CAPITOLO 11. I meccanismi molecolari della regolazione genica La regolazione della trascrizione nei procarioti

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1 CAPITOLO 11 I meccanismi molecolari della regolazione genica Il principio predominante della regolazione genica è che alcuni geni controllano l espressione di altri geni. Per molti anni si è creduto che la regolazione fosse mediata principalmente da proteine che legano il DNA. È stato dimostrato invece che l espressione genica può essere regolata anche dall RNA, in particolar modo da piccole molecole di RNA a singolo fi lamento che sono modifi cate da precursori di RNA a doppio fi lamento. Questo modello molecolare prevede che una molecola di RNA che contiene sequenze di basi complementari possa formare una struttura a forcina (hairpin) e che il solco della forcina sia maturato in un microrna capace di regolare l espressione di altri geni. INDICE DEL CAPITOLO 11.1 La regolazione della trascrizione nei procarioti I sistemi inducibili e reprimibili di regolazione negativa La regolazione positiva 11.2 Il sistema di regolazione genica dell Operone I mutanti lac La sintesi inducibile e costitutiva e la repressione Il repressore La regione dell operatore La regione del promotore Il sistema di regolazione trascrizionale dell operone La regolazione positiva dell operone del lattosio La regolazione dell operone del triptofano 11.3 La regolazione attraverso la terminazione della trascrizione L attenuazione Gli interruttori di RNA 11.4 La regolazione nel batteriofago lambda 11.5 La regolazione della trascrizione negli eucarioti Il metabolismo del galattosio nel lievito Le proteine attivatrici trascrizionali Enhancer e silencer trascrizionali La scansione per delezione Il complesso trascrizionale degli eucarioti I complessi di rimodellamento della cromatina I promotori alternativi 11.6 I meccanismi epigenetici della regolazione della trascrizione La metilazione delle citosine La metilazione e l inattivazione della trascrizione L imprinting genomico nelle linee germinali femminile e maschile 11.7 La regolazione attraverso la maturazione e la degradazione dell RNA Lo splicing alternativo La stabilità dell RNA messaggero 11.8 L interferenza dell RNA 11.9 Il controllo traduzionale I piccoli RNA regolatori che controllano la traduzione I riarrangiamenti programmati del DNA L amplifi cazione genica La variabilità degli anticorpi e dei recettori delle cellule T L interconversione del tipo sessuale Il controllo trascrizionale del tipo sessuale CONNESSIONE Centralino? Centralino? François Jacob, David Perrin, Carmen Sanchez e Jacques Monod 1960 L operone: un gruppo di geni la cui espressione è coordinata da un operatore [originale in francese] CONNESSIONE Un doppio problema Adrew Fire, SiQun Xu, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver e Craig C. Mell Interferenza forte e specifi ca da parte di un RNA a doppio fi lamento in Caenorhabditis elegans 380

2 Gli esseri umani e gli altri animali vertebrati hanno circa 220 tipi cellulari diversi che svolgono funzioni specializzate. Queste differenze sono correlate all espressione dei geni. Infatti la maggior parte dei geni si differenzia in base al loro livello di espressione a seconda del tipo cellulare o dello stadio del ciclo cellulare. L attività dei geni è collegata anche alle funzioni della cellula stessa: i geni dell emoglobina, per esempio, sono espressi a livelli elevati soltanto nei precursori dei globuli rossi. Il controllo della sintesi di particolari prodotti genici è definito come regolazione genica. In molti casi l attività dei geni è regolata a livello della trascrizione, sia attraverso segnali che si originano all interno della cellula stessa, sia in risposta a condizioni ambientali esterne. Molti prodotti genici, per esempio, sono necessari solo occasionalmente e la trascrizione può essere regolata secondo una modalità di acceso-spento (on-off) che fa sì che questi prodotti siano presenti soltanto quando la condizione ambientale esterna lo richiede. Il flusso dell informazione genetica è regolato anche in altri modi. I punti di controllo dell espressione genica includono: 1. La regolazione trascrizionale della sintesi dei trascritti di RNA attraverso il controllo dell inizio o della terminazione della trascrizione. 2. La maturazione dell RNA o regolazione attraverso lo splicing dell RNA o dei prodotti alternativi di splicing. 3. La stabilità dell mrna, poiché gli mrna che rimangono nella cellula hanno effetti di maggiore durata rispetto a quelli che sono degradati rapidamente. 4. Il controllo post-traduzionale, che comprende un gran numero di meccanismi diversi che influenzano l attività enzimatica, l attivazione, la stabilità e così via. 5. I riarrangiamenti del DNA, per i quali l espressione genica cambia a seconda della posizione delle sequenze del DNA nel genoma. I sistemi di regolazione nei procarioti e negli eucarioti differiscono tra loro in molti particolari. I procarioti sono in generale organismi unicellulari che crescono e si dividono in modo indefinito fintanto che le condizioni ambientali sono favorevoli e la riserva di nutrienti è adeguata. I loro sistemi di regolazione sono congegnati in modo tale da consentire il tasso di crescita massimo in un determinato ambiente. Differentemente, le cellule di un organismo multicellulare in sviluppo modulano il loro tasso di crescita allorquando la loro morfologia e il loro metabolismo vanno incontro a cambiamenti sorprendenti e coordinati. In un animale adulto la crescita e la divisione della maggior parte dei tipi cellulari cessa e ogni tipo cellulare ha la necessità di mantenere nel tempo la propria identità La regolazione della trascrizione nei procarioti Nei batteri e nei fagi l attività dei geni è spesso regolata secondo una modalità acceso-spento attraverso la regolazione della trascrizione. Quando un prodotto genico è richiesto dalle condizioni ambientali, la trascrizione del gene viene accesa ; nelle altre condizioni la trascrizione del gene viene spenta. Il termine spento non deve essere però preso in senso letterale. Nei batteri sono conosciuti pochi esempi di sistemi completamente spenti. Quando la trascrizione è bloccata, cioè il gene è spento, rimane quasi sempre un livello di espressione genica basale, mediante la quale avviene in media un evento di trascrizione per generazione cellulare o anche meno; di conseguenza spento significa in realtà che c è pochissima sintesi del prodotto genico. Livelli di espressione estremamente bassi si trovano anche in alcune classi di geni degli eucarioti, che comprendono la maggior parte dei geni che partecipano allo sviluppo embrionale. Esistono nei procarioti e negli eucarioti altri meccanismi di regolazione diversi dalla modalità acceso-spento; in questi esempi il livello di espressione di un gene può essere modulato in modo graduale da elevato a basso a seconda delle condizioni della cellula. Nei sistemi batterici, quando parecchi enzimi agiscono in sequenza in un unica via metabolica, in generale o sono prodotti tutti o non ne è prodotto nessuno. Questa regolazione coordinata deriva dal controllo della sintesi di una o più molecole di mrna policistronico che codificano tutti i prodotti genici che funzionano nella stessa via metabolica. Questo tipo di regolazione non è presente negli eucarioti poiché, come abbiamo visto nel Capitolo 10, l mrna degli eucarioti è monocistronico. I sistemi inducibili e reprimibili di regolazione negativa I meccanismi molecolari di regolazione in genere cadono in una di queste due grandi categorie: la regolazione negativa e la regolazione positiva. In un sistema soggetto alla regolazione negativa (FIGURA 11.1, parte A), lo stato basale è acceso e la trascrizione avviene finché non è spenta da una proteina repressore che si lega al DNA a monte del sito di inizio di trascrizione. Un sistema regolato negativamente può essere inducibile (Figura 11.1B) oppure reprimibile (Figura 11.1C) a seconda di come si forma il repressore attivo. Nella trascrizione inducibile, una proteina repressore che si lega al DNA tiene la trascrizione in uno stato spento. In presenza di una piccola molecola chiamata induttore, il repressore si lega preferenzial La regolazione della trascrizione nei procarioti 381

3 (A) Regolazione negativa della trascrizione Sito di legame del repressore Nella regolazione negativa, lo stato basale di trascrizione è acceso a meno che un repressore non spenga la trascrizione (B) inducibile Repressore Nessuna trascrizione Induttore (C) reprimibile Repressore inattivo Nella trascrizione inducibile, il repressore è una proteina il cui legame al DNA è inattivato da un induttore Nella trascrizione reprimibile il repressore è formato dall interazione tra una proteina aporepressore e un corepressore Repressore attivo Nessuna trascrizione Aporepressore Corepressore FIGURA 11.1 La regolazione negativa (A) comprende meccanismi di controllo della trascrizione inducibili (B) e reprimibili (C). mente all induttore e perde la sua capacità di legarsi al DNA, permettendo alla trascrizione di procedere. Molte vie metaboliche degradative (cataboliche) sono inducibili e utilizzano come induttore il substrato iniziale della via di degradazione. In questo modo gli enzimi utilizzati per la degradazione non sono sintetizzati a meno che il substrato non sia presente all interno della cellula. Nella trascrizione reprimibile (Figura 11.C) lo stato di base è acceso finché non si forma un repressore attivo che lo spegne. In questo caso la proteina di regolazione è chiamata aporepressore ed essa non possiede un attività di legame al DNA. Il repressore attivo che si può legare al DNA si forma dalla combinazione dell aporepressore con una piccola molecola conosciuta come corepressore. La presenza del corepressore quindi determina il blocco della trascrizione. La regolazione reprimibile si trova spesso nel controllo della sintesi di enzimi che partecipano a vie metaboliche biosintetiche (anaboliche); in questi casi il prodotto finale della via metabolica è spesso il corepressore. Così gli enzimi della via biosintetica non sono sintetizzati finché la concentrazione del prodotto finale non è così bassa da causare la repressione. La regolazione positiva Occorre notare che nella regolazione negativa (Figura 11.1A) lo stato basale della trascrizione è acceso e quindi è necessario un repressore per spegnerla. Confronta questa situazione a quella di un sistema regolato positivamente (FIGURA 11.2), in cui lo stato basale è spento e in cui il legame con una proteina di regolazione è necessario per accendere la trascrizione. Una tale proteina di regolazione è chiamata proteina attivatrice di trascrizione. La regolazione negativa e positiva non sono mutuamente esclusive e alcuni sistemi sono regolati sia positivamente che negativamente, utilizzando due regolatori che rispondono a condizioni diverse della cellula. La regolazione negativa è più comune nei procarioti, quella positiva negli eucarioti. Alcuni geni manifestano un autoregolazione, il che significa che il prodotto proteico di 382 CAPITOLO 11 I meccanismi molecolari della regolazione genica

4 Regolazione positiva Sito di legame dell attivatore Nessuna trascrizione L attivatore trascrizionale è legato al sito di legame dell attivatore FIGURA 11.2 Nella regolazione positiva lo stato basale di trascrizione è spento. La trascrizione è stimolata dal legame di una proteina attivatrice trascrizionale. un gene regola la sua stessa trascrizione. Nell autoregolazione negativa la proteina inibisce la trascrizione e concentrazioni elevate della proteina determinano una minore trascrizione dell mrna corrispondente. Questo meccanismo regola automaticamente il livello della proteina nella cellula. Nell autoregolazione positiva la proteina stimola la trascrizione: quanta più proteina è prodotta, tanto più la trascrizione procede al tasso massimo. L autoregolazione positiva è una via comune per amplificare un induzione debole. È necessario solo un segnale debole affinché inizi la produzione della proteina, ma poi si istaura l autoregolazione che stimola ulteriormente la produzione ad un livello massimo. Qui di seguito prenderemo in esame due sistemi classici di regolazione che si trovano nel batterio Escherichia coli. Questi esempi servono come esempi specifici dei concetti generali introdotti dalle Figure 11.1 e Vedremo che nel mondo reale la maggior parte dei geni ha meccanismi di controllo che si sovrappongono e che comprendono sia elementi di regolazione positiva che elementi di regolazione negativa Il sistema di regolazione genica dell Operone La regolazione genica è stata studiata in dettaglio per la prima volta in E. coli, che è in grado di degradare lo zucchero lattosio e alcune caratteristiche fondamentali della regolazione genica sono state scoperte originalmente in questo sistema. Questo è un esempio classico di regolazione negativa in cui la trascrizione è inducibile (Figura 11.1 B). Il sequenziamento genomico ha messo in luce recentemente che i geni per l utilizzazione del lattosio in E. coli sono presenti in un isola genomica di DNA del tipo discusso nel Paragrafo 9.1. Sulla base di quello che ora sappiamo della sequenza del DNA di questi geni e della loro assenza in specie batteriche evolutivamente molto vicine, risulta chiaro che i geni del lattosio sono localizzati in un isola genomica di circa 5 kb di DNA che è stata trasferita nel genoma di E. coli da una fonte sconosciuta almeno 50 milioni di anni fa. Questa è una delle almeno 234 isole genomiche che si sono inserite nel genoma di E. coli dal momento della sua divergenza dal batterio più strettamente imparentato circa 100 milioni di anni fa. Una prima comprensione dei meccanismi di regolazione è derivata da un analisi genetica delle mutazioni che influenzano il metabolismo del lattosio. I paragrafi che seguono descrivono le proprietà di queste mutazioni e le interpretazioni che sono emerse dalla loro analisi. I meccanismi di regolazione che sono stati supposti dall analisi dei mutanti sono stati confermati abbondantemente da studi molecolari diretti. I mutanti lac Per il metabolismo del lattosio in E. coli sono necessarie due proteine, l enzima -galattosidasi, che scinde il lattosio in galattosio e glucosio, e la lattosio permeasi, una molecola di trasporto che è necessaria per l ingresso del lattosio nella cellula. L esistenza di due proteine diverse nel sistema di utilizzo del lattosio è stata dimostrata per la prima volta da una combinazione di esperimenti di genetica e di analisi biochimica. Innanzitutto sono stati isolati centinaia di mutanti incapaci di usare il lattosio come fonte di carbonio, definiti come mutanti lac. Alcune delle mutazioni erano nel cromosoma di E. coli, mentre altre erano in un plasmide F lac, che porta i geni per l utilizzo del lattosio. Attraverso esperimenti di coniugazione F F i ricercatori hanno costruito dei diploidi parziali con i genotipi F lac /lac + e F lac + /lac. (Il genotipo del plasmide è indicato a sinistra del simbolo di divisione e quello del cromosoma batterico alla destra). Fu osservato che tutti questi diploidi parziali avevano sempre un fenotipo Lac + (cioè, essi producevano -galattosidasi e permeasi); pertanto nessun diploide parziale produceva un inibitore che impediva il funzionamento dei geni lac. Sono stati costruiti altri diploidi parziali nei quali sia il plasmide F sia il cromosoma batterico portavano l allele lac. Questi costrutti sono stati saggiati per il fenotipo di lac +, con il risultato che tutti i mutanti inizialmente isolati potevano essere classificati in due gruppi di complementazione, chiamati lacz e lacy, un risultato che prevede che il sistema lac sia composto da almeno due geni. In particolare i diploidi parziali F lacz lacy + /lacz + /lacy e F lacz + lacy / lacz lacy Il sistema di regolazione genica dell Operone 383

5 avevano un fenotipo Lac + (complementazione), producendo sia -galattosidasi che permeasi. Tuttavia, i genotipi F lacz lacy + /lacz lacy + e F lacz + lacy / lacz + lacy avevano un fenotipo Lac (assenza di complementazione). Le cellule F lacz lacy + /lacz lacy + non erano capaci di sintetizzare la -galattosidasi, e quindi lacz codifica per la -galattosidasi. Le cellule F lacz + lacy /lacz + lacy non erano in grado di sintetizzare la permeasi, quindi lacy codifica per la permeasi. (Un terzo gene che codifica una -galattosidasi transacetilasi è stato scoperto successivamente. Questo gene non era stato incluso tra i primi mutanti perché non è essenziale per la crescita sul lattosio). Un risultato finale importante cioè che i geni lacz e lacy erano adiacenti fu dedotto dalla frequenza elevata di cotrasducenti osservata negli esperimenti di mappatura genetica. La sintesi inducibile e costitutiva e la repressione La modalità acceso spento del sistema di utilizzazione del lattosio è dimostrata dalle seguenti osservazioni: 1. Se una coltura di E. coli Lac + è fatta crescere su un terreno che non include il lattosio o nessun altro -galattoside, le concentrazioni intracellulari di -galattosidasi e di permeasi sono estremamente basse, pari circa a 1-2 molecole per cellula batterica. Tuttavia, se il lattosio è presente nel terreno di crescita, il numero di ciascuna di queste molecole è circa mille volte superiore. 2. Se si aggiunge lattosio ad una coltura lac + che cresce in un terreno privo di lattosio (ma privo anche di glucosio, un punto che sarà trattato tra breve), la -galattosidasi e la permeasi sono sintetizzate entrambe quasi simultaneamente, come mostrato nella FIGURA L analisi dell mrna totale presente nelle cellule prima e dopo l aggiunta del lattosio mostra che prima dell aggiunta del lattosio non ci sono quasi molecole di mrna lac (l mrna policistronico che codifica per la -galattosidasi e la permeasi), mentre l aggiunta del lattosio innesca la sintesi dell mrna lac. Queste due osservazioni hanno portato a concludere che la trascrizione dei geni del lattosio è inducibile e che il lattosio (o un derivato del lattosio) è l induttore. Alcuni analoghi del lattosio possono agire come induttori, quali ad esempio un analogo che contiene zolfo, indicato come IPTG (isopropiltiogalattoside). Questo induttore sintetico è conveniente negli esperimenti perché induce la sintesi di -galattosidasi e di permeasi, ma non è scisso dalla -galattosidasi: in questo modo i livelli di IPTG rimangono stabili nella cellula indipendentemente della presenza o meno della -galattosidasi. La chiave per comprendere l induzione venne da mutanti con una regolazione difettiva. In una classe di mutanti della regolazione l mrna lac era sintetizzato anche in assenza dell induttore. A causa della loro sintesi costante questi mutanti furono chiamati costitutivi. I mutanti costitutivi rientravano in due classi, i mutanti lac e i mutanti laco c. Furono ottenuti anche mutanti che non erano in grado di produrre l mrna lac anche quando era presente l induttore. Questi mutanti non inducibili rientravano in due classi, i mutanti laci S e lacp. Le caratteristiche dei mutanti sono mostrate nella TABELLA 11.1 e sono descritte nei paragrafi che seguono. Il repressore Nella Tabella 11.1, i genotipi 3 e 4 dimostrano che le mutazioni laci sono recessive. In assenza di induttore, una cellula laci + non sintetizza l mrna lac, mentre l mrna è prodotto in un mutante laci. Questi risultati suggeriscono che: Il gene laci è un gene di regolazione il cui prodotto è la proteina repressore che mantiene bloccata la sintesi. Poiché il repressore è necessario per bloccare la sintesi dell mrna, la regolazione da parte del repressore è una regolazione negativa. Quantità di -galattosidasi, permeasi, e mrna di lac (unità arbitrarie) Lattosio aggiunto mrna di lac 5 10 Tempo in minuti Lattosio rimosso -Galattosidasi Permeasi FIGURA 11.3 La natura acceso-spento del sistema lac. L mrna di lac compare subito dopo che è aggiunto il lattosio o un altro induttore. La β-galattosidasi e la permeasi compaiono quasi simultaneamente, ma dopo la sintesi dell mrna a causa del tempo richiesto per la traduzione. Quando il lattosio è rimosso, l mrna non è più sintetizzato e la quantità di mrna di lac decresce a causa della degradazione dell mrna che già avviene. β-galattosidasi e permeasi sono entrambe proteine stabili. Le loro quantità rimangono costanti anche quando la loro sintesi cessa. Tuttavia, la loro concentrazione per cellula gradualmente diminuisce in seguito a ripetute divisioni cellulari. 384 CAPITOLO 11 I meccanismi molecolari della regolazione genica

6 Tabella 11.1 Caratteristiche di diploidi parziali che contengono diverse combinazioni di alleli laci, laco e lacp Genotipo Sintesi di mrna lacz Fenotipo Lac 1. F laco c lacz laco lacz Costitutivo 2. F laco lacz laco c lacz Costitutivo 3. F laci lacz laci lacz Inducibile 4. F laci lacz laci lacz Inducibile 5. F laco c lacz laco lacz Inducibile 6. F laco c lacz laco lacz Costitutivo 7. F laci s lacz laci lacz Non inducibile 8. F laci lacz laci s lacz Non inducibile 9. F lacp lacz lacp lacz Inducibile 10. F lacp lacz lacp lacz Inducibile 11. F lacp lacz lacp lacz Non inducibile 12. F lacp lacz lacp lacz Inducibile Come la proteina repressore laci si leghi al DNA e prevenga la sintesi dell mrna lac sarà spiegato dopo. Un mutante laci è privo della proteina repressore e di conseguenza la trascrizione è costitutiva. Copie selvatiche della proteina repressore sono presenti in un diploide parziale laci + /laci e quindi la trascrizione è repressa. È importante notare che il singolo gene laci + previene la sintesi dell mrna di lac sia dal plasmide F che dal cromosoma. Pertanto la proteina repressore deve essere capace di diffondere all interno della cellula, poiché è in grado di bloccare la sintesi dell mrna da entrambe le molecole di DNA presenti nel diploide parziale. Esperimenti di mappatura genetica hanno posizionato il gene laci molto vicino al gene lacz e hanno stabilito che l ordine dei geni era laci lacz lacy. Facendo riferimento ancora alla Tabella 11.1, i genotipi 7 e 8 indicano che le mutazioni laci S sono dominanti e agiscono in modo da bloccare la sintesi dell mrna dal plasmide F e dal cromosoma sia in presenza che in assenza di induttore (la lettera in apice di laci S sta a significare superrepressore). Le mutazioni laci S determinano la produzione di molecole del repressore che non sono capaci di riconoscere e di legare l induttore, quindi reprimono la sintesi di mrna lac anche in presenza dell induttore. La regione dell operatore Le righe 1 e 2 della Tabella 11.1 mostrano che le mutazioni laco C sono dominanti. Tuttavia, la dominanza è evidente soltanto in certe combinazioni delle mutazioni lac, come si può vedere esaminando i diploidi parziali delle righe 5 e 6. Entrambe le combinazioni sono lac + perché è presente un gene funzionale lacz. Tuttavia nella combinazione mostrata alla riga 5, la sintesi della -galattosidasi è inducibile anche se è presente una mutazione laco C. La differenza sta nel fatto che nella riga 5 la mutazione laco C è presente sulla stessa molecola di DNA della mutazione lacz, mentre nella riga 6 laco C è nella stessa molecola di DNA di laz +. La caratteristica chiave di questi risultati è che: Una mutazione laco C determina la sintesi costitutiva della -galattosidasi soltanto quando gli alleli laco C e lacz + sono presenti nella stessa molecola di DNA. La mutazione laco C è definita cis-dominante, poiché soltanto i geni nella configurazione in cis (nella stessa molecola di DNA che contiene la mutazione laco C ) sono espressi in modo dominante. Una conferma di questa conclusione deriva da un osservazione biochimica importante: l enzima mutante derivato dalla sequenza lacz è sintetizzato in modo costitutivo in un diploide parziale laco C lacz / laco + lacz + (riga 5), mentre l enzima selvatico (codificato dalla sequenza lacz + ) è sintetizzato soltanto se è aggiunto un induttore. Tutte le mutazioni laco C sono localizzate tra i geni laci e lacz, quindi l ordine dei geni dei quattro elementi genetici del sistema lac è: laci laco lacz lacy. Una caratteristica importante di tutte le mutazioni laco C è che esse non possono essere complementate (una caratteristica tipica di tutte le mutazioni cis-dominanti), ovvero un allele laco + non può modificare l attività costitutiva di una mutazione laco C. Questa osservazione implica che la regione laco non codifica per un prodotto diffusibile e deve invece definire un sito nel DNA che determina se la sintesi del prodotto del gene adiacente lacz sia inducibile o costitutiva. La regione laco è chiamata operatore. Nel prossimo paragrafo vedremo che l operatore è di fatto un sito di legame del DNA per la proteina repressore. La regione del promotore Le righe 11 e 12 della Tabella 11.1 dimostrano che le mutazioni lacp, come le mutazioni 11.2 Il sistema di regolazione genica dell Operone 385