Esiste una relazione tra morfologia e funzione cellulare. La forma di una cellula è altamente indicativa della sua funzione e della sua normalità

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1 Esiste una relazione tra morfologia e funzione cellulare La forma di una cellula è altamente indicativa della sua funzione e della sua normalità

2 La morfologia delle cellule è strettamente collegata ad un complesso di fibre che si estende nel citoplasma e che si proietta lungo tutte le estroflessioni della membrana plasmatica: il CITOSCHELETRO

3 Il citoscheletro è formato da una complessa rete di filamenti proteici che si estende dal nucleo alla membrana attraverso il citosol Il citoscheletro è presente solo nelle cellule eucariotiche

4 Una cellula in ipossia o con blocco della fosforilazione ossidativa assume morfologia tondeggiante per depolimerizzazione del citoscheletro.

5 forma una struttura di sostegno che determina, oltre che la forma della cellula, l organizzazione del citoplasma (posizionamento e distribuzione degli organuli cellulari, compreso il nucleo) FUNZIONI DEL CITOSCHELETRO contribuisce al mantenimento dell integrità dei contatti cellula-cellula è responsabile dei movimenti cellulari è coinvolto nell Organogenesi e nell Istogenesi (Migrazione cellule embrionali, Orientamento). è determinante nella divisione cellulare (formazione del fuso mitotico e citodieresi)

6 I tre principali elementi strutturali del citoscheletro Microtubuli Microfilamenti Filamenti intermedi Actina: 6 nm Miosina: 15 nm 8-11 nm

7 MICROTUBULI Organizzazione e mantenimento della forma della cellula Disposizione e movimento degli organelli Trasporto vescicolare Movimento di cromosomi alla divisione cellulare Motilità cellulare tramite appendici (ciglia e flagelli)

8 Eterodimero di tubulina Struttura Tubo cavo con una parete formata da 13 protofilamenti Diametro Esterno 25 nm - Interno 15 nm Subunità α-tubulina e β-tubulina

9 L α-tubulina è associata a GTP, la β-tubulina al GDP (che viene scambiato con GTP prima dell assemblaggio) I microtubuli hanno una polarità

10 La tubulina ha conformazione globulare, con una tasca per una molecola di GTD/GDP. I monomeri contenenti GTP dimerizzano facilmente (eterodimerizzano). Nel dimero il GTP della tubulina alfa è in qualche modo protetto, mentre quello della beta è rapidamente idrolizzato in GDP. La stessa tubulina ha attività GTPasica.

11 Una terza isoforma di tubulina, la γ-tubulina costituisce circa il il 5% di tutta la tubulina, è localizzata prevalentemente nel centrosoma e nei centrioli ed è cruciale per l assemblaggio dei microtubuli. Negli ultimi anni sono state individuate almeno altre 4 isoforme di tubulina, non presenti in tutte le cellule e dalle funzioni poco note. Una preparazione di microtubuli purificati è formata per l 80-90% da tubulina e per il restante 10-20% da MAP (proteine associate al microtubulo)

12 I microtubuli hanno origine dal centrosoma * Il centrosoma è una struttura complessa che contiene due centrioli circondati da materiale pericentriolare (PCM) amorfo ed elettrondenso.e funziona come Centro di Organizzazione dei Microtubuli (MTOC) *nove fibrille regolarmente spaziate ognuna delle quali formata, in sezione trasversale, da una banda di tre microtubuli (A,B e C)

13 Il centrosoma è costituito prevalentemente da γ-tubulina e da altre proteine (Spc97 e Spc98) che insieme formano il γ-turc (γtubulin Ring Complex) Il corretto assemblaggio del complesso γ-turc è assistito dalla Pericentrina, una proteina la cui concentrazione fluttua con il ciclo cellulare Benché i centrioli non siano direttamente coinvolti nella nucleazione dei microtubuli, hanno probabilmente un ruolo nel reclutare il PeriCentriolarMaterial

14 Nella matrice del centrosoma sono presenti molti complessi γ-turc, ognuno dei quali funziona come centro di nucleazione dei microtubuli L estremità dei microtubuli è immersa nella matrice del centrosoma

15 I microtubuli si rimodellano di continuo in seguito al verificarsi di cicli di polimerizzazione/depolimerizzazione, sono cioè dinamicamente instabili

16 Live-cell imaging: a) le proteine fluorescenti sono sintetizzate come proteine di fusione contenente GFP b) le subunità vengono rese fluorescenti in vitro e poi iniettate nella cellula L instabilità dinamica è essenziale per i cambiamenti di forma della cellula e per alcuni tipi di movimenti cellulari

17 L instabilità dinamica dei microtubuli risponde alle esigenze della cellula Distribuzione dei microtubuli in una cellula vegetale durante il ciclo cellulare: 1) interfase 2) avvicinandosi alla mitosi delineano la fascia del piano di divisione 3) in mitosi formano il fuso 4) riorganizzazione della parete delle due cellule figlie

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19 Nel dimero il GTP della tubulina beta è facilmente idrolizzato in GDP, ma quando la polimerizzazione è abbastanza veloce (alta concentrazione di eterodimer isolubili) nuovi dimeri con beta-gtp vengono reclutati così che l estremità contiene sempre GTP. Quando la velocità di polimerizzazione diminuisce il GTP dell estremità + viene idrolizzato a GDP il che induce una modifica conformazionale dell eterodimero. L eterodimero diventa più instabile così come le interazioni laterali tra protofilamenti. La conclusione di questa serie di eventi è la depolimerizzazione del microtubulo

20 Proteine associate ai microtubuli La funzionalità dei microtubuli dipende da numerose proteine accessorie (MAP = Microtubule Associated Proteins) che svolgono vari compiti: 1) Proteine stabilizzanti i microtubuli 2) Proteine destabilizzanti i microtubuli 3) Proteine motrici dei microtubuli ( chinesine e dineine)

21 1) Proteine stabilizzanti i microtubuli La stabilizzazione selettiva dei microtubuli, da parte di proteine accessorie che si legano alla loro estremità, determina la polarità cellulare

22 Altre proteine stabilizzanti si legano alla parete dei microtubuli difendendoli da attacchi idrolitici e favorendone l associazione in fasci. La proteina Tau è specifica delle cellule nervose. La sua funzione è legata allo stato di fosforilazione di suoi specifici residui aminoacidici.

23 Patologia Umana Una mutazione* della proteina Tau, è presente in molte malattie neurodegenerative in cui si osserva accumulo di fasci anomali di proteina Tau, assemblaggio ridotto e disorganizzazione dei microtubuli, inibizione del trasporto anterogrado assonemale, degenerazione neuronale *la proprietà delle MAP di legarsi ai microtubui è controllata dallo stato di fosforilazione di alcuni residui aminoacidici. La mutazione della Tau comporta una iperfosforilazione della proteina.

24 2) Proteine destabilizzanti i microtubuli Tra le proteine destabilizzanti, alcune sequestrano l eterodimero/gtp riducendo la sua concentrazione e quindi la velocità di polimerizzazione, (alcune di queste proteine sono iperespresse in certe forme tumorali), altre hanno la proprietà di frammentare i microtubuli

25 3) Proteine motrici dei microtubuli (chinesine e dineine) Dineina Chinesina

26 La chinesina e la dineina usano l energia derivante dall idrolisi dell ATP per camminare lungo i microtubuli, trasportando organelli membranosi Chinesina Dineina

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28 Le proteine motrici associate ai microtubuli sono importanti per: -il trasporto di vescicole -il trasporto assonale -il movimento di ciglia e flagelli

29 Trasporto assonale: la maggior parte del materiale (compresi i neurotrasmettitori) viene inserito in vescicole membranose. Ma lungo i microtubuli dell assone vengono trasportate anche molecole libere (RNA, ribosomi ). Nei neuromotori il percorso può coprire anche la distanza di un metro (vel. max 5 μm/sec.)

30 Movimento assonale anterogrado (chinesine) e retrogrado (dineine) Le vescicole trasportate legano sia la chinesina che la dineina ma a seconda del trasporto una delle due è inattivata. Ambedue le proteine sono legate alla membrana della vescicola tramite intermediari: la chinesina utilizza proteine integrali o periferiche di membrana, la dineina proteine solubili.

31 Patologia Umana Tra i carichi mossi dalla dineina troviamo gli endosomi, i lisosomi, le vescicole derivanti dal RE e il virus dell HIV che è trasportato nel nucleo della cellula infettata. Difetti nel trasporto assonale sia anterogrado che retrogrado sono stati associati ad alcune malattie neurologiche.

32 I microtubuli e le proteine motrici si assemblano in una struttura altamente specializzata nelle ciglia e nei flagelli: L ASSONEMA

33 Assonema = coppie di mt periferiche e 1 centrale Nelle coppie periferiche un mt (A) completo ed uno addossato incompleto Zona transizione= ha organizzazione intermedia tra assonema e corpo basale Corpo basale= 9 triplette di mt disposte a cerchio (mt completi) ha la stessa struttura di centriolo (=9 triplette in cerchio);

34 Patologia Umana Mutazioni dei geni che codificano per la dineina si associano a quadri patologici caratterizzati da broncopatie ostruttuive e sterilità. Le ciliopatie rappresentano una vasta gamma di gravi patologie molte delle quali indicative di errori durante lo sviluppo (sono ciliate le cellule che durante la gastrulazione determinano il piano di organizzazione di un mammifero). ESEMPIO: sindrome di KARTAGENER (deficit di dineina) alterazioni dell apparato respiratorio, infertilità maschile, situs viscerum inversum

35 tre microtubuli costituiscono il fuso mitotico: mt del cinetocore, mt dei cromosomi, mt polari (non si attaccano ai cromosomi ma si stabilizzano sovrapponendosi l un l altro). I mt dell aster partono dal centrosoma e si dirigono in periferia; servono ad allontanare i poli del fuso.

36 I cromosomi si muovono verso i poli del fuso lungo i microtubuli del cinetocore. Il movimento è guidato da proteine motrici associate al cinetocore e dirette verso l estremità- del mt. L azione di queste proteine è associata al disassemblaggio del mt.

37 FILAMENTI INTERMEDI Mantenimento della forma della cellula Supporto strutturale e resistenza meccanica Formazione dell impalcatura nucleare

38 Struttura Subunità fibrose avvolte in un filamento simile a una corda Diametro Subunità 8-12 nm Parecchie proteine diverse tessuto-specifiche

39 I filamenti intermedi sono costituiti da proteine diverse nei diversi tipi cellulari Cheratine Negli epiteli Vimentina e vimentino-simili Nel tessuto connettivo, muscolare e neurogliale citoplasmatici Neurofilamenti Nelle cellule nervose Lamìne nucleari In tutte le cellule nucleate nucleari

40 Le proteine dei filamenti intermedi sono tutte proteine fibrose e condividono un dominio centrale ad alfa elica che è conservato per dimensioni, struttura e in alcuni casi sequenza.

41 Cheratine: Epiteli Vimentina: fibroblasti e cell mesenchimali Nella TRANSIZIONE EPITELIO/MESENCHIMA (EMT) Scompaiono le cheratine, sostituite dalla vimentina nella stessa cellula Stabilità dei filamenti intermedi Regolazione della polimerizzazione dei filamenti intermedi da parte della fosforilazione (PKA, p38 MAPK)

42 INIBIZIONE DI p38 MAPK: Riduzione di citocheratine, Aumento di espressione di Vimentina

43 La diversità dei filamenti intermedi è clinicamente utile nella diagnosi dei tumori Man mano che i tumori crescono le caratteristiche strutturali del tessuto normale scompaiono Tuttavia, tumori di origine sconosciuta possono essere diagnosticati mediante l identificazione dei loro filamenti intermedi con anticorpi specifici. Ad esempio, i tumori che esprimono citocheratine possono essere classificati come carcinomi (di origine epiteliale) e distinti dai sarcomi (di origine mesenchimale) che esprimono vimentina.

44 Disposizione dei filamenti intermedi all interno della cellula Filamenti intermedi citoplasmtici Làmina nucleare

45 Patologia Umana Epidermolisi Bollosa Dovuta ad alterazioni genetiche o acquisite del collagene, cheratina, laminina, desmocolina, desmoplachina, desmoleina, placoglobina, placofillina, integrine e altre che formano desmosomi ed emidesmosomi, strutture proteiche deputate alla adesività cellulare.

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48 LAMINE NUCLEARI: A, B, C La lamina B ha un ruolo strutturale e la delezione di questo gene è Incompatibile con la vita Mutazioni della lamina Lamina A sono presenti nella Hutchinson Gilford progeria syndrome. Gli individui affetti acquisiscono precocemente caratteristiche senili (scleroderma, aterosclerosi, cecità) sie muoiono in genere prima dell adolescenza. Lo studio della progeria è estremamente interessante perché riguarda lo studio dei meccanismi di invecchiamento cellulare Lamine: modificazioni dinamiche del nucleo. Ruolo nell espressione genica e nel controllo della forma del nucleo

49 La regolazione della forma del nucleo operata dalle lamine ha un impatto anche Nella migrazione cellulare, come evidenziato da saggi di migrazione Migrazione cellulare su Transwell Nucelo di soggetto normale Stimolo chemiotattico Deficit di LAMINA A