispersione di fibre che si depositano sui piani di lavoro e sulle strumentazioni. E per questo motivo che anche la copertura di strumentazioni ed arredi dovrebbe essere realizzata con apposite coperture (specie i microscopi e le apparecchiature ottiche o che si riscaldino facilmente) che non provochino eccessivo pulviscolo. In questa sede è opportuno ricordare che le divise, come pure i camici in cotone tipo medico, NON sono dispositivi di protezione individuale (DPI); nello svolgimento delle attività sanitarie o di ricerca, laddove si prefigurasse una contaminazione biologica, l'abbigliamento deve essere protetto da idonei DPI (camice monouso). Non esistono al momento requisiti normativi specifici sulle divise, ma il loro utilizzo come abbigliamento dedicato dovrebbe ritenersi auspicabile, se non addirittura obbligatorio, a fini igienici e di confort, limitando il camice medico alle attività che si svolgono fuori dal laboratorio.

20 Più in generale, l uso delle divise e dei camici dovrebbe essere limitato alla attività e mantenuto pulito evitando situazioni di possibile contaminazione (cibo, bibite, terra, erba, polvere o fango, ). Sebbene queste raccomandazioni possano apparire ridondanti, questa indicazione non è per nulla scontata dal momento che è esperienza comune doversi confrontare con le esigenze correlate ai cambi di abbigliamento e calzature sia nella routine lavorativa (entrando ed uscendo dal laboratorio) sia nello spazio extralavorativo (pranzo/pausa caffè). Le divise dovrebbero essere fornite a tutti coloro che lavorano in laboratorio (con l evidente eccezione dei laboratori con livello di biosicurezza 1) indipendentemente dal ruolo e dal tipo di contratto ma è altresì essenziale (non solo per l applicazione della normativa in oggetto, ma in ottemperanza al D. Lgs. 81/08) che l'operatore, durante una qualsiasi attività che lo espone ad un rischio biologico/di manipolazione, indossi gli idonei Dispositivi di Protezione Individuale. Nel caso si verifichi una contaminazione accidentale dell'abbigliamento è necessario che l operatore provveda subito al cambio della divisa e questa evenienza pone la necessità di disporre di un sistema in grado di garantirne un numero idoneo di capi ed una loro efficiente fornitura. A questo scopo possono essere disposte anche divise monouso. Ovviamente situazioni particolari possono essere valutate nello specifico, e possono comportare la necessità di una dotazione più consistente. Un capitolo a sé merita il tema dell abbigliamento che gli operatori sanitari dovrebbero indossare per la pausa pranzo e che per brevità riassumerei in questi termini: l'accesso ad una mensa/bar da parte degli operatori del laboratorio dovrebbe avvenire esclusivamente in abiti borghesi anche se il reale rischio biologico alimentare legato all'abbigliamento di lavoro indossato (divise e camici), sia per il lavoratore stesso sia per i commensali, è difficile da stimarsi, ma sicuramente è molto basso. Pur non essendoci nessun dato scientifico comprovante le raccomandazioni sopra esposte non dobbiamo dimenticare che, pur se non dotati di un abbigliamento che preveda il lavoro in sterilità (come avviene al tavolo operatorio), gli operatori del Laboratorio di PMA lavorano di fatto in un ambiente assimilabile a quello di una sala operatoria e pertanto va ricordato che normativamente gli operatori delle Sale Operatorie (es. per la Lombardia vedi Delib. G.R. 17 dicembre 1999, n. 6/47077) non possono accedere alla mensa con la divisa di Sala Operatoria; da qui la forte raccomandazione. Rientrano nelle indicazioni riguardanti l abbigliamento anche l uso di calzature idonee e pulite nonché

21 l utilizzo di copricapi, mascherine e guanti. Calzature E evidente come le calzature rientrino tra i maggiori veicoli di introduzione di patogeni e più in generale di contaminanti in qualunque ambiente. Tuttavia la letteratura ha altresì dimostrato come anche l utilizzo di calzature dedicate in sala operatoria non garantisca affatto l eliminazione del rischio infettivo (Amirfeyz et al. 2007). Un dato consolidato della letteratura invece stigmatizza l utilizzo delle sovrascarpe ritenendole addirittura inutili (Weightman and Banfield 1994). Di fatto le sovrascarpe sono da destinarsi ad eventuali ingressi sporadici o per i visitatori occasionali ma non possono ritenersi idonee al permanere nella routine lavorativa sia per il loro rapido deteriorarsi (il che comporta comunque un loro rinnovo molto frequente e l utilizzo di sottostanti calazature comunque pulite nell evenienza di una rottura) sia per il discomfort dell operatore legato alla mancata traspirazione ed al rischio di inciampo. Infine le sovrascarpe sono sconsigliate all interno del laboratorio di criopreservazione per il rischio connesso alle manovre di manipolazione dell azoto. Pertanto all interno del laboratorio, come per la sala operatoria, sono da prediligersi calzature dedicate costituite da materiali che possano supportare cicli di sterilizzazione (autoclavabili) e che siano confortevoli. Si sconsiglia quindi l uso di zoccoli di legno e pelle in favore di calzature di gomma in senso lato che rispondano ai requisiti di cui sopra. L area di cambio calzatura deve essere adiacente all ingresso dell area pulita del laboratorio dove si trovano anche gli altri presidi. Cuffie Non occorre dilungarsi sull importanza di mantenere sempre coperta la capigliatura durante le attività che si svolgono nel laboratorio di PMA (come durante qualunque altra attività che si svolga nell adiacente area chirurgica). Nel caso delle donne i capelli lunghi dovrebbero essere ulteriormente raccolti sotto la cuffia. E opportuno servirsi delle cuffie di carta/ tessuto non tessuto tipicamente in uso nelle aree chirurgiche (ma non è richiesta la versione con il soggolo) e limitare quelle in stoffa che, pur essendo molto gradevoli coreograficamente e meglio tollerate da alcuni soggetti, inevitabilmente non possono essere lavate giornalmente. Inoltre i copricapi di stoffa non possono essere assimilati a

22 DPI e pertanto non possono essere utilizzati quando sia necessario operare non solo con protezione verso terzi e nel rispetto della procedura in corso, ma quando venga richiesta una protezione individuale (es trattamento di campioni infetti). Mascherine La mascherina andrebbe sempre indossata durante tutte le fasi delle procedure al fine di evitare la dispersione aerea di possibili contaminanti. E essenziale ribadire che, per svolgere la sua funzione, la mascherina va indossata coprendo il naso e va allacciata sopra il copricapo/cuffia. Si può eventualmente derogare dall utilizzo della mascherina solo durante l esecuzione delle micromanipolazioni ICSI poiché si lavora comunque fuori cappa e sott olio. La mascherina va rinnovata relativamente spesso e si dovrebbe evitare, a tutela anche della propria igiene di abbassarla, compiere attività differenti (come compilazione, archiviazione, spostamento di materiali) e poi re-indossarla. Le mascherine dotate di visiera dovrebbero essere utilizzate sempre per la preparazione dei campioni infetti ma non sono richieste dalla routine. Viene spesso lamentato che la mascherina, specie nei soggetti che indossino occhiali da vista, ma non solo, generi appannamento alla visione al microscopio. Questo disagio può essere evitato utilizzando mascherine dotate di spugna sulla forcella del naso, ma in nessun caso può essere adotto a pretesto per mantenere la stessa slacciata inferiormente o per mantenerla abbassata sulle narici. Guanti I guanti dovrebbero essere indossati durante l esecuzione di tutte le procedure per cui sia richiesta una protezione individuale o del campione. I guanti devono essere powder free e devono arrivare a metà avambraccio. I guanti che arrivano al livello del polso possono essere impiegati in qualsiasi pratica di pulizia, spostamento di materiali o campioni. I guanti devono essere cambiati frequentemente e comunque ad ogni inizio e fine procedura e ogni qual volta vengano in contatto diretto con il materiale biologico (sangue/sperma/fluido follicolare/muco vaginale) per evitare il rischio di contaminare oggetti o superfici. Per il loro utilizzo nella gestione dei campioni infetti si rimanda al capitolo dedicato. Alcune procedure di laboratorio in PMA possono essere eseguite senza

23 guanti purché si sia proceduto ad una corretta igiene delle mani (vedi più sotto). Igiene e cosmesi della persona e delle mani Non esisto dati strutturati in letteratura sulla nocività dell utilizzo di profumi, trucco o smalto per unghie sebbene sia tradizionalmente riportato che, in particolare il profumo, vada evitato nell attività del laboratorio PMA. Per gli uomini che hanno a barba o i baffi, è importante che siano coperti sempre da mascherina. Quello che però deve essere ricordato è che, come in ogni situazione, deve essere applicata una buona regola di pratica igienica ed il buon senso comune (Pratt et al. 2007). Un trucco eccessivamente pesante, che comporti il rischio di caduta o deposito di polvere di ombretto, mascara o matita sul piano di lavoro e sugli oculari del microscopio deve essere evitato, così come vanno evitate dosi eccessive di profumo che possono disturbare i colleghi ed i pazienti anche in considerazione degli spazi ristretti nei quali spesso si opera. Un capitolo a sé va invece riservato alle unghie in senso più generale. Per la sicurezza del materiale manipolato e della propria igiene le unghie in laboratorio devono essere mantenute corte e pulite. Lo spazio sub-ungueale costituisce infatti un ricettacolo di patogeni. Il lavaggio delle mani deve avvenire con prodotti adeguati (in commercio ve ne sono numerosi, anche per i soggetti allergici) che oltre alla detersione offrano anche un attività batteriostatica. Il lavaggio deve essere frequente nel proprio ed altrui interesse e comunque al biologo di laboratorio non è richiesto il lavaggio chirurgico delle mani inteso in senso stretto. Durante l attività clinica (vedi anche sottocapitolo successivo) occorre togliere i monili dalle mani e dai polsi (anelli e bracciali); sarebbe preferibilmente eliminare anche l orologio. I pendenti alle orecchie dovrebbero essere tolti o coperti dalla cuffia mentre non ci sono restrizioni ad indossare girocolli (ovviamente non collane che intralcino l attività. I monili in generale costituiscono una fonte di incorporazione di patogeni che poi vengono trasportati sulle superfici ed all interno degli incubatori ed infine possono costituire un vettore infettivo che l operatore si porta fino a casa. COMPORTAMENTO: come ci si muove sotto cappa in ambiente A+D Come si evince dalla lettura del lavoro di Vonesch (Vonesch et al. 2006) Il rischio da agenti biologici

24 si configura in qualunque tipo di laboratorio, sia esso didattico o di ricerca. Riguardo alla classificazione dei laboratori il DPR 14 gennaio 1997 classifica i laboratori suddividendoli in: 1. laboratori generali di base: ad organizzazione semplice ed unitaria, svolgono indagini nell ambito della biochimica clinica e tossicologica, dell ematologia ed emocoagulazione, dell immunoematologia, della microbiologia; 2. laboratori specializzati: esplicano indagini diagnostiche monospecialistiche ad elevato livello tecnologico e professionale nell ambito della biochimica clinica e tossicologica, dell ematologia ed emocoagulazione, dell immunoematologia, della microbiologia, della virologia, della citoistopatologia, della biologia molecolare e della genetica; 3. laboratori generali di base con settori specializzati: sono laboratori ad organizzazione complessa che, per carico di lavoro, per varietà di tipologia analitica e complessità dei quesiti diagnostici posti, necessitano di un articolazione in unità operative o moduli specializzati e della disponibilità di tecnologie di livello superiore e di competenze professionali particolari. Possono svolgere indagini diagnostiche nell ambito degli specifici settori di cui ai punti 1 e 2. La tipologia di prestazioni eseguite nei diversi laboratori nonché la dotazione strumentale hanno un diverso grado di complessità commisurato alla realtà sanitaria e alla tipologia di quesiti diagnostici posti al laboratorio. Data questa distinzione è evidente che il laboratorio di PMA si collochi tra la tipologia 2 e la 3. Per le attività che attengono alla PMA non è necessario indossare un camice sterile poiché non si effettua una vera strumentazione chirurgica né si manipola con requisiti di sterilità assoluta, tuttavia sotto cappa occorre mantenere una pulizia adeguata di mani e braccia (ove richiesto guanti) e va scoraggiato l utilizzo di qualsiasi altro indumento che non siano la divisa a maniche corte (che presuppone comunque l utilizzo lavorando sotto cappa di guanti lunghi) o il camice monouso a maniche lunghe. Non è ammissibile indossare nel laboratorio il camice medico o giacche tipo felpe. Questi indumenti, generalmente provenienti dall esterno o utilizzati fuori dal laboratorio introducono all interno del laboratorio stesso e sotto cappa un rischio importante di contaminazione (per i dettagli sui passaggi di classe si veda CAP 1). Inoltre le maniche (eccetto quelle strette a polso) costituiscono un rischio di intralcio o involontario urto del materiale sotto cappa. Tutti i movimenti sotto cappa devono svolgersi con pacatezza evitando spostamenti bruschi ed alzate improvvise. Quando dalla cappa ci si sposta portando con sé piastre e provette è necessario verificare che nessuno stia

25 passando alla spalle, spostare prima la seduta (che dovrebbe essere sempre dotata di rotelle in materiale facilmente sanitizzabile) e solo successivamente alzarsi. Quanto ai materiali (boccette, provette, piastre, pipette...etc), questi devono essere macroscopicamente puliti ma non è richiesta una disinfezione esterna delle confezioni che (vedi al punto 1 del presente capitolo) devono comunque essere introdotte in laboratorio (sia negli armadi che nel frigorifero) già tolte dall imballo e prive di residui esterni di trasporto. Una cura particolare va posta al pipettatore automatico che, quando viene introdotto sotto cappa, deve essere dotato di batteria autonoma in modo da non portare nello spazio protetto di lavoro in flusso laminare il filo di alimentazione. Per tutte le procedure di pulizia e sanificazione si rimanda al CAP 3. Ringraziamenti Per la stesura di questo capitolo devo un giusto e sentito ringraziamento al mio collega ed amico Matteo Moro per la sua instancabile attività a capo del servizio CIO (Comitato Infezioni Ospedaliere) di questo istituto e per il costante incoraggiamento e supporto tecnico-scientifico BIBLIOGRAFIA Amirfeyz, Rouin, Andrew Tasker, Sami Ali, Karen Bowker, and Ashley Blom Theatre Shoes a Link in the Common Pathway of Postoperative Wound Infection?. Annals of the Royal College of Surgeons of England 89 (6) (September 1): doi: / x Magli, M C, E Van den Abbeel, K Lundin, D Royere, J Van der Elst, L Gianaroli, for Committee of the Special Interest Group on Embryology Revised Guidelines for Good Practice in IVF Laboratories. Human Reproduction 23 (6) (April 11): doi: /humrep/den068. Pratt, R J, C M Pellowe, J A Wilson, H P Loveday, P J Harper, S R L J Jones, C McDougall, and M H Wilcox Epic2: National Evidence-Based Guidelines for Preventing Healthcare-Associated Infections in NHS Hospitals in England.. The Journal of Hospital Infection 65 Suppl 1 (February): S1 64. doi: /s (07) Rutala, W A, and D J Weber A Review of Single-Use and Reusable Gowns and Drapes in Health Care.. Infection Control and Hospital Epidemiology : the Official Journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America 22 (4) (April): doi: / Traore, O, D Eschapasse, and H Laveran A Bacteriological Study of a Contamination Control Tacky Mat.. The Journal of Hospital Infection 36 (2) (June): Vonesch, N, P Tomao, S Di Renzi, S Vita, and S Signorini La Biosicurezza Nei Laboratori Per Gli

26 Esposti Ad Agenti Biologici. G Ital Med Lav Erg 28 (4): Webster J, Alghamdi A Use of Plastic Adhesive Drapes During Surgery for Preventing Surgical Site Infection (January 1): Weightman, N C, and K R Banfield Protective Over-Shoes Are Unnecessary in a Day Surgery Unit.. The Journal of Hospital Infection 28 (1) (September): 1 3. Letture suggerite ed approfondimenti - EUTCD 2004/23, DE 2004/23/CE, DE 2006/17/CE, DE 2006/86/CE, DL 191 e DE 2006/17 e 86 D. Lgs 16/ ESHRE position paper on the EUTCD EC/2004/23, ESHRE Website Nov Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n Attuazione delle direttive n. 88/320/CEE in materia di ispezione e verifica della buona prassi di laboratorio (G.U. n. 40 del ) - Decreto Legislativo 4 dicembre 1992, n Attuazione della direttiva 89/686/CEE del Consiglio del 21 dicembre 1989, in materia di ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative ai dispositivi di protezione individuale (G.U. n. 289 del 9 dicembre 1992, Supplemento Ordinario). - Decreto 5 agosto Ministero della Sanità - Disposizioni relative all ispezione e verifica della buona prassi di laboratorio in recepimento delle direttive 1999/11/CE e 1999/12/CE (G.U. n. 241 del ). - Decreto del Ministero del Lavoro e della Previdenza Sociale del 12 novembre Modificazioni all allegato XI del Decreto Legislativo 19 settembre 1994, n. 626, recante attuazione di direttive comunitarie riguardanti il miglioramento della sicurezza e della salute dei lavoratori sul luogo di lavoro (G.U. n. 21 del 27 gennaio 2000). - D. Lgs 81/08 - Direttiva 2000/54/CE del Parlamento Europeo e del Consiglio del 18 settembre 2000 relativa alla protezione dei lavoratori contro i rischi derivanti da un esposizione ad agenti biologici durante il lavoro. - CDC USA Siegel JD, Rhinehart E, Jackson M, Chiarello L, and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee, 2007 Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings, June *

27 - CDC USA Guideline for Environmental Infection Control in Health-Care Facilities, OSHA Standards: laundry - Sito Ministero della Salute italiano

28 CAP 3 PULIZIE E SANIFICAZIONE DEI LOCALI E DELLE ATTREZZATURE Roberta Barbaro Rosanna Ciriminna A.M.B.R.A. NUOVA CASA DI CURE DEMMA, PALERMO 1

29 Introduzione Per mantenere la qualità dell aria richiesta negli ambienti a contaminazione controllata e per garantire la sicurezza degli operatori e dei prodotti, e quindi dei pazienti, è indispensabile un adeguata pulizia e sanitizzazione dei locali di processazione. Risulta, quindi, necessario predisporre e mettere in atto procedure specifiche mirate a bilanciare da un lato il bisogno di lavorare in un ambiente pulito decontaminato e dall altro il rischio di esporre i gameti e gli embrioni ad agenti potenzialmente tossici o mutageni. Inoltre, la lavorazione di tessuti e cellule a contatto con un ambiente di specifica qualità e pulizia dell aria è assolutamente indispensabile per minimizzare i rischi di contaminazione incrociata o contaminazione da parte di microrganismi (Allegato V Sezione D Punto 2 D.Lgs16/2010). Tutto questo aspetto deve essere descritto nelle procedure del laboratorio di PMA e far parte del programma di formazione degli operatori (Allegato V Sezione D Punto 9 D.Lgs16/2010). Questo capitolo affronta la tematica relativa alla pulizia e sanificazione del laboratorio di PMA, includendo anche la pulizia e disinfezione degli apparecchi e strumenti critici situati nel locale (Allegato V Sezione C Punto 4 D.Lgs16/2010). Infatti, tutte le attrezzature possono essere punti di raccolta di sporcizia e quindi possono rappresentare una fonte di potenziale contaminazione. Materiali occorrenti Per le procedure di pulizia e sanitizzazione si adoperano i detergenti, disinfettanti ed attrezzature varie (bastoni, aste, strofinacci, panni antirilascio monouso, etc.). Queste ultime devono essere di materiale pulibile, sterilizzabile in autoclave e dedicate all area di utilizzo. Di seguito sono descritte le classi di disinfettanti di uso più frequente nella routine dei protocolli di pulizia nei laboratori di PMA. Sono riportate anche informazioni generali sulle loro applicazioni e sulle precauzioni di sicurezza. E importante tener presente che la pulizia preventiva è essenziale per realizzare una corretta disinfezione e che molti prodotti germicidi sono attivi solamente su oggetti puliti. I tempi di contatto per i disinfettanti sono specifici per ogni singolo prodotto e marchio di fabbrica, pertanto 2

30 tutte le procedure d uso dei disinfettanti devono essere conformi alle raccomandazioni del fabbricante. I detergenti e disinfettanti impiegati devono essere approvati dalle Funzioni Responsabili del Centro e, per ciascun prodotto, devono essere disponibili, aggiornate ed opportunamente archiviate le relative schede di sicurezza e le schede tecniche (copia delle stesse deve essere fornita anche al personale incaricato per la pulizia del locale). Composti dell ammonio quaternario Molti tipi di composti dell ammonio quaternario sono usati come miscele, e spesso in combinazione con altri germicidi, come l alcol. Hanno buona attività contro le forme vegetative dei batteri e dei virus con involucro lipidico. Alcuni tipi (come il benzalconio cloruro) sono usati come antisettici. L attività germicida di certi tipi di composti dell ammonio quaternario è notevolmente ridotta dalla sostanza organica, dalla durezza dell acqua e dai detersivi anionici, ed è perciò necessaria molta cura nella scelta degli agenti per il lavaggio preventivo quando per la disinfezione si prevede l uso di composti dell ammonio quaternario. Alcoli L etanolo ( alcol etilico, C 2 H 5 OH) è attivo contro le forme vegetative di batteri, funghi, e virus con involucro lipidico, ma non contro le spore. La sua azione sui virus con involucro non lipidico è variabile. Per una più alta efficacia dovrebbe essere usato a concentrazione di circa il 70% (v/v) in acqua, ma concentrazioni più alte o più basse possono risultare inefficaci. Uno dei maggiori vantaggi delle soluzioni acquose di alcoli è che non lasciano residui sugli articoli trattati. Una soluzione acquosa al 70% v/v può essere usata sulla pelle, sulle superfici di lavoro dei banchi e delle cappe di biosicurezza e per immergere piccoli strumenti chirurgici. Gli alcoli sono volatili e infiammabili e non devono essere usati vicino a fiamme libere. Le soluzioni di lavoro devono essere conservate in contenitori idonei ad evitare l evaporazione. Possono indurire la gomma e 3

31 dissolvere certi tipi di colla. Le bottiglie con soluzioni contenenti alcol devono essere chiaramente etichettate per evitarne il trattamento in autoclave. Perossido di idrogeno Come il cloro, il perossido dell idrogeno (H 2 O 2 ) è un forte ossidante ed un potente germicida ad ampio spettro. Però, risulta più sicuro del cloro per l uomo e per l ambiente. Il perossido di idrogeno o è fornito pronto all uso come soluzione al 3%, o come soluzione acquosa al 30% da diluire 5-10 volte v/v con acqua sterilizzata. Le soluzioni di solo perossido di idrogeno al 3-6% hanno potere germicida relativamente lento e limitato. I prodotti ora disponibili contengono altri ingredienti che stabilizzano il perossido, accelerano la sua azione germicida e lo rendono meno corrosivo. Può essere usato per la decontaminazione di superfici del lavoro dei banchi di laboratorio e delle cappe di biosicurezza. Il perossido di idrogeno può essere corrosivo per i metalli come alluminio, rame, ottone e zinco e può anche decolorare stoffe, capelli, pelle e mucose. Gli oggetti cosi trattati devono essere sciacquati accuratamente prima di essere posti a contatto con occhi e mucose. Deve essere sempre conservato lontano dal calore e protetto dalla luce. Routine di pulizia nei laboratori di PMA Generalmente, nella routine dei protocolli di pulizia nei laboratori di PMA viene utilizzato uno dei disinfettanti appartenenti alle classi sopracitate. E riportato, anche se con minore frequenza, l impiego di più disinfettanti usati in combinazione, come ad esempio etanolo e composti dell ammonio quaternario diluiti in acqua sterile. Inoltre, in alcuni laboratori viene impiegato un disinfettante diverso a secondo se il programma di pulizia da eseguire prevede una attività ordinaria o straordinaria. E buona norma eseguire la pulizia straordinaria in un periodo down del laboratorio, cioè quando nessuna coltura in vitro di gameti ed embrioni è in corso. Tra tutti i disinfettanti sopra elencati, l etanolo al 70% risulta essere quello più frequentemente utilizzato da diversi anni. In letteratura, da diversi studi eseguiti per analizzare la quantità dei VOC (composti organici volatili) presente all interno del laboratorio di PMA, è emersa un associazione 4

32 tra le operazioni di pulizia ed il rilascio di contaminanti ambientali (ad esempio isopropanolo), che come è noto possono influenzare negativamente la coltura in vitro di gameti ed embrioni (J. Cohen 1997; Tien-cheng Arthur Chang 2010). Di conseguenza, tra tutti i disinfettanti conosciuti si consiglia di utilizzare i composti dell ammonio quaternario poiché risultano efficaci e soprattutto non tossici per gameti ed embrioni (R. Janssens ESHRE 2007). Modalità Operative Solitamente la pulizia e sanitizzazione della cappa e delle apparecchiature sono effettuate dal personale del laboratorio di PMA, mentre la pulizia dei locali è affidata al personale addetto della Azienda o di società esterne. In ogni caso queste attività devono essere svolte da personale opportunamente addestrato, seguendo procedure operative definite. La ditta di pulizie deve osservare, per l ingresso nel laboratorio di PMA, le stesse norme di comportamento e vestizione e quelle per l introduzione dei materiali previste per il personale del laboratorio e per tutto il materiale che entra e esce dai locali a contaminazione controllata. Le operazioni di pulizia e sanitizzazione non devono essere condotte durante le attività produttive, a meno di eccezioni opportunamente giustificate. Le operazioni di pulizia devono interessare tutte le zone, anche quelle meno accessibili; per la pulizia delle superfici verticali (pareti, porte, finestre, ecc ) è consigliabile iniziare sempre dall alto e dirigersi verso il basso con movimenti verticali, non circolari; per la pulizia dei pavimenti, procedere sempre dal fondo del locale verso l uscita dello stesso secondo strisce parallele; per la pulizia dei soffitti, procedere secondo strisce parallele. E opportuno incominciare la pulizia partendo dalle zone più pulite verso quelle più sporche, in modo che il panno venga a contatto con le zone più pulite nelle condizioni migliori, con movimenti unidirezionali (mai a zig zag o circolari), sovrapponendo fra di loro le passate di circa 2 cm. Durante le operazioni di pulizia bisogna utilizzare, laddove richiesto, gli opportuni D.P.I. (Dispositivi di Protezione Individuale). 5

33 Programma di pulizia La pulizia prevede una attività ordinaria e una attività straordinaria. Per la pulizia degli strumenti e delle superfici del laboratorio si consiglia di utilizzare i composti dell ammonio quaternario poiché risultano efficaci e soprattutto non tossici per gameti ed embrioni (R. Janssens ESHRE 2007). Questi prodotti devono essere utilizzati rispettando le modalità di uso consigliate dalle aziende produttrici al fine di ottimizzarne l efficacia. Pulizia ordinaria Ambiente La pulizia deve iniziare dalle aree più pulite per proseguire successivamente verso le aree più sporche. Il detergente/disinfettante non va applicato sulle superfici da pulire ma sui panni sterili. I panni vanno conservati nella loro confezione e tolti all occorrenza in prossimità della zona da pulire. Il panno, piegato in quattro durante le operazioni, deve essere umido, non impregnato eccessivamente per limitare il più possibile la quantità di residui lasciati sulle superfici. Con frequenza giornaliera e al termine dell attività lavorativa, tutti i contenitori destinati ai rifiuti speciali all interno del laboratorio di PMA devono essere ritirati dal personale incaricato. I sacchi portarifiuti devono essere chiusi senza far fuoriuscire l aria prima di essere tolti dal contenitore e trasportati fuori dal laboratorio. Il programma di pulizia ambientale dovrebbe prevedere una frequenza giornaliera per la pulizia dei pavimenti ed una semestrale per le pareti, soffitti, scaffali, armadietti e lampade. Piani di lavoro Le operazioni di pulizia ordinaria devono essere effettuate al termine di ogni fase di lavorazione intermedia (in funzione dei processi di lavorazione in corso) e al termine di ogni giornata di lavoro. Per le operazioni di pulizia ordinaria si raccomanda di utilizzare panni a basso rilascio inumiditi con il disinfettante/detergente. 6

34 Cappa La pulizia e disinfezione della cappa si deve effettuare alla fine della giornata lavorativa, inoltre in caso di versamenti accidentali di liquidi biologici ed ogni qualvolta si ritenga necessario (es. al termine di ogni procedura specifica di un paziente). Alla fine della giornata lavorativa si raccomanda di pulire con attenzione il piano di lavoro, le pareti interne ed esterne del vetro, utilizzando dei panni antirilascio monouso sterili e il disinfettante. Inoltre, tutti gli oggetti, incluse le attrezzature che sono all interno della cappa, devono essere decontaminati e rimossi a fine lavoro, poiché i residui delle colture possono generare situazioni di crescita microbica. Al termine di ogni procedura specifica di un paziente (ad esempio tra due prelievi ovocitari di due pazienti diversi) occorre soltanto pulire il piano di lavoro. Si consiglia di seguire scrupolosamente le indicazioni fornite dalla casa produttrice del disinfettante, per quanto riguarda le modalità d uso ed i tempi di contatto. Per quanto riguarda la pulizia più accurata delle cappe, che comprende anche la griglia di ventilazione del flusso laminare e la superficie grigliata sottostante, questa è registrata come intervento ordinario in base ad un programma di manutenzione prestabilito. Il tempo massimo che può intercorrere fra la fine delle operazioni di pulizia e l inizio delle operazione produttive (laddove la cappa sia mantenuta sempre chiusa), senza che sia necessario ripetere la pulizia della cappa, è di 15 giorni. Trascorso questo intervallo di tempo, devono essere effettuate le operazioni di pulizia utilizzando il prodotto previsto. Incubatori: Le operazioni di pulizia ordinaria devono essere condotte almeno con frequenza mensile. Si consiglia di effettuare la pulizia dell incubatore rispettando le istruzioni fornite dal produttore, sia per la routine di auto-sterilizzazione che per la disinfezione manuale ed a spruzzi. In quest ultimo caso, si raccomanda di lasciare agire il disinfettante secondo quanto raccomandato dalla casa produttrice, impiegando sempre panni antirilascio monouso sterili ed acqua sterile. Da quando si effettua la pulizia ordinaria, è opportuno attendere due giorni prima di riutilizzare l apparecchio nella routine clinica, per consentire una corretta stabilizzazione dei parametri, che dovranno essere comunque verificati prima dell inizio dell attività. 7

35 Microscopi In generale, il microscopio deve essere pulito alla fine di ogni giornata di lavoro e, in maniera più approfondita, alla fine di ogni settimana d uso. La pulizia quotidiana consiste nella rimozione della polvere accumulatasi sulle lenti durante la giornata, nella pulizia della superficie del tavolino traslatore e dello sporco raccoltosi sulle lenti esterne degli oculari come conseguenza degli occasionali contatti con palpebre e ciglia. Per questo tipo di pulizia è sufficiente rimuovere la polvere con un pennello molto morbido oppure con un getto d aria compressa come quello che si può ottenere impiegando le bombolette per la pulizia delle macchine fotografiche e delle loro lenti. Per il tavolino occorre utilizzare un panno antirilascio inumidito con la soluzione del disinfettante. La pulizia settimanale prevede più o meno le stesse procedure eseguite però anche all interno dei tubi portaottiche, nella parte inferiore del condensatore, nel revolver portaobiettivi, nella parte inferiore della lente posta immediatamente dopo la fonte luminosa e di quelle parti del tavolino traslatore più "nascoste" e quindi meno facilmente raggiungibili nella pulizia quotidiana. Si consiglia di coprire il microscopio, quando questo non è in uso, con la copertura di plastica che fa parte del corredo di accessori dello strumento; la polvere ambientale è infatti in grado di infiltrarsi in ogni fessura ed apertura del microscopio tappezzando letteralmente le lenti anche nella loro parte inferiore o all interno dei tubi. Centrifuga Non e richiesta una pulizia giornaliera della centrifuga eccetto nel caso di rottura accidentale di una provetta o nel caso di un versamento nella vasca. Settimanalmente o ogni qualvolta sia necessario, pulire il contenitore esterno, la vasca e gli accessori con un panno morbido inumidito con la soluzione del disinfettante prescelto, sciacquare gli accessori con acqua distillata ed asciugarli con carta assorbente soffice. Termoblock Il termoblock viene pulito settimanalmente o all occorrenza mediante un panno inumidito con la soluzione del disinfettante, risciacquando con acqua distillata e asciugando le superfici. 8

36 Frigoriferi La pulizia viene eseguita dall operatore con frequenza semestrale o secondo necessità. Per le pareti esterne é sufficiente una pulizia con un panno asciutto, nel caso di macchie resistenti utilizzare dell acqua calda, eventualmente dei disinfettanti/detergenti neutri, quindi sciacquare bene ed asciugare. Per le pareti interne procedere, ove necessario, allo sbrinamento per il vano congelatore senza sistema No Frost, mediante una spazzola dura senza utilizzare coltelli o altri oggetti metallici. Per la pulizia usare un panno inumidito con la soluzione di disinfettante, sciacquare bene con acqua distillata ed asciugare le superfici. Pulizia straordinaria Questo tipo di pulizia si effettua a seguito di eventi particolarmente inquinanti (manutenzione annuale dei filtri del laboratorio, mancanza di corrente con conseguente blocco dei flussi di aria o altro). Per la pulizia straordinaria si eseguono le stesse modalità della ordinaria. Anche in questo caso si deve fare attenzione a tutta quella apparecchiatura che ha funzioni critiche nella processazione, per la quale devono essere previste le situazioni che richiedono una pulizia straordinaria. Per tutte le apparecchiature le operazioni di pulizia straordinaria possono essere previste: al termine di qualsiasi intervento di manutenzione ordinaria o straordinaria dell apparecchiatura; in caso di rischio di contaminazione, dovuto ad esempio a versamento di liquidi potenzialmente contaminanti, materiali biologici, terreni o altri reagenti implicati nei processi produttivi. 9

37 Tabella riepilogativa esemplificativa di una possibile frequenza delle operazioni di pulizia ordinaria nei laboratori di PMA. LOCALI/APPARECCHIATURE Pavimenti Pareti, soffitti, scaffali, armadietti, lampade, etc. Piani di lavoro Cappa Incubatori Microscopi Centrifuga Termoblock Frigorifero FREQUENZA Giornaliera Semestrale Giornaliera Giornaliera Mensile Giornaliera/settimanale Settimanale/quando necessario Settimanale/quando necessario Semestrale Validazione La validazione delle procedure di pulizia e sanificazione dei locali e delle attrezzature del laboratorio di PMA si effettua mediante analisi microbiologica. Infatti, il controllo della biocontaminazione consente di valutare il grado di pulizia di una determinata area e di tenere sotto controllo le fonti di contaminazione. Per i dettagli sulle modalità del controllo della biocontaminazione si rimanda al capitolo controlli microbiologici del manuale. Documentazione riferita alle Operazioni di Pulizia Devono essere predisposte Procedure e Istruzioni Operative per le operazioni di pulizia e sanitizzazione degli ambienti e delle apparecchiature, che devono essere gestite nel sistema 10

38 gestione qualità del centro di PMA. Deve essere presente un elenco delle apparecchiature critiche. Per registrare le operazioni è opportuno redigere delle schede nelle quali riportare, oltre all operatore che le ha effettuate, la data, il locale, lo strumento a cui ci si riferisce, nonché i prodotti utilizzati (Allegato V Sezione C Punto 4 D.Lgs16/2010). Esempio di scheda per la registrazione delle operazioni di pulizia ambientale DATA E ORA PAVI- MENTI PARETI, SOFFITTI SCAFFALI, ARMADIETTI, LAMPADE ED ALTRO PRODOTTO UTILIZZATO OPERATORE FIRMA 11

39 Riferimenti Norma di riferimento: UNI EN ISO Ambiente di lavoro. G.M.P. = Good Manufacturing Practices J Assist Reprod Genet Mar;21(3):63-4. Cleaning protocols in the IVF laboratory. Elder K, Elliott T. Laboratory Biosafety Manual, terza edizione (2004). Organizzazione mondiale della sanità. Manuale per le Banche dei Tessuti (I edizione settembre 2009) Human sperm survival bioassay to examine toxicity of a new clinical laboratory equipment disinfectant. Tien-cheng Arthur Chang, PhD, ELD, Carlton A. Eddy, PhD, Ethan S. Jacoby, BA, Mario O. de la Pena, BS, Robert G. Brzyski, MD, PhD, and Robert S. Schenken, MD; poster ASRM Ambient air and its potential effects on conception in vitro. Jacques Cohen, Antonia Gilligan, William Esposito, Tim Schimmel and Brian Dale. Human Reproduction vol.12 no.8 pp , Novel sterilizing solution FertisafeTM is effective and non embryotoxic; R. Janssens poster ESHRE Direttiva Europea 2004/23/CE Direttiva Europea 2006/17/CE Direttiva Europea 2006/86/CE D.Lgs n. 191 D.Lgs n. 16 D. Lgs. 85/

40 CAP. 4 GESTIONE ATTREZZATURE E STRUMENTAZIONE, TARATURA E CALIBRAZIONE STRUMENTI Catello Scarica, Roberta Maggiulli, Stefania Romano, Antonio Capalbo, Filippo Maria Ubaldi e Laura Rienzi Centro GENERA, Clinica Valle Giulia, Roma

41 Le strutture sanitarie che erogano servizi di procreazione medicalmente assistita (PMA) devono far fronte a numerose esigenze di diversa complessità tecnica, scientifica ed organizzativa. Una moltitudine di attività che comporta requisiti strutturali, tecnologici, organizzativi e di personale, che si distinguono per la complessità crescente delle strutture che le erogano. La volontà di esprimere dei requisiti minimi per tali strutture è dettata dalla necessità di introdurre un sistema di qualità comune per tutti gli embriologi ed il personale coinvolti nell esercizio della PMA. NORMATIVE, REQUISITI E LINEE GUIDA La European Society of Human Reproduction (ESHRE) nell anno 2000 ha introdotto le prime linee guida che indicano i requisiti minimi per i laboratori PMA, sottolineando la responsabilità dell embriologo nell applicazione corretta e giustificata delle tecniche di fecondazione assistita in laboratorio (Gianaroli et al., 2000). Risulta, dunque, necessaria l introduzione di criteri di qualità, che possano assicurare la gestione del laboratorio, in modo da poter ottenere prestazioni costanti e di elevata qualità. L obbligatorietà di un sistema integrale della gestione della qualità è stata introdotta attraverso la Direttiva del Parlamento Europeo del 2004/23/EC On setting standards of quality and safety for donation, procurement, testing, processing, preservation, storage, and distribution of human tissues and cells (European Union, 2004). Il testo di tale Direttiva fa riferimento a tutti i tipi di tessuti e cellule umani, ivi compresi i tessuti riproduttivi e i gameti. Uno degli aspetti di particolare interesse che si evince dalle linee guida riguarda i requisiti strumentali e la loro gestione in un laboratorio PMA. Nella fattispecie, la pubblicazione di nuove linee guida da parte dell ESHRE nel 2008 (Magli et al., 2008), stabilisce che: L attrezzatura del laboratorio deve essere adeguata al tipo di lavoro eseguita in laboratorio, e deve essere facile da lavare e sterilizzare Tutti i parametri critici degli strumenti devono essere monitorati in maniera costante e devono essere associati ad appositi allarmi

42 Tutti gli strumenti devono essere collegati ad un gruppo elettrogeno ausiliario che possa entrare in funzione automaticamente in caso di mancanza di alimentazione È raccomandato l utilizzo di almeno due incubatori, e le bombole di gas che li alimentano devono essere alloggiate all esterno del laboratorio, e devono essere dotate di un sistema automatico di backup Gli incubatori devono essere puliti e sanitizzati con regolare frequenza Gli interventi di manutenzione ordinaria e straordinaria su tutti gli strumenti devono essere documentati, registrati e conservati in laboratorio Il laboratorio dovrebbe essere attrezzato con dispositivi per il mantenimento della temperatura ideale dei mezzi di coltura, dei gameti, degli zigoti e degli embrioni durante qualsiasi fase del trattamento all esterno degli incubatori (i.e. piani riscaldati, termo block) Tutti i dispositivi deputati al mantenimento della temperatura e della percentuale di CO 2 devono essere sottoposti a verifiche regolari, effettuate con termometri e misuratori di CO 2 e/o ph metri opportunamente tarati. I risultati di tali verifiche, come i valori mostrati dal display di ogni dispositivo in uso, devono essere registrati e conservati in laboratorio I manuali di istruzioni di ogni strumento devono essere disponibili in laboratorio Per ogni strumento dovrebbero essere disponibili istruzioni scritte accessibili per tutti i membri dello staff, al fine di poter indicare le azioni da intraprendere in caso di guasto di uno strumento. Le direttive Europee come recentemente recepite in Italia (Decreto legislativo 16/2010) stabiliscono che: 1. La progettazione e la manutenzione delle attrezzature e i materiali corrispondono alle destinazioni d'uso previste e sono predisposte in modo da minimizzare ogni rischio per i riceventi e il personale. 2. Tutte le attrezzature e i dispositivi tecnici critici sono identificati e convalidati, periodicamente ispezionati e preventivamente sottoposti a manutenzione conformemente alle istruzioni del fabbricante. Le attrezzature o i materiali che incidono su parametri critici di lavorazione o stoccaggio (ad esempio temperatura, pressione, numero di particelle, livello di contaminazione microbica) sono identificati ed eventualmente sottoposti a osservazioni, vigilanza, allarmi e interventi correttivi adeguati per individuarne le disfunzioni e i difetti e per garantire che i parametri critici rimangano costantemente al di

43 sotto dei limiti accettabili. Tutte le attrezzature che dispongono di una funzione di misurazione critica sono tarate su un parametro di riferimento reperibile, qualora esista. 3. Le attrezzature nuove e quelle riparate sono controllate al momento dell'installazione e collaudate prima dell'uso. I risultati dei controlli sono documentati. 4. Periodicamente e' necessario procedere alla manutenzione, alla pulizia, alla disinfezione e all'igienizzazione di tutte le attrezzature critiche e alla registrazione delle operazioni effettuate. 5. Per ogni attrezzatura critica e' necessario disporre di norme di funzionamento, con indicazioni dettagliate di come intervenire in caso di disfunzioni o guasti. I requisiti minimi strumentali per un laboratorio di PMA in Italia sono stati indicati dalle Regioni in applicazione dell accordo Stato Regioni del 11 Novembre 2004, attraverso il Documento Requisiti strutturali, strumentali e di personale per l autorizzazione delle strutture che erogano prestazione di procreazione medicalmente assistita, coadiuvato dal Documento dell Osservatorio del Ministero della Salute Requisiti per la conformità al D.Lgs. 191/2007 nel prelievo, il controllo, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di gameti, zigoti ed embrioni per tecniche di procreazione medicalmente assistita. La Relazione del Ministero della Salute al Parlamento sullo stato di attuazione della Legge contenente norme in materia di Procreazione Medicalmente Assistita del 30 giugno 2005 chiarisce che: In data 11 Novembre 2004, la Conferenza dei Presidenti delle Regioni e delle Province Autonome di Trento e Bolzano ha approvato il Documento: Requisiti strutturali, strumentali e di personale per l autorizzazione delle strutture che erogano prestazione di procreazione medicalmente assistita, quale indicazione per una applicazione omogenea sul territorio, ferma restando la possibilità per le Regioni di individuare ulteriori requisiti anche in riferimento alla specifica normativa regionale in materia. I requisiti minimi tecnologici per un laboratorio PMA di I livello in Italia sono: Cappa a flusso laminare Bagnomaria termostatato Microscopio ottico a contrasto di fase Centrifuga

44 Pipettatrice Eventuale contenitore/i criogenico/i I requisiti minimi tecnologici per un laboratorio PMA di II e III livello oltre a quelli necessari per il I livello sono: n.2 Incubatori a CO 2 Invertoscopio Microscopio ottico Micromanipolatore (applicato adinvertoscopio) Stereomicroscopio Centrifuga Sistema automatizzato programmabile per la crioconservazione di ovociti ed embrioni Adeguato numero di contenitori criogenici Tali indicazioni sono poi state fatte proprie da ogni Regione, che ha potuto integrarle con altre, e recentemente sono state ulteriormente implementate dai requisiti previsti nell ASR del 15/3/2012. ATTREZZATURA E STRUMENTAZIONE Di seguito una descrizione dei principali strumenti specifici richiesti per la PMA:

45 Cappa a flusso laminare verticale di grado A (classe II). Cappe a flusso laminare Tutti il laboratori di PMA, autorizzati all esecuzione di tecniche di procreazione medicalmente assistita di qualsiasi livello (I, II o III), necessitano la presenza e l utilizzo di una cappa a flusso laminare, per poter assicurare la sterilità dell ambiente di lavoro. Per le tecniche di II e III livello il piano di lavoro della cappa deve essere riscaldato (integrato con il piano della cappa oppure sovrastante) e deve essere prevista la possibilità di integrare uno stereomicroscopio al suo interno. Esistono diverse cappe a flusso laminare: Flusso Laminare verticale: classe I: La cappa di prima classe è una cappa la cui funzione principale è di proteggere l'operatore, ma non il campione su cui si opera. L'aria non è filtrata in entrata, ma esclusivamente

46 in uscita. Si tratta di una cappa ventilata aperta frontalment te progettata per la protezionee dell operatore tramite un flusso d aria entrante che non viene rimandata in circolo. classe II: La cappa di seconda classe è una cappa la cui funzione è quella di proteggere sia l'operatoree che il campione, garantendo o condizioni di assoluta sterilità. Tale strumento è caratterizzato da un flusso d aria in ingresso e dalla filtrazione sia s dell ariaa aspirata sia di quella espulsa: il flusso laminare, proveniente dal sovrastante filtro, scende perpendicolarmente al piano di lavoro evitando di investire l operatore, l aria espulsa deve essere filtrata da un secondo filtro. classe III: La cappa di classe terza è una cappa la cui funzione è quella di isolare completamentee l'operatoree dal campione che manipola e non esporlo a rischi di contagio c con virus patogeni. Tale cappa è completamente chiusa ed ermetica: l'operatore manipola gli agenti biologici tramite guanti fissii che lo isolano completamente. Le cappe di classe III filtrano f l'aria sia in entrata che in uscita, tramite 4 filtri: l'aria in entrata è sterilizzata tramite un filtro posto sul retro. L'aria in uscita è sterile grazie al passaggio attraverso 2 filtri, assicurando all'ambiente interno una pressionee negativa. Tali cappe sono adottate in laboratori in cui si manipolano agenti biologici di gruppo IV (come ebola e marburg), non quindi necessarie per la PMA.

47 Schema di funzionamento dellee diverse classi di cappe a flusso laminaree verticale degli Studi di Torino) Flusso Laminare orizzontale: (Università Cappa a flusso laminare orizzonale Schema di funzionamento delle cappe a flusso laminare orizzontale (Sarin.it) Questo tipo di cappe servono solo s ad evitare contaminazioni del d campione e a mantenere un ambiente sterile all' interno della cappa stessa, mentre non garantiscono alcuna protezionee all'operatore, in quanto vienee investitoo direttamente dal flusso di aria (potenzialmentee contaminata) in uscita. Pertanto non si tratta di cappe di sicurezza biologica, in quanto rischiose per l'operatore e l'ambiente. Sono meno costose rispetto alle cappe a flusso verticale e vengonoo

48 utilizzate in attività di laboratorio dove il rischio per l'operatore è limitato o nullo, ad esempio nella preparazione dei mezzi di coltura (non ancora messi in contatto con i campioni biologici). Le cappe a flusso laminare sono provviste di filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air): tali filtri sono realizzati in micro fibra di vetro che garantiscono un elevata purezza dell aria all interno della cappa (per ulteriori approfondimenti consultare il capitolo 1 di questo manuale). Come descritto nel Decreto legislativo 16/2010 la lavorazione dei campioni deve essere sempre effettuata sotto cappa a flusso laminare che garantisca una qualità dell'aria di grado A (come descritto nella guida europea alle buone pratiche di fabbricazione: Good Manufacturing Practice: GMP solitamente tale requisito è garantito da una cappa di classe II), con un ambiente di fondo adeguato alla lavorazione delle cellule, ma almeno equivalente a GMP di grado D. Condizioni ambientali meno rigorose di quelle sopraindicate possono essere accettabili qualora sia dimostrato che il contatto con un ambiente di grado A ha effetti nocivi sulle cellule (flussi d aria abbondanti possono infatti influire sulla temperatura del campione) oppure non sia tecnicamente possibile eseguire il procedimento richiesto in un ambiente di grado A (ad esempio perchè nella zona di lavorazione occorrono attrezzature specifiche non del tutto compatibili con il grado A, per esempio il micromanipolatore per la ICSI). Microscopi I centri PMA di I livello hanno l obbligo di utilizzare un microscopio ottico a contrasto di fase, per la corretta visualizzazione dei gameti maschili. I centri di II e III livello, oltre che del microscopio ottico a contrasto di fase, necessitano di uno stereomicroscopio per lo screening degli ovociti e altre tecniche di fecondazione (FIVET), di un invertoscopio con un micromanipolatore applicato per effettuare la tecnica di inseminazione intra citoplasmatica (ICSI) e per la valutazione degli ovociti ed embrioni. Per ottenere risultati ottimali nell osservazione ed eventualmente nella microfotografia, è fondamentale la perfetta pulizia del sistema ottico dei microscopi utilizzati. È consigliabile rimuovere la polvere dalle lenti degli oculari e del condensatore utilizzando un apposito soffietto.

49 Tutte le lenti che compongono il sistema ottico del microscopio devono essere allineate per consentire una corretta visione del campione. Il microscopio ottico per l analisi del liquido seminale deve essere equipaggiato con obiettivi progressivi che raggiungano almeno un ingrandimento di 400X. Allo scopo di poter visualizzare correttamente le strutture cellulari in un preparato fresco e non colorato, ci si avvale della tecnica della microscopia a contrasto di fase. Questo metodo usufruisce di anelli di fase, indicati con la sigla Ph, uno disposto a livello del condensatore, l altro all interno dell obiettivo. Ad ogni obiettivo corrisponde un anello diverso all interno del condensatore. Questi anelli di fase convogliano i fasci luminosi che colpiscono il campione, aumentando l ampiezza dell onda luminosa di 1/4 di λ. In questo modo si aumenta il contrasto dell immagine riprodotta a livello degli oculari, mostrando strutture cellulari normalmente visibili solo con l utilizzo di una colorazione istologica. Gli anelli di fase devono essere perfettamente centrati tra loro. L invertoscopio si avvale di una particolare tecnica di contrasto di fase che è detta contrasto d ampiezza o Hoffman modulation contrast (HMC). In pratica, il contrasto d ampiezza si realizza ponendo un modulatore opaco sotto al condensatore; tale modulatore contiene una fessura trasparente parzialmente occupata da un filtro polarizzante. Sopra l obbiettivo viene posto un altro modulatore contenente un segmento opaco del tutto periferico ed un altro segmento contiguo semitrasparente. Il tutto su supporto trasparente. Nella pupilla d uscita dell obbiettivo si sovrappongono così la porzione trasparente del modulatore inferiore con la porzione semitrasparente del modulatore superiore, la porzione polarizzante del modulatore inferiore con la porzione trasparente di quello superiore. Viene aggiunto anche un polarizzatore che occupa tutta la pupilla del condensatore e che può ruotare attorno all asse. Questa rotazione rende più o meno brillante il filtro. Di solito, il modulatore inferiore può essere spostato in direzione perpendicolare alla fessura e ciò permette di variare l intensità del fascio illuminante che traversa l obbiettivo. Il contrasto d ampiezza presenta dunque varie possibilità di regolazione. L immagine dell oggetto è formata dall onda diffratta da un lato solo del fascio illuminante poiché quest ultimo si trova ai margini della pupilla d obbiettivo. Inoltre l oggetto non si trova in mezzo ai due polarizzatori e la sua eventuale birifrangenza non disturba. Questo rende possibile l osservazione di oggetti contenuti in recipienti in materia plastica (come le petridish usate in PMA), generalmente birifrangenti.

50 Rispetto ad altre tecniche, il contrasto d ampiezza è forse meno sensibile, ma ha il vantaggio che gli oggetti fuori fuoco non disturbano troppo. Per assicurare una buona resa dello strumento è necessaria una adeguata pulizia, allineamento e centratura del microscopio. Il microscopio viene detto centrato quando i centri ottici di tutte le singole lenti o subsistemi giacciono sulla stessa retta, che diventa, a questa condizione, l asse ottica del sistema. Nel concetto di centratura appena esposto non rientra però la considerazione dell orientamento degli assi ottici delle singole lenti, orientamento che rientra invece nel concetto di allineamento. Un sistema ottico è allineato quando gli assi ottici di tutte le lenti che lo compongono sono paralleli ad un unica direzione, che dovrebbe coincidere con l asse comune di tutto il sistema. Il microscopio invertito usato per la PMA deve essere necessariamente dotato di un piano riscaldato dove viene riposto il campione durante l osservazione per garantirne la stabilità di temperatura. Micromanipolatori Il micromanipolatore è un dispositivo che viene utilizzato per le tecniche di micromanipolazione dei gameti (ICSI) e degli embrioni (Biopsia). Per queste tecniche è necessario raggiungere un tale livello di precisione dei movimenti che non può essere realizzato a mano libera. Lo strumento viene usato per posizionare una micropipetta in maniera estremamente precisa nelle tre dimensioni, spesso con una risoluzione inferiore al µm. In base al meccanismo di funzionamento esistono differenti tipi di micromanipolatori: 1. Pneumatico 2. Idraulico 3. Meccanico 4. Elettrico I micromanipolatori utilizzati in PMA sono principalmente: Micromanipolatore idraulico: Con questo strumento l'operatore è in grado di muovere avanti e indietro il pistone di un cilindro e questi movimenti vengono trasmessi dallo spostamento di un

51 liquido (olio) tra cilindri idraulici di diverso diametro. Questo si traduce in una riduzione dell'ampiezza degli spostamenti.. I movimenti vengonoo pertanto trasmessi ma riprodotti in forma ridotta. Per il correttoo funzionamento di questo dispositivo è fondamentale che tutto il sistema sia riempito d olio e che non ci siano bolle d aria. Ad ogni nuova procedura p il sistema deve quindii essere controllato. Micromanipolatore elettrico: L'operatore opera tramite un apposito joystick che trasforma t i movimentii di una leva manovrata dall'operatore in una serie di segnali elettrici o elettronici che permettono di controllare degli attuatori meccanici. Micromanipolatore. Centro GENERA ROMA. Incubatori L incubatore è uno strumento che simula lee condizioni fisiologichee di temperatura, umidità e ph. Il controllo della temperatura è affidato ad un termostato, quello dell umidità a vaschette o flaskss piene d acqua sterile. Il ph, invece viene controllato in maniera indiretta attraverso la percentuale e di CO 2. La maggior parte dei mezzi di coltura di uso comune sono formulati con bicarbonato di

52 sodio, che dissociandosi in soluzione acquosa, rilascia ioni idrogeno nel mezzo diminuendone il ph. Accrescendo la percentuale di CO 2 dell atmosfera dell incubatore, la concentrazionee degli ionii idrogeno viene indirettamentee controllata attraverso il bilanciamentoo della reazione di dissociazione del bicarbonato di sodio. Questo sistema tampone viene comunemente utilizzato nelle colture cellulari. Per questo motivo gli incubatori tradizionali sono provvisti di appositi sistemi che consentono di impostare e controllare la percentuale di COO 2 desiderata, in funzione della quantità di bicarbonato o di sodio presente nei mezzi di coltura utilizzati, ed a seconda del ph p finale richiesto. Generalmente i mezzi di coltura contengono 25 mm di bicarbonato di sodio ed utilizzando un atmosfera modificata con 5 6% di CO 2, si ottiene un ph di considerato fisiologico per ovociti ed embrioni (Brinster, 1969; Higdon et al., 2008). Il grafico indica l abbassamento del ph nel tempo in funzione di due d diversee percentuali di CO 2. Si noti che con CO 2 al 6% il ph del mezzo raggiunge un equilibrio di 7.3, mentre con CO 2 al 5% si stabilizza intorno ad un valore di 7.4 (COOKK Medical).

53 A titolo esemplificativo, usando i mezzi di coltura di fertilizzazione della COOK, come dimostrato dal grafico una percentuale di CO 2 del 6% permette il raggiungimento di un ph fisiologico per gli ovociti (<7.4) in un tempo notevolmente inferiore (circa 80 min.) rispetto ad una percentuale di CO 2 del 5% (circa 200 min.). Anche se il principio generale vale per tutti i mezzi di coltura, è chiaro che i valori di ph sono invece relativi alla composizione del mezzo stesso. Considerando che l aria atmosferica è composta dal 78% N 2, 21% O 2, 0.94% argon, 0.035% CO 2, e 0.025% di altri gas, è stato messo in evidenza che in un incubatore tradizionale l elevata percentuale di O 2 rispetto alle condizioni fisiologiche, potrebbe esporre gli ovociti e gli embrioni a condizioni di coltura sub ottimali, soprattutto per la presenza di specie reattive dell ossigeno (ROS) (Biggers, 2001; Summers and Biggers, 2003). Questo ha portato all avvento di incubatori, che prevedono il controllo dei tre gas principali dell aria atmosferica, quali N 2, O 2, e CO 2 (o che usano miscele certificate di gas). Tipologie di incubatori. Gli incubatori a controllo esclusivo di CO 2 consentono di regolare il ph dei mezzi di coltura, e come discusso precedentemente, è preferibile impostare la concentrazione di questo gas intorno al 6%. L erogazione del gas agli incubatori avviene attraverso una rampa, la quale termina con un rubinetto dotato di manometro che serve a regolare la pressione del gas distribuito agli incubatori. La pressione di erogazione, il cui valore ideale di aggira generalmente intorno alle 5 atm, è molto importante per il corretto funzionamento dello strumento, e per la sua messa a punto si deve far riferimento alle indicazioni delle aziende che producono gli incubatori. L umidità elevata è controllata attraverso vaschette che vengono riempite con acqua sterile. Un altra tecnologia di incubatori permette di poter controllare anche la concentrazione di ossigeno presente nell incubatore. Come discusso precedentemente questo può essere utile per ridurre la presenza di specie reattive dell ossigeno. Gli incubatori che si avvalgono di questa tecnologia sono gli incubatori a controllo della CO 2 e O 2, e sono dotati di due vie di accesso dei gas, una alimentata dalla CO 2, mentre l altra può essere alimentata dall azoto (N 2 ) se si desidera una concentrazione di O 2 inferiore al 18%, oppure dall O 2 stesso se si desidera che sia concentrato oltre il 22%. Il motivo dell utilizzo dell N 2 per modulare la concentrazione di O 2 sta nel fatto che in atmosfera quest ultimo ha una densità di circa il 21%. Aumentando la concentrazione di N 2 infatti si diluisce la concentrazione dell O 2, in modo da portarlo a concentrazioni più basse di quella atmosferica. Solitamente si cerca di utilizzare una concentrazione di O 2 di circa 5.5%+0.5.

54 Incubatore a controllo di CO2 ed O2. Centro GENERA, Roma Altri incubatori utilizzano un afflusso di gas pre miscelati, in modo da poter essere sicuri all origine che le proporzioni dei diversi tipi di gas siano quelle desiderate. Per questa ragione è

55 fondamentale che la ditta fornitrice dei gas munisca ogni bombola di gas pre miscelato di un certificato che attesti che le proporzioni siano quelle desiderate e ne garantisca l assoluta purezza. Questa tecnologia è utilizzata in particolare dagli incubatori da banco, che utilizzano alloggiamenti per le dish di dimensioni molto ridotte, in modo da ottimizzare i tempi di recupero delle giuste condizioni di coltura dopo ogni apertura degli sportelli. Incubatori da banco a gas pre miscelati. Centro GENERA Roma Numerosi studi hanno dimostrato che la coltura di ovociti ed embrioni a basse concentrazioni di O 2 ha degli effetti positivi a lungo termine rispetto alla coltura con concentrazioni di ossigeno atmosferico (Harlow and Quinn, 1979; Batt et al., 1991; Yuan et al., 2003; Karja et al., 2004; Leoni et al., 2007; Meintjes et al., 2008). Per questa ragione si consiglia l utilizzo di incubatori tri gas, pur non essendo espressamente richiesto nei requisiti minimi. L utilizzo di incubatori è obbligatorio per tecniche di II e III livello. Il documento concordato durante la Conferenza dei Presidenti delle Regioni e delle Province Autonome (Roma 11 Novembre 2004) dichiara indispensabili almeno due incubatori per ciascun laboratorio PMA. E importante sottolineare che il numero di incubatori necessari per garantire buone condizioni di coltura dipende dalle dimensioni degli stessi e dalla mole di lavoro. Vengono richiesti un minimo di due incubatori standard da 140 litri ma generalmente consigliati almeno un incubatore ogni 100 cicli di PMA di II/III livello annui.

56 MANUTENZIONE E TARATURA Per quanto concerne lo stato e la manutenzione della strumentazione la DE 2006/86/CE nell Allegato 1 al punto C richiede: Tutte le attrezzature e i dispositivi tecnici critici devono essere identificati e convalidati, periodicamente ispezionati e preventivamente sottoposti a manutenzione conformemente alle istruzioni del fabbricante. [ ] Le attrezzature nuove e riparate devono essere controllate al momento dell installazione e convalidate prima dell uso. I risultati dei controlli devono essere documentati Le apparecchiature in dotazione ad un laboratorio di PMA devono infatti garantire affidabilità di funzionamento pertanto dovranno essere sempre tenute in perfetta efficienza. Tale efficienza dovrà essere garantita con opportune procedure di manutenzione e di taratura. Possiamo distinguere diverse tipologie di manutenzione: Convalida: procedura atta a dimostrare e documentare che lo strumento sia in grado di fornire le prestazioni conformi alle specifiche ed alle caratteristiche di qualità stabilite dal costruttore. Il processo di convalida di uno strumento è solitamente effettuato al momento dell istallazione e i risultati devono essere registrati in un report di convalida che contenga l analisi dei dati ottenuti, la verifica che i risultati soddisfino i criteri di accettabilità, ovvero le deviazioni riscontrate e le modifiche effettuate per correggerle. Manutenzione ordinaria: è rappresentata dall insieme delle azioni manutentive effettuate su uno strumento o attrezzatura volte a garantirne il corretto funzionamento e a scongiurare l insorgere di rischi per il processo cui sono preposte, senza modificare o migliorare le funzioni svolte dallo strumento stesso (ad esempio la pulizia interna ed esterna degli strumenti). Manutenzione programmata: intervento che viene effettuato a tempi prefissati per evitare decadimenti nel buon funzionamento dell apparecchiatura. Questi interventi sono normalmente affidati alla ditta fornitrice con la quale si stipula un contratto di manutenzione annuale e/o semestrale. Manutenzione straordinaria: intervento effettuato dopo il verificarsi di guasti o malfunzionamenti. Questo tipo di interventi vengono effettuati su specifica richiesta e vengono eseguiti normalmente da un tecnico specializzato della ditta fornitrice dopo che l operatore ha verificato l anomalia di comportamento.

57 Taratura: operazione atta a garantire che lo strumento in uso sia in grado di fornire misure entro i limiti di tolleranza previsti. La definizione si riferisce a quelle apparecchiature che possono fare riferimento a strumenti campioni primari; per le altre può essere intesa come insieme di operazioni finalizzate al controllo del buon funzionamento dell apparecchiatura. Le operazioni di taratura possono essere sostanzialmente riassunte in: verifica che il valore misurato rientri in un range di limiti stabiliti rilevazione dell entità dell errore osservato per usarlo come fattore di correzione eventuale messa a punto dello strumento per ridurre l errore osservato Per ottenere una taratura precisa dell attrezzatura in uso in un laboratorio è necessario quindi monitorare i parametri critici attraverso strumenti di riferimento, quali termometro, analizzatori della percentuale di CO 2 e O 2, e phmetro. Tali strumenti consentono di verificare la taratura degli indicatori posti sull attrezzatura in uso, come gli indicatori di temperatura e CO 2 e O 2, e dimostrano che le apparecchiature in uso in laboratorio funzionano correttamente con i parametri desiderati. Gli strumenti di riferimento devono essere a loro volta tarati verso standard primari e certificati da un ente specifico che ne garantisca l affidabilità (SIT Servizio di Taratura in Italia). Bisogna quindi confrontarsi con la problematica della loro taratura periodica, che deve essere effettuata dal SIT, o da laboratori da esso accreditati, indicativamente ogni 2 anni. Modulistica Ogni informazione utile e operazione effettuata su uno strumento, quale la provenienza, l acquisto, l installazione, il collaudo, le date di ricevimento e messa in funzione, i riferimenti alle procedure di taratura e manutenzione quando necessari, la loro periodicità e i dati del fornitore e dell assistenza tecnica devono essere documentati e annotati su un apposito modulo Scheda apparecchiatura (Allegato 1), specifico per quello strumento, che deve sempre riportare il numero di inventario. Dovrà inoltre essere predisposta inoltre una Scheda di Manutenzione che riporti tutte le operazioni effettuate relative alla verifica, alle sostituzioni, alla pulizia con la data di svolgimento dell operazione e la firma del tecnico che l ha effettuata (Allegato 2). Dovrà essere prevista inoltre una Scheda di Taratura (Allegato 3) su cui verrà riportato il riferimento alla procedura di taratura, il programma di taratura, la data di svolgimento della stessa e della futura taratura, la firma del tecnico e i riferimenti ai campioni primari o materiali di riferimento utilizzati per il controllo (di cui si allega fotocopia del certificato di taratura). Qualora la taratura venga attuata da un centro esterno dovrà essere riportata tutta la documentazione inerente.

58 Un apparecchiatura che, a seguito di taratura, abbia rilevato una non idoneità al suo utilizzo, dovrà essere messa fuori servizio. L evento dovrà essere segnalato apponendo un etichetta visibile sull apparecchiatura e la data in cui l evento è stato rilevato. L apparecchiatura non potrà essere in nessun modo utilizzata fino a quando la riparazione e la taratura di nuovo effettuata non dimostrino che è di nuovo funzionante. L evento dovrà essere riportato sulla scheda di taratura. Vediamo nei particolari come è opportuno programmare la manutenzione dei diversi strumenti specifici: Per le cappe a flusso laminare le normali operazioni di manutenzione programmata (con cadenza almeno annuale) consistono nella sostituzione dei prefiltri secondo le indicazioni della ditta costruttrice, nella pulizia/disinfezione delle superfici interne con opportuni disinfettanti e nel controllo dell efficienza dei filtri. La manutenzione ordinaria (con cadenza quotidiana) prevede la pulizia con appositi detergenti dei piani e delle pareti interne della cappa, e la rimozione della polvere dal sistema di ventilazione. Deve essere effettuata una verifica della presenza di microrganismi nell aria filtrata (vedi capitolo 1). Se le cappe sono dotate di piani riscaldati, questi devono essere tarati mensilmente all inizio dell attività, per poi passare, qualora i risultati siano all interno dei range di accettabilità ad una verifica di taratura quadrimestrale con adeguato strumento di riferimento certificato SIT. L esito della manutenzione programmata e della eventuale taratura dei piani riscaldati devono essere opportunamente registrati nel logbook dedicato ad ogni apparecchiatura. Per quanto riguarda gli incubatori le normali indicazioni d uso prevedono la protezione delle pareti dell incubatore dalla luce solare diretta. È da evitare inoltre l introduzione di grandi quantità di materiale lasciando spazi per permettere la circolazione dell aria. La manutenzione ordinaria prevede pulizia, decontaminazione e rimozione della polvere dal sistema di ventilazione, sostituzione e sterilizzazione delle vaschette d acqua (da effettuare mensilmente). Occorre inoltre controllare quotidianamente i valori di temperatura e di percentuale di CO 2 e di O 2, controllando i valori indicati dal termometro/sonde permanenti installati sull apparecchiatura e visibili sul display. Annotare i risultati su apposita scheda (Allegato 4). I valori si esercizio sono generalmente i seguenti:

59 - Temperatura: 37 C (tolleranza +0.2 C) - CO 2 : 6% (tolleranza +0.2%) - O 2 : 5% (tolleranza +0.5%) La tolleranza per questi parametri è un valore critico da stabilire in funzione delle condizioni fisiologiche cui si tende. Per quanto riguarda la temperatura la tolleranza non può che essere minima, dal momento che anche piccole variazioni di temperatura sono riconosciute come cause di effetti dannosi per i gameti e gli embrioni. La percentuale di CO 2 deve essere funzionale al raggiungimento del ph desiderato, cui contribuiscono diversi parametri quali il tipo di terreno di coltura utilizzato e la temperatura, ed è per questo che la tolleranza della percentuale di questo gas deve essere stabilita in base alle caratteristiche generali di ciascun sistema di coltura. Per quanto riguarda la tolleranza della percentuale di O 2 è importante ricordare che nonostante sia riconosciuto il vantaggio di effettuare la coltura con basse concentrazioni di questo gas, non è ancora del tutto chiaro il valore ideale oltre il quale non bisogna spingersi. Questo comporta che la tolleranza può avere un margine molto più ampio (5 7%). Per la taratura (da programmare, come già detto, mensilmente all inizio dell attività, per poi passare con risultati stabili all interno dei range di tollerabilità, ad una verifica quadrimestrale), e quindi per il controllo del termometro, sonde CO2 e O2 permanenti, bisogna utilizzare strumenti di riferimento certificati SIT inseriti sui diversi ripiani o nelle singole celle, e registrare i valori per un intervallo di tempo di almeno 60 min con frequenze di 6 min, avendo cura di non aprire lo sportello dell incubatore durante l esecuzione del controllo. Come già descritto precedentemente è bene annotare gli esiti del controllo di taratura su apposita scheda, riportando per ogni rilevamento: il valore medio e la deviazione standard delle misure rilevate con il campione di riferimento; il valore letto sullo strumento permanente installato sull apparecchiatura; la deviazione evidenziata; la deviazione massima ammissibile; la data di effettuazione, la data del successivo controllo di taratura e la firma di chi l ha effettuata. Sebbene la misurazione della percentuale di CO 2 sia un metodo indiretto per attestare il ph del mezzo di coltura in uso, si raccomanda di valutare il ph anche con metodo diretto. È stato, infatti,

60 dimostrato che talvolta variazioni della percentuale di CO 2 non si ripercuotono immediatamente sul valore reale del ph del mezzo di coltura (Pool, 2004). Controlli microbiologici È necessario effettuare almeno con cadenza annuale il controllo microbiologico dei ripiani degli incubatori e delle cappe attraverso dei tamponi che dovranno essere esaminati tramite coltura da laboratori autorizzati (per ulteriori approfondimenti consultare il capitolo 1 di questo manuale). I frigoriferi devono essere caricati in modo che l aria circoli liberamente, e in modo da mantenere all interno una temperatura bassa. Devono essere effettuate con cadenza annuale le operazioni che prevedano: rimozione della polvere dalle piastre esterne di aerazione sbrinamento pulizia e decontaminazione dell interno dei frigoriferi e dei congelatori. Controllare inoltre i termometri permanenti installati su frigoriferi e congelatori confrontandoli con un termometro campione di riferimento certificato SIT verificando la taratura della temperatura eseguendo il controllo sui diversi ripiani del frigorifero o del congelatore. Effettuare la registrazione dei dati sull apposito logbook. Per una buona manutenzione dei bagni termostatici è consigliabile effettuare periodicamente il controllo del livello del liquido, monitorare la temperatura del bagno, sostituire l acqua contenuta nella vasca e sanificare la vasca. Controllare annualmente i termometri permanenti installati confrontandoli con un termometro campione di riferimento certificato SIT. Tenere anche per questi apposita registrazione. La manutenzione dei microscopi consiste nella rimozione sia della polvere dagli oculari e dagli obiettivi usando cartine ottiche sia di tracce di olio dagli obiettivi usati per immersione. Controllare saltuariamente la lubrificazione delle parti mobili e sostituire la lampada di illuminazione, quando necessario, seguendo le istruzioni della ditta costruttrice. E necessario inoltre programmare periodicamente (almeno annualmente) centratura ed allineamento delle ottiche.

61 Quando non in uso, il microscopio va tenuto coperto e al riparo dalla luce, per evitare danni alle lenti. Le pipettatrici possono essere manuali, elettroniche, monocanale o multicanale. Quelle manuali sono le più utilizzate all interno dei laboratori. Si consiglia l utilizzo unicamente di puntali monouso; inoltre è opportuno mantenere le pipettatrici a temperatura ambiente, evitare che subiscano urti, tenerle in posizione verticale e procedere ad una regolare pulizia, manutenzione e taratura. Per dispensatore si intendono quelle apparecchiature utilizzate per distribuire terreni di coltura e reagenti in provette, bottiglie o capsule di Petri. È opportuno controllare l accuratezza dei volumi dispensati e, nel caso si debbano distribuire reagenti o terreni sterili, è opportuno controllare che le parti dell apparecchio in contatto con essi siano in condizioni asettiche. Mantenere le apparecchiature in perfette condizioni mediante accurata pulizia dopo ogni ciclo lavorativo, in accordo con le indicazioni della ditta costruttrice. Come già detto i termometri/misuratori CO2 e O2 in utilizzo presso il laboratorio devono essere tarati periodicamente mediante confronto con strumenti certificati da appositi enti. A titolo esemplificativo ci si può dotare di un termometro campione primario fatto tarare ogni due anni da un ente accreditato con cui effettuare tutte le verifiche su incubatori, piani riscaldati, frigoriferi, congelatori. Il phmetro è lo strumento che serve per la valutazione diretta del ph del mezzo di coltura. Gli elettrodi del phmetro devono essere condizionati e conservati secondo le istruzioni del costruttore. Dopo ogni uso devono essere puliti con acqua distillata. La taratura va effettuata periodicamente utilizzando soluzioni tampone di riferimento (ad es., ph 4 eph 7 a 37 ). Le soluzioni vanno conservate nelle migliori condizioni e non oltre la data di scadenza. Le aliquote giornaliere utilizzate devono poi essere scartate dopo la taratura. Va inoltre controllato periodicamente lo stato di efficienza degli elettrodi registrando i valori in mv in corrispondenza delle tarature a ph 4 e ph 7. La differenza tra due misurazioni in rapporto al valore teorico indicato dal costruttore rappresenta un indice di invecchiamento dell elettrodo.

62 ph metro da incubatore: è fornito di una sonda con un supporto nel quale può essere introdotto il mezzo di coltura e inserito in incubatore per valutarne il ph nella camera stessa. Centro GENERA, Roma. Pianificazione Visto l enorme lavoro che richiede la gestione delle apparecchiature in un laboratorio di PMA, la corretta pianificazione delle manutenzioni, delle tarature e della sorveglianza degli strumenti

63 costituisce un requisito fondamentale. In allegato (Allegato 5) un esempio di pianificazione della gestione delle attrezzature. Dispositivi in rete per la misurazione dei parametri critici e allarmi E oggi possibile effettuare la rilevazione in continuum dei parametri critici degli strumenti mediante l utilizzo di datalogger (posizionati all interno degli incubatori, frigoriferi, contenitori di azoto liquido) costituiti da una o più sonde elettroniche collegate ad una centralina che memorizza le misure di uno o più parametri, effettuate ad intervalli di tempo opportunamente stabiliti. Questi sistemi permettono la misurazione, l elaborazione, la comunicazione e la registrazione dei valori dei sensori. Nel caso in cui i valori letti non corrispondano ai range di tollerabilità scattano degli allarmi in modo da permettere un immediata azione correttiva da parte del responsabile del sistema. I sensori possono essere: Sensore di livello per l azoto liquido Pressione del liquido nel tank Sensori di temperatura nei tank Sensori di temperatura per incubatori e frigoriferi Sensori di livello per la CO2 Sensori di livello per O2 Sensori di temperature degli ambienti Umidità dell ambiente Pressione dell ambiente Sensori di movimento e presenza Le reti presenti in commercio possono essere reti cablate o reti wireless. Quest ultime permettono vantaggi dal punto di vista del cablaggio (non necessario); sono quindi più facilmente implementabili. Non vi sono, però, dati in letteratura che garantiscano che il sistema wireless non sia nocivo per le cellule. I sistemi di allarme sono diversi e possono essere acustici e/o visivi, e possono essere collegati con la rete telefonica in modo da poter inviare avvisi al personale responsabile. Tali sistemi possono essere già presenti all interno degli strumenti, come ad esempio gli allarmi acustici che avvisano in caso di apertura prolungata degli incubatori, oppure visivi come gli allarmi luminosi in dotazione di alcuni incubatori che avvisano quando il livello dell acqua è troppo basso.

64 Altri tipi di sistemi di monitoraggio e allarme possono essere istallati successivamente agli strumenti, come nel caso delle sonde che misurano il livello d azoto nelle banche. Conclusioni Il laboratorio di PMA si occupa della inseminazione di gameti e della coltura di embrioni umani, ne consegue una grande responsabilità da parte degli operatori. Si tratta infatti (a differenza dei laboratori diagnostici) di effettuare colture dette ex vivo, ovvero di coltivare cellule in vitro che poi vengono reintrodotte nel corpo materno (in vivo). Non si può escludere che alcuni parametri di laboratorio possano influire non solo sulla vitalità delle cellule durante la coltura ma anche avere effetti a lungo termine sul feto. E ben nota l estrema sensibilità degli ovociti ad esempio a lievi variazioni di temperatura che portano alla depolimerizzazione del fuso meiotico con rischi potenziali sulla successiva segregazione cromosomica. Nonostante l introduzione di nuove tecnologie, le operazioni necessarie a mantenere la stabilità dei parametri critici degli strumenti in uso nei laboratori richiedono tempo e particolari attenzioni. E da considerare anche l estrema sensibilità dei termometri e delle sonde utilizzate per la valutazione delle percentuali dei gas anche a parametri fisici quali temperatura e umidità dell ambiente. Manutenzione, taratura e calibrazione rappresentano quindi indispensabili strumenti per garantire adeguate condizioni di coltura, ottimizzando i risultati e minimizzando i rischi per gli embrioni. L intera gestione dei parametri critici della strumentazione può essere, già oggi, effettuata automaticamente con sonde indipendenti, collegate in rete, con le rilevazioni accessibili anche in back office. Questo porta evidentemente ad una notevole riduzione dei rischi di alterazioni inconsapevoli delle condizioni di coltura. Crediamo che un moderno laboratorio di PMA debba dotarsi necessariamente di sofisticati strumenti di rilevazione, allarmi e registrazione dei parametri critici ed in particolare delle temperature, livelli di CO2, O2 e azoto. REFERENZE 1. Biggers JD. Thoughts on embryo culture conditions. ReprodBioMed Online 2001;4:30 8.

65 2. Brinster RL. In vitro cultivation of mammalian ova. Adv Biosci 1969;4: Brinster RL. Studies on the development of mouse embryos. The effect of osmolarity and hydrogen ion concentration. J Exp Zool 1965;158: Decreto Legislativo 25 gennaio 2010, n. 16 così come modificato dal D. Lgs. 85/2012 "Attuazione delle direttive 2006/17/CE e 2006/86/CE, che attuano la direttiva 2004/23/CE per quanto riguarda le prescrizioni tecniche per la donazione, l'approvvigionamento e il controllo di tessuti e cellule umani, nonche' per quanto riguarda le prescrizioni in tema di rintracciabilita', la notifica di reazioni ed eventi avversi gravi e determinate prescrizioni tecniche per la codifica, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani"pubblicato nella Gazzetta Ufficiale del 18 febbraio 2010, n Decreto Legislativo 6 novembre 2007 Attuazione della Direttiva 2004/23/EC per quanto riguarda le prescrizioni tecniche per la donazione, l'approvvigionamento e il controllo di tessuti e cellule umani, nonche' per quanto riguarda le prescrizioni in tema di rintracciabilita', la notifica di reazioni ed eventi avversi gravi e determinate prescrizioni tecniche per la codifica, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani" 6. European Union. Commission Directive 2006/17/EC of 8 February 2006 implementing Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council as regards certain technical requirements for the donation, procurement and testing of human tissues and cells. Official Journal of the European Union 2006:L38/ European Union. Commission Directive 2006/86/EC of 24 October 2006 implementing Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council as regards traceability requirements, notification of serious adverse reactions and events and certain technical requirements for the coding, processing, preservation, storage and distribution of human tissues and cells. Official Journal of the European Union 2006:L294/32 8. European Union. Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council of 31 March 2004 On setting standards of quality and safety for the donation, procurement, testing, processing, preservation, storage, and distribution of human tissue cells. Official Journal of the European Union 2004:L102/ Gianaroli L, Plachot M, van Kooij R, Al Hasani S, Dawson K, De Vos A, Magli MC, Mandelbaum J, Selva J, van Inzen W. Guidelines for good practice in IVF laboratories. Hum Reprod 2000; 15:

66 10. Harlow GM, Quinn P. Foetal and placental growth in the mouse after pre implantation development in vitro under oxygen concentrations of 5% and 20%. Austr J BiolSci 1979;32: Karja NW, Wongsrikeao P, Murakami M, Agung B, Fahrudin M, Nagai T, Otoi T. Effects of oxygen tension on the development and quality of porcine in vitro fertilized embryos. Theriogenology 2004;62: Legge n. 40/2004 Norme in materia di procreazione medicalmente assistita. Gazzette Ufficiale n.45 del 24 febbraio Leoni GG, Rosati I, Succo S, Bogliolo L, Bebbere D, Berlinguer F, Ledda S, Naitana S. A low oxygen atmosphere during IVF accelerates the kinetic of formation of in vitro produced ovine blastocysts. Reprod Domestic Anim 2007;42: Magli MC, Van den Abbeel E, Lundin K, Royere D, Van der Elst J, Gianaroli L for Committee of the Special Interest Group on Embryology. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories. Hum Reprod2008; 23: Meintjes M, Chantilis SJ, Douglas JD, Rodriguez AJ, Guerami AR, Bookout DM, Barnett BD, Madde JD. A controlled randomized trial evaluating the effect of lowered incubator oxygen tension on live birth in a predominantly blastocyst transfer program; Hum Repr 2009;24: Pool TB. Obtimizing ph in clinical embryology. Clin. Embryol. 2004;7: Summers MC, Biggers JD. Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues. Hum Reprod Update 2003;9: WHO. Manuale di sicurezza nei laboratori. AIRESPSA Yuan YQ, Van Soom A, Coopman FOJ, Mintiens K, Boerjan ML, Van Zeveren A, de Kruif A, Peelman LJ. Influence of oxygen tension on apoptosis and hatching in bovine embryos cultured in vitro. Theriogenology 2003;59:

67 CAP 5 LO STOCCAGGIO IN AZOTO LIQUIDO CRISTINA BOTTAZZI E.O. OSPEDALI GALLIERA, GENOVA 1

68 INTRODUZIONE: Negli ultimi anni le metodiche di crioconservazione hanno acquisito sempre maggior valenza nel trattamento dell'infertilità, determinando un aumento delle chance di successo e rappresentando una strategia di preservazione del potenziale riproduttivo. Tali tecniche trovano applicazione nell'ambito della Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) per la salvaguardia dei singoli gameti, embrioni e tessuti gonadici. In Italia, l'applicazione delle suddette metodologie e la gestione dei campioni crioconservati sono regolamentate dalle seguenti norme: Legge 40/2004 (così come modificata dalla sentenza n.151/2009 della Corte Costituzionale), Decreto Legislativo 191/07 e Decreto Legislativo 16/10 (così come modificato dal D. Lgs. 85/2012), Decreto Legislativo 81/08. La trasposizione delle Normative Europee nella Legislazione Italiana ha comportato l'emanazione di obblighi e requisiti specifici per le condizioni di stoccaggio e per tutti i procedimenti ad esse connessi al fine di garantire il più alto livello di Qualità e Sicurezza delle cellule e tessuti trattati. Tuttavia, quanto previsto dal quadro normativo attuale non dovrebbe essere lontano dalla nostra buona pratica di laboratorio; le Good Laboratory Practice dell'eshre, già integrate con quanto richiesto dalle direttive europee, rappresentano un riferimento per chiunque pratichi PMA (1). In particolare, per quanto concerne la criopreservazione di gameti ed embrioni le disposizioni in attuazione prevedono che: ogni centro di PMA autorizzato e/o accreditato dalle Regioni a svolgere tecniche di fecondazione in vitro debba dotarsi delle apparecchiature e strumentazioni adeguate per applicare le migliori tecniche di crioconservazione e scongelamento di gameti, zigoti ed embrioni; gli ambienti per la criopreservazione devono presentare adeguate caratteristiche strutturali e di sicurezza ed essere dedicati allo svolgimento di tale attività specifica; l'accesso in tali aree deve essere consentito solo a personale qualificato e formalmente autorizzato; in ogni centro devono essere presenti appropriate misure di sicurezza in caso di rottura o malfunzionamento dei contenitori criogenici e dei sistemi di crioconservazione; 2

69 devono essere presenti procedure operative scritte per ogni fase di utilizzo delle cellule e dei tessuti crioconservati per minimizzare i rischi di contaminazione o di perdita di materiale biologico; Devono essere presenti procedure operative scritte per i seguenti processi connessi allo stoccaggio e alla criopreservazione: qualificazione del personale per tali tecniche; controllo dell'accesso ai contenitori criogenici; riempimento dei contenitori criogenici; pulizia e manutenzione dei contenitori criogenici; localizzazione dei campioni ed eventuale durata della crioconservazione; contenitori differenziati per campioni criopreservati contaminati (se applicabile); trasporto di campioni contaminati. Ogni fase di manipolazione dei tessuti gonadici, gameti ed embrioni deve essere registrata; è necessario disporre di un sistema di monitoraggio degli errori, delle non conformità e degli eventi avversi. I dati identificativi dei soggetti donatori da cui provengono i tessuti gonadici, i gameti e da cui sono stati generati gli embrioni devono essere accuratamente registrati; i campioni devono essere etichettati in modo da non consentire alterazioni non autorizzate e non riconoscibili. La documentazione dei campioni crioconservati deve includere: il numero di ovociti contenuti in ciascuna paillette e il loro stadio maturativo; la concentrazione e motilità e motilità pre-congelamento degli spermatozoi contenuti nelle paillette; il numero di embrioni contenuti in ogni paillette; lo stadio dello sviluppo embrionario; il numero di paillette crioconservate per ogni paziente; i dati specifici relativi alla tracciabilità durante le fasi di manipolazione (lotto di 3

70 appartenenza dei materiali e terreni venuti a contatto con le cellule ed i tessuti). I sistemi di registrazione devono permettere di assicurare la tracciabilità di ogni fase del trattamento dei campioni e dell'operatore che ha svolto la procedura. Inoltre, al fine di garantire una gestione controllata e sicura, la normativa in materia prevede che ciascun centro abbia una procedura per verificare periodicamente, almeno una volta all'anno, la corrispondenza tra il materiale biologico crioconservato e la relativa documentazione. Concretamente, quanto richiesto è garantire il controllo e la tracciabilità di tutte le fasi di manipolazione delle cellule e dei tessuti crioconservati. Le strutture che offrono il servizio di criopreservazione dei gameti, tessuti gonadici ed embrioni devono perseguire il mantenimento di un contatto con i soggetti donatori cui appartengono onde informarli dell'eventuale approssimarsi della data di scadenza della conservazione. La presenza di un Sistema Gestione Qualità (SGQ) ben strutturato, per altro previsto dalle normative stesse (D.Lgs 191/07, Art.16), è fondamentale per il raggiungimento della piena conformità. Documentate procedure operative che definiscono e descrivono ciascuna fase di lavorazione garantiscono la standardizzazione e la sicurezza di tutte le attività correlate alla crioconservazione e allo stoccaggio. L'analisi dei punti critici, che in tale ambito spesso sono dovuti a problematiche di tipo organizzativo e logistico, consente la minimizzazione dei rischi, la prevenzione di possibili eventi avversi che possono compromettere la qualità e l'integrità dei campioni crioconservati e la sicurezza del personale. Inoltre, l'identificazione dei parametri critici, delle apparecchiature critiche e di specifici indicatori di performance offre una gestione controllata delle biobanche ed un continuo miglioramento dei risultati (2). Approccio organizzativo delle biobanche: Qualità e Sicurezza Uno degli obiettivi primari della direttiva nella PMA è quello di impedire l'eventuale trasmissione di malattie attraverso le tecniche; un qualunque evento negativo collegato con 4

71 l'approvvigionamento, il controllo, la lavorazione, lo stoccaggio e la distribuzione di cellule o tessuti che possa provocare la trasmissione di patologie, la morte o condizioni di pericolo di vita, di invalidità o incapacità dei pazienti o ne possa produrre o prolungare l'ospedalizzazione o lo stato di malattia si definisce Evento avverso grave (Art.3, D.Lgs 191/2007). A tal fine, l'annesso III del D.Lgs. 16/2010 prevede l'obbligo di eseguire esami sierologici entro i 90 giorni precedenti la raccolta delle cellule fatta eccezione di specifici casi in cui non sia prevista né la lavorazione né la crioconservazione del campione biologico donato. I risultati sierologici positivi (o la non disponibilità dei risultati) non impediscono necessariamente la raccolta; in tal caso però il Centro di PMA dovrà essere adeguatamente attrezzato per offrire un sistema di lavorazione e conservazione separata. Inoltre, secondo quanto previsto, il materiale biologico crioconservato deve essere tenuto lontano da materiale radioattivo e da ogni potenziale sorgente nota di infezione, contaminazione chimica o atmosferica. Una gestione sicura della biobanca comporta quindi l'analisi di tutti i potenziali rischi compresi quelli di contaminazione e cross-contaminazione dei campioni. L'interpretazione corretta e l'attuazione delle disposizioni in materia, hanno messo in evidenza alcune problematiche relative ad aspetti scientifico tecnologici che nella nostra pratica possono costituire reali potenziali fonti di rischio; ne esamineremo qui di seguito alcune con l'intento di offrire spunti pratici e suggerimenti utili per un approccio organizzativo congruo con le prescrizioni di legge. I potenziali rischi di contaminazione correlati all'applicazione delle tecniche di crioconservazione e allo stoccaggio dei campioni nella PMA sono stati ampiamente trattati in letteratura (3, 4); una delle principali problematiche emerse nella nostra pratica laboratoristica è data dall'utilizzo dell'azoto allo stato liquido. Come è noto infatti, la condizione di stoccaggio più comunemente utilizzata consiste nel mantenimento dei campioni biologici a temperature criogeniche (a -196 C), immersi in azoto liquido in criocontenitori dedicati e le modalità di stoccaggio non consentono la sterilità in tali ambienti. 5

72 E' stato largamente dimostrato che gran parte dei microorganismi quali, Neisseria gonorrea, Treponema pallidum, Chlamidia trahomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, gli streptococchi, il citomegalovirus, i virus dell'epatite, il simplex virus, gli adenovirus, i pilloavirus, Trichomonas vaginalis, Aspergillus spp e Candida albicans sopravvivono alle temperature criogeniche e alle procedure di congelamento e scongelamento e che alcune componenti dei mezzi di coltura comunemente utilizzati in tali procedure sono in grado di proteggere virus e batteri da tali temperature (5, 6). Per tale ragione, nei Centri in cui è prevista la criopreservazione di campioni positivi (o di cui non sia disponibile il risultato degli esami) sarà necessario disporre di criocontenitori per lo stoccaggio dei campioni negativi, criocontenitori dedicati per le diverse patologie infettive screenate e almeno un criocontenitore dedicato alla quarantena dove verranno temporaneamente criopreservati i campioni ancora in attesa dei referti sierologici. Inoltre, sebbene l'azoto liquido fornito dalle ditte produttrici presenti un grado di purità elevato, è stato osservato che all'interno dei criocontenitori, è ipotizzabile nel tempo un aumento della contaminazione del mezzo di stoccaggio imputabile principalmente a quanto accade durante le fasi di estrazione o inserimento dei campioni. In effetti, è stato osservato che, in queste fasi, l'azoto liquido può andare incontro a contaminazione di origine atmosferica e microbica. La prima condizione è ipotizzabile a causa della liquefazione dell'ossigeno atmosferico nel mezzo di stoccaggio con conseguente possibilità di reazioni di ossidazione e potenziale danneggiamento del materiale crioconservato. Mentre, il verificarsi di una contaminazione microbica è ipotizzabile come conseguenza della formazione di cristalli di ghiaccio sulla superficie dei materiali costituenti i dispositivi per lo stoccaggio; tali aggregati possono intrappolare virus, batteri, spore batteriche e funginee e detriti che, accumulandosi nel mezzo di stoccaggio, potrebbero potenzialmente contaminare i campioni. Risulta quindi fondamentale disporre di procedure sicure che consentano una manipolazione rapida ed accurata in tutte le fasi di stoccaggio, di rintracciabilità e di spostamento del materiale biologico in altri criocontenitori al fine di garantire la qualità e la sicurezza dei campioni minimizzando i rischi di possibili ingiurie termiche e/o contaminazioni (7). Un approccio consapavole a tali criticità comporta la pianificazione nel tempo della sanificazione 6

73 dei criocontenitori dedicati allo stoccaggio. Benchè sia consigliabile pianificare gli interventi di manutenzione e sanificazione in successione la gestione di tali procedure e la programmazione delle scadenze sarà dipendente da diverse variabili quali, tipologia e capienza dei criocontenitori e frequenza di apertura; in particolare è necessario tener presente che, le scadenze relative agli interventi di manutenzione dipenderanno soprattutto dalla durata di estensione della garanzia (per la tenuta del vuoto presente nell'intercapedine isolante del criocontenitore), dato fornito dalla fabbrica produttrice. Come è noto infatti, i contenitori criogenici (o Dewar ) sono caratterizzati dalla presenza di aree sotto vuoto che separano le pareti interne del contenitore da quelle esterne consentendo l'isolamento termico tra il contenuto e l'ambiente. Quelli che più comunemente vengono utilizzati nei nostri laboratori sono in alluminio, leggeri e compatti, caratterizzati da un basso tasso di evaporazione statica ed un minimo consumo di azoto liquido garantendo una medio-alta capacità di stoccaggio (Fig.1). Fig.1: A Design del coperchio per facilitare al manutenzione B Collo del recipiente resistente che riduce le perdite di azoto C Sistema di ritenzione chimica del vuoto che fornisce una prestazione superiore per tutta la vita del prodotto D Contenitore in alluminio a basso peso e ad elevata resistenza E Intercapedine isolante che garantisce la massima prestazione termica 7

74 Al fine di poter eseguire gli interventi di pulizia e manutenzione è consigliabile disporre di un criocontenitore libero attrezzato per lo stoccaggio, per altro utilizzabile anche per far fronte ad eventuali eventi avversi quale malfunzionamento di quelli in uso. Ciascun criocontenitore dedicato allo stoccaggio dovrà essere univocamente identificato ed etichettato mediante la denominazione del Centro di appartenenza, numerazione (se necessaria) e descrizione del materiale biologico contenuto; i criocontenitori dovranno inoltre essere dotati di sistemi di chiusura, sistemi e/o procedure che garantiscano il monitoraggio continuo delle condizioni di stoccaggio e dovranno essere adeguatamente corredati al fine di consentirne, in caso di necessità, il rapido spostamento. Tuttavia, è importante tener presente che nella maggior parte dei casi delle ipotizzabili condizioni di rischio di contaminazione durante lo stoccaggio, l'evento avverso determinante è il danneggiamento del dispositivo contenente il materiale biologico crioconservato; l'utilizzo dei supporti ad alta sicurezza (8, 9) riduce drasticamente tali rischi. Lo stoccaggio dei campioni in vapori d'azoto consente una notevole diminuzione dei rischi di contaminazione e cross-contaminazione (10, 11, 12); a dispetto di ciò, i costi proibitivi per l'installazione e la gestione di tali impianti rappresentano un grosso limite per la maggior parte dei Centri. La problematica relativa ai possibili rischi di contaminazione legati all'utilizzo dell'azoto liquido nelle nostra pratica è emersa, recentemente, anche per alcune procedure di congelamento di ovociti ed embrioni umani per l'applicazione sempre più frequente della tecnica di vitrificazione. 8

75 In questi ultimi anni, la rapida evoluzione dei protocolli ed il progressivo sviluppo dei supporti di vitrificazione hanno permesso di ottenere per la criopreservazione di ovociti umani risultati stimolanti e paragonabili in termini di gravidanza a quelli ottenuti da ovociti freschi (13, 14, 15, 16); l' egg banking, oggi, rappresenta non solo una strategia efficace per la preservazione della fertilità nelle pazienti ocnologiche ma offre vantaggi anche nel trattamento delle coppie infertili. Ma, ad oggi, i risultati migliori ottenuti mediante le tecniche di vitrificazione provengono da quelle procedure in cui è previsto l'utilizzo dei cosiddetti sistemi aperti e denominatore comune in tali metodiche è il contatto diretto tra la soluzione di vitrificazione contenente gli ovociti o embrioni e l'azoto liquido durante la fase di raffreddamento e talvolta durante lo stocaggio. Tuttavia, la continua progettazione di nuove strategie da parte della comunità scientifica ci fa sperare sempre più nella possibilità di eseguire in futuro tali tecniche in sicurezza mediante l'approccio procedurale che prevede la separazione della fase di raffreddamento (eseguita in condizioni asettiche) dalla fase di stoccaggio mantenendo inalterata l'efficacia della tecnica (17). Benché nell'uomo ad oggi non vi siano evidenze scientifiche di contaminazione e crosscontaminazione nel campo della PMA (18), l'importanza sempre maggiore delle tecniche di criopreservazione in tale ambito impone una approfondita conoscenza delle metodologie indispensabile per una completa e coerente valutazione dei rischi nella gestione di un programma di assicurazione della qualità. Infine, diversi sono gli aspetti da considerare per quanto concerne la tutela della sicurezza e della salute del personale che opera in tale ambito. E' compito del Responsabile del Centro assicurare l'attuazione degli adempimenti previsti dal D. Lgs 81/08 e norme correlate. Nella gestione di un programma di gestione della qualità devono essere incluse tutte le procedure e le precauzioni necessarie per il mantenimento di un ambiente di lavoro sicuro; tali procedure devono uniformarsi alla normativa europea, nazionale e locale. E' necessario assicurare l'identificazione e la minimizzazione dei rischi, pur mantenendo un livello di qualità e sicurezza del materiale biologico adeguati allo scopo prefissato (Sez. B, p.5 del Documento dell'osservatorio sul D. Lgs 191/07). 9

76 Tutte le operazioni che contemplano l'utilizzo diretto dell'azoto liquido dovranno essere eseguite, per quanto sia prevedibile, in sicurezza e specifiche Istruzioni Operative (I.O.) dovranno essere dedicate (es. estrazione campione biologico, rabbocco dei cricontenitori, laddove sia previsto,...etc). Nell area dedicata alla criogenia insieme alla cartellonistica prevista, dovrà essere sempre esposta e facilmente consultabile la scheda di sicurezza del liquido criogenico utilizzato fornita dalla stessa ditta produttrice. Dovranno essere dettagliatamente descritte, mediante I.O. dedicate, le regole comportamentali a cui il personale dovrà attenersi in caso di condizioni di rischio quale diminuzione della tensione di ossigeno nel locale dedicato (tenendo conto delle diverse situazioni operative possibili: presenza o meno di personale). A tal proposito, è importante considerarre che un abbassamento della tensione di ossigeno nel locale può verificarsi sia per rottura e/o malfunzianamento di un criocontenitore con conseguente fuoriuscita di azoto liquido, sia durante alcune fasi operative che prevedono il travaso del mezzo criogenico e/o la frequente introduzione nel mezzo stesso di materiali a temperatura ambiente. Tutto il personale coinvolto nelle attività di stoccaggio e in tutte le attività ad esso correlate, deve essere adeguatamente formato; l'addestramento specifico prevede l'informazione e la formazione per i rischi relativi alla manipolazione di un liquido criogenico. E' ben noto che, al fine di ridurre il rischio da contatto dell'operatore con l'azoto liquido nelle fasi di lavorazione in cui è prevista la manipolazione diretta del gas liquefatto refrigerato, la norma prevede l'utilizzo di specifici Dispositivi di Protezione Individuale (DPI ) (Fig. 2). Al fine di evitare il contatto con il liquido o vapori freddi è necessario adottare le seguenti misure di prevenzione e protezione di tipo personale: usare occhiali o visiere facciali (Fig. 2, A) durante le operazioni per le quali si prevedono spruzzi di liquido criogenica ( travasi o altro); indossare appositi guanti diatermici molto larghi in modo da poterli sfilare facilmente in caso di penetrazione(fig.2, B); indossare paragrembo e pantaloni lunghi o tuta contro gli spruzzi alle gambe o altre parti 10

77 del corpo (Fig. 2, C); indossare calzari a protezione dei piedi e del polpaccio; quando non vengano indossate calzature completamente chiuse (D). Fig.2: DPI A B C D In conclusione possiamo affermare che le tecniche di crioconservazione, grazie al continuo miglioramento in termini di sopravvivenza ed efficacia clinica, rappresentano oggi la strategia emergente nell'ambito della medicina della riproduzione. L'applicazione e lo sviluppo di tali tecniche deve essere accompagnato dall'impegno continuo da parte della comunità scientifica verso la standardizzazione e validazione dei processi per la prevenzione dei rischi ad esse correlati. L'implementazione, il mantenimento e il miglioramento continuo di un sistema di Gestione della 11

78 Qualità e Sicurezza consentono il perseguimento di strategie organizzative che permettono il raggiungimento della conformità alle prescrizioni di legge e promuovono una continua crescita in termini di qualità, sicurezza ed efficienza dell'applicazione clinica di tali tecniche. BIBLIOGRAFIA: 1) Magli MC, Van den Abbeel E, Lundin K, Royere D, Van der Elst J, Gianaroli L Revised guidelines for good practice in IVF laboratories, Hum Reprod 2008; 23: ) Mortimer and Mortimer Quality and Risk Managmentin in the IVF Laboratory 3) Bielanski A and Vajta G. Risk of cotamination of germplasm during cryopreservation and cryobanking in IVF units. Hum Reprod 2009; 24: ) Tomlinson M. Risk managment in cryopreservation associated with assisted reproduction. Cryo Letters 2008; 29: ) Rall WF. Avoidance of microbial cross-contamination of cryopreserved gametes, embryos, cells and tissues during storage in liquid nitrogen. Embriologists' Newsletter 2003; 6: ) Tedder RS, Zuckerman MA, Goldstone AH, Hawkins AE, Fielding A, Briggs EM, Irvin D, Blair S, Gorman AM, Patterson KG et al. Hepatitis B transmission fron contaminated cryopreservation tank. Lancet 1995; 346: ) Tomlnson M, Morrol D. Risk associated with cryopreservation: a survey of assisted conception units in the UK and Ireland. Hum Fertil (Camb) 2008; 11: ) Benifla JL, Letur- Konirsch H, Collin G, Devaux A, Kutten F, Madelenat P, Brun Vezinet F Feldmann G. Safety of cryopreservation straws for human gemates or embryos: a preliminary study with human immunodeficiency virus I. Hum Reprod 2000; 15: ) Letur Konirsch H, Collin G, Sifer C, Devaux A, Kutten F, Madelenat P, Brun Vezinet F, Feldmann G Benifla JL. Safety of cryopreservation strawsvfor human gametes or embryos: a study with human immunodeficiency virus-i under cryopreservation conditions. Hum Reprod 2003; 18: ) Cobo A, Romero JL, Perez S, de Los Santos MJ, Meseguer M, Remohi J Storage of human oocyte in 12

79 the vapor phase of nitrogen Fertil Steril 2010a; 94: ) Eum JH, Park JK, Lee WS,Cha KR, Yoon TK, Lee DR. Long term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertil Steril 2009; 91: ) Grount BW, Morris GJ. Contaminated liquid nitrogen vapor as a risk factor in pathogen transfer. Theriogenology 2009; 71: ) Cobo A, Remohì J, Chang CC, Nagy ZP. Oocyte cryopreservation for donor egg banking. Reprod Biomed Online 2011; 23: ) Cobo A, Kuwayama M, Pèrez S, Ruiz A, Pellicer A, Remohi J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocyte vitrified by the Cryopot method. Fertil Steril 2008; 89: ) Ubaldi F, Anniballo R, Romano S, Baroni E, Albricci L, Colamaria S, Capalbo A, Sapienza F, Vajta G, Rienzi L. Cumulative ongoing pregnancy rate achieved with oocyte vitrification and cleavage stage transfer without embryo selection in a standard infertility program. Hum Reprod 2010; 25: ) Antinori M, Licata E, Dani G, Cerusico F, Versaci C, Antinori S. Cryotop vitrification of human oocyte results in high survival rate and healthy deliveries. Reprod Biomed Online 2007; 14: ) Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, Cuomo S, Ciampaglia W, Infante FE, Tabarelli de Fatis C, Arnone A, Maccarini AM, Filicori M. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. RBM Online 2011; article in press. 18) Pomeroy KO, Harris S, Conaghan J, Papadakis M, Centola G, Basuray R, Battaglia D Storage of cryopreserved reproductive tissues: evidence that cross-contamination of infectious agents is a negligible risk. Fertil. Steril. 94,

80 CAPITOLO 6 TRACCIABILITÀ NEL LABORATORIO DI FECONDAZIONE IN VITRO E CODIFICA SANDRINE CHAMAYOU Unità di Medicina della Riproduzione- Centro HERA Sant Agata Li Battiati (CT) Pagina 1 di 9

81 0. RIFERIMENTO DI LEGGE Il decreto legislativo del 25 gennaio, n.16 (così come modificato dal D. Lgs. 85/2012) Attuazione delle direttive 2006/17/CE e 2006/86/CE, che attuano la direttiva 2004/23/CE per quanto riguarda le prescrizioni tecniche per la donazione, l'approvvigionamento e il controllo di tessuti e cellule umani, nonche' per quanto riguarda le prescrizioni in tema di rintracciabilita', la notifica di reazioni ed eventi avversi gravi e determinate prescrizioni tecniche per la codifica, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani. GU n. 40 del , definisce h) rintracciabilità: la possibilità di ricostruire il percorso di tessuti o cellule in ogni fase dell'approvvigionamento, della lavorazione, del controllo e dello stoccaggio fino alla distribuzione al ricevente o allo smaltimento, compresa la possibilità di risalire all'identificazione del donatore, dell'istituto dei tessuti o del centro di produzione che ricevono, o lavorano o stoccano i tessuti o le cellule, nonché, a livello delle strutture sanitarie, la possibilità di individuare i responsabili che applicano i tessuti o le cellule sui riceventi. Tale rintracciabilità riguarda anche la possibilità di reperire e identificare tutti i dati pertinenti relativi ai prodotti e ai materiali che vengono in contatto con detti tessuti o cellule 1. TRACCIABILITÀ DEL MATERIALE Per ogni materiale di consumo utilizzato nel laboratorio di fecondazione in vitro, un registro di gestione dei prodotti deve essere tenuto costantemente aggiornato. Per ogni prodotto vanno registrati il codice, la ditta produttrice, la scadenza, l inizio uso e la fine d uso. Queste informazioni possono essere registrate su una scheda o un registro e possono essere utili anche per la gestione delle quantità in giacenza e dello stock di riordino. Se un registro di gestione dei prodotti non esiste nel laboratorio, il nome, il codice, il numero di lotto e la scadenza del prodotto devono essere indicati sulla scheda di laboratorio di ogni paziente. L utilizzo di ogni prodotto (per esempio il terreno di coltura) è specificato nei protocolli del laboratorio. Un esempio di scheda del gestione del prodotto/materiale è il seguente: Pagina 2 di 9

82 Un altra possibilità è annotare sul registro/scheda del laboratorio e per ogni paziente il nome e il lotto di ogni materiale in contatto con i gameti o gli embrioni. Una terza possibilità è di compilare giornalmente una scheda del materiale utilizzato precisando la tipologia di materiale e il numero di lotto. Questa scheda deve essere datata, numerata e conservata dal personale del laboratorio. Sul registro o la scheda del paziente, devono essere riportati il numero e la data della scheda del materiale. Un esempio di lista del materiale che deve essere registrato è la seguente: - ago del prelievo ovocitario, - tutti i terreni di coltura in contatto con gli ovociti e gli embrioni (flushing, terreni sequenziali, ialuronidasi etc.), - i terreni per la selezione e la coltura degli spermatozoi, - kit/terreni di congelamento, - kit/terreni di scongelamento. - catetere, - materiale di plastica o vetro (provette, piastre, siringhe, paillette, tip di denudazione, pipette Pasteur ) Per un terreno di coltura preparato in casa, nella scheda del terreno devono essere indicati il protocollo utilizzato per la sua preparazione, l elenco e il numero di lotto di ogni ingrediente utilizzato, la data e l operatore che ha eseguito la preparazione, la scadenza. Nel registro/scheda del laboratorio di fecondazione in vitro, deve essere riportata il numero della scheda del terreno preparato in casa. 2. TRACCIABILITÀ DEI GAMETI E DEGLI EMBRIONI Gli ovociti, spermatozoi, zigoti ed embrioni devono essere tracciati dalla loro produzione/prelievo fino alla determinazione del loro destino (uso clinico, crioconservazione o scarto). Il decreto legislativo del 25 gennaio 2010, n. 16 specifica nell articolo 3: 5. Il responsabile dell'istituto dei tessuti, in accordo con l'organizzazione per l'approvvigionamento definisce procedure operative standard, in seguito indicate come «POS», al fine di verificare: a) l'identità' del donatore; b) la documentazione relativa al consenso informato, o all'espressione di volontà o all'autorizzazione alla donazione da parte del donatore o della sua famiglia; Pagina 3 di 9

83 Il personale di laboratorio deve assicurarsi che ciascun paziente abbia firmato il consenso alla procedura ed in particolare alla crioconservazione dei suoi gameti e degli embrioni prodotti in comune. L identità della paziente è inizialmente verificata, seconda modalità specificata in una procedura, dal personale infermieristico o altro personale specificato del Centro durante l accesso nella struttura sanitaria. In aggiunta, il personale di laboratorio deve applicare una procedura operativa standard d identificazione diretta della paziente prima del prelievo ovocitario (prima dell anestesia generale) e prima del trasferimento embrionale. L accettazione del liquido seminale deve essere fatta secondo una procedura definita dal centro. Nel caso di liquido seminale raccolto fuori della struttura, questo deve essere accompagnato da un modulo di consegna dove il paziente autocertifica che il campione contenuto all interno del contenitore è stato prodotto da lui ed è consapevole che questo campione varrà utilizzato o per la tecnica di fecondazione in vitro da specificare o per l autoconservazione. Il modulo deve essere firmato dal paziente con la fotocopia di un documento d identità allegata e la firma di chi ha verificato l identità del paziente (per esempio il personale di segreteria). Lo stesso modulo deve essere compilato qualora il campione sia stato prodotto nella struttura sanitaria. In entrambi i casi, il modulo compilato deve essere conservato presso la struttura sanitaria. In una scheda di laboratorio e/o in registri cartacei e/o informatici del laboratorio, devono essere indicati tutti i passaggi e le lavorazioni che i gameti/embrioni subiscono e fanno, in particolare l evoluzione di ogni ovocita, zigote, embrione e l utilizzo del campione di spermatozoi, i protocolli di lavorazione che sono stati applicati, dove e come è stato conservati e stoccati, il destino (utilizzato, mantenuto, trasferito, conservato, scartato) e l identità dell operatore che ha eseguito ogni passaggio, gli orari. Alla fine del trattamento in vitro, deve essere compilata una relazione scritta che cita le procedure (es. FIV, ICSI, IMSI...) che il personale di laboratorio ha eseguito sul materiale cellulare del/la paziente/coppia e dov'è chiaramente specificato il destino di ogni ovocita, zigote, embrione, campioni di spermatozoi (traferito, congelato, eliminato per arresto dello sviluppo...). Questa relazione è resa disponibile nella cartella del/la paziente/coppia. Nella relazione consegnata dal medico al/la paziente/coppia deve essere chiaramente specificato eventuale materiale cellulare crioconservato e ancora a disposizione nell istituto dei tessuti. Il decreto legislativo del 25 gennaio 2010, n. 16 specifica nell articolo 6 : Il responsabile dell'istituto dei tessuti, in accordo con l'organizzazione per l'approvvigionamento definisce altresì POS relative all'approvvigionamento, confezionamento, etichettatura e trasporto dei tessuti e delle cellule fino alla destinazione presso l'istituto dei tessuti o, in caso di distribuzione diretta di tali materiali, presso l'equipe clinica responsabile della loro applicazione, ovvero, in caso di campioni di tessuti e cellule, presso il laboratorio per il controllo, in conformità all'articolo 5. Tutti i contenitori (provetta/piastra/paillette o altro) contenente la/e cellula/e riproduttiva/e, lo zigote, l embrione, devono riportare i dati identificativi del soggetti interessato (nome, cognome, data di nascita e/o codice identificativo) prima che il campione venga depositato in esso. Pagina 4 di 9

84 I dati identificativi dei soggetti da cui provengono i gameti o da cui sono stati generati gli embrioni devono essere accuratamente registrati ed i campioni etichettati in modo da non consentire alterazioni non autorizzate o non riconoscibili. In caso di pazienti con markers infettivi positivi, è consigliabile che il personale del laboratorio riporti questi dati su ogni modulo e registro utilizzati nella lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di questo materiale cellulare o di quello che ne risulta (zigote, embrione). 3. TRACCIABILITÀ DEGLI OPERATORI Ogni operatore del laboratorio che riceve materiale cellulare (es. spermatozoi dal paziente che lo consegna o ovociti durante il prelievo ovocitario) deve indicare sul modulo e il registro del laboratorio che ha ricevuto questo materiale (firma o sigla dell operatore), l ora e qualunque non conformità nella modalità di ricezione di questo materiale o nello stoccaggio del materiale cellulare. In ogni modulo e registro (cartaceo e informatico) che tracciano la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione del materiale cellulare, il nome o la firma dell operatore che ha eseguito la procedura deve essere chiaramente identificabile. Nel caso di registri informatici, è necessario che l accesso avvenga tramite password personale; si consiglia d istaurare un sistema che permetta di registrare gli accessi e le modifiche fatte da ciascun operatore, prevedendo anche livelli diversi di accesso e modifica dei dati. 4. TRACCIABILITÀ DEI DATI AMBIENTALI I dati ambientali ed ogni scostamento dai parametri stabiliti devono essere monitorati. È particolarmente importante nella PMA monitorare anche la temperatura dell ambiente del laboratorio dove si lavorano le cellule, nonché delle attrezzature (cappe, incubatori ), dal momento che la stabilità della temperatura incide in modo importante sulla qualità dello sviluppo embrionario. Di conseguenza, devono essere registrati i seguenti parametri: - temperatura del laboratorio di fecondazione in vitro e della sala operatoria; - temperatura di piano riscaldato, termoblock (del laboratorio e della sala operatoria), frigorifero, congelatore; - temperatura, percentuale di CO2, percentuale d O2 per quanto riguarda gli incubatori. Le procedure operative standard devono stabilire la modalità e la frequenza dei parametri da registrare. Sul modulo da compilare per la registrazione del dato, deve essere rilevabile tramite firma o sigla o altro sistema anche informatico l operatore che ha effettuato il controllo, quando e come è stato effettuato. Si consiglia inoltre di riportare nel modulo i valori soglia che non devono Pagina 5 di 9

85 essere superati (limiti di accettabilità). La registrazione dei parametri critici può essere effettuata tramite sistemi di controllo elettronici o integrati all apparecchiatura. Si consiglia di monitorare la temperatura anche nell ambiente dove sono conservati i contenitori di azoto liquido, al fine di valutare e tenere sotto controllo un eventuale eccessiva evaporazione di azoto liquido. Un esempio di modulo di registrazione è il seguente: 5. TRACCIABILITÀ DELLA STRUMENTAZIONE UTILIZZATA Ogni apparecchiatura critica che viene utilizzata nella lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione del materiale cellulare deve essere registrata sui moduli e i registri di laboratorio. S intende per apparecchiatura critica in primo luogo l apparecchiatura per la quale è necessario che i valori di funzionamento siano tarati su un determinato valore ambientale (temperatura, CO2, O2, N2, umidità), per la quale lo scostamento da questi parametri può determinare un danno importante nelle cellule lavorate. Di conseguenza, i valori dei parametri di ogni piano riscaldante (se più di uno nel laboratorio), ogni termoblock (se più di uno nel laboratorio), ogni incubatore (se più di uno nel laboratorio), ogni contenitore d azoto liquido (se più di uno nel centro) devono essere tracciati. Nel caso in cui due o più interventi della stessa natura (es.: prelievi ovocitari) sono in atto nello stesso momento nel laboratorio, la postazione di lavoro di ogni seduta deve essere tracciata e registrata sui moduli e registri del laboratorio. 6. CODIFICA Il decreto legislativo del 25 gennaio 2010, n. 16 specifica nell articolo 15 : Sistema europeo di codifica 1. Conformemente alle previsioni di cui all'articolo 8, comma 6, del decreto legislativo n. 191 del 2007, a ciascun materiale donato e' attribuito un codice d'identificazione unico europeo, al fine di Pagina 6 di 9

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