ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Ricerca di Pseudomonas aeruginosa

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1 numero 12 maggio 2009 ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Ricerca di Pseudomonas aeruginosa Microrganismo con elevata capacità di adattamento, Pesudomonas aeruginosa è pressoché ubiquitario ed è possibile ritrovarlo sia nel suolo che nelle acque e sulla vegetazione; in generale è diffuso in tutti gli ambienti umidi o con acqua stagnante, con possibilità di moltiplicarsi a temperature tra 4 e 42 C (temperatura ottimale). A causa della sua elevata resistenza a disinfettanti ed antibiotici, assume una particolare importanza la sua presenza in ambiente ospedaliero, dove può essere causa di infezioni opportunistiche. La ricerca di Pseudomonas aeruginosa come indicatore di qualità in acqua potabile, piscine, acque di forniture ospedaliere è legata alla necessità di verificare l efficacia del trattamento a cui sono soggette; nel caso delle acque imbottigliate, la sua presenza è indice di cattiva procedura di confezionamento o conservazione e per questo motivo deve essere obbligatoriamente assente. I metodi analitici utilizzati sfruttano la capacità delle colonie di Pseudomonas aeruginosa di produrre pigmenti e includono varie prove addizionali di conferma. Sintetizzeremo nelle prossime pagine i metodi che prevedono la tecnica di filtrazione su membrana, per i quali è in vigore attualmente la normativa ISO 16266:2006, ripresa anche dalla UNI EN 16266:2008, che va a sostituire la norma UNI EN 12780: Fasi della Procedura L acqua da analizzare va campionata in bottiglie sterili da 500 ml, nelle quali va aggiunto, in caso di acque clorate, sodio tiosolfato al 10% nella quantità di 1 ml (100 mg) per 1 litro di acqua (codice TS15-D). La procedura da seguire può essere suddivisa in quattro fasi fondamentali: 1. Filtrazione del campione 2. Crescita su terreno agarizzato 3. Subcultura 4. Conferma delle colonie KAIROSafe review n. 12, maggio /5

2 2. Filtrazione del campione Il campione di acqua (generalmente un volume di 100 ml per le acque di distribuzione e 250 ml per le acque imbottigliate) viene filtrato sterilmente attraverso una membrana di esteri di cellulosa, grigliata, con diametro di 47 mm e pori di 45 µm (codice ME47NC45100/01). Si utilizza a questo scopo un sistema filtrante collegato ad una pompa a vuoto, facendo attenzione, durante il procedimento, a porre il lato quadrettato della membrana verso l alto. 3. Crescita su terreno agarizzato La membrana impregnata viene posta, con l ausilio di una pinzetta sterile, sulla superficie del terreno agarizzato Pseudomonas CN (codice 127), quindi si procede all incubazione della piastra a 36 ± 2 C per 44 ± 4 ore, verificando la crescita dopo 22±2 ore e dopo 44 ± 4 ore. Le colonie verdi-blu (per produzione di piocianina) sono confermate come Pseudomonas aeruginosa. Le colonie che appaiono marroni-rossastre (per produzione di piorubina) o fluorescenti alla lampada di Wood (per produzione di fluoresceina) vanno invece sottoposte alle prove di conferma, dopo subcultura. Va evitato di sottoporre le colonie alla lampada di Wood per tempi troppo lunghi, in quanto l esposizione alla radiazione UV può compromettere la vitalità delle colonie e quindi i test successivi. Il controllo qualità in questa fase può esser effettuato con ceppi microbici certificati, utilizzando come controllo positivo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (codici MP-GP-P02, MS-P030), come controllo negativo Escherichia Coli ATCC (codici MP-GP-E02, MS-E025). 4. Subcultura Un numero rappresentativo di colonie sospette (fluorescenti o marroni-rossastre) vanno trasferite su piastre con Nutrient Agar (codici 20519, 20518) ed incubate a 36 ± 2 C per 22±2 ore. Le colonie che si sviluppano vanno sottoposte alle prove di conferma. 5. Conferma delle colonie fluorescenti Le colonie fluorescenti, dopo subcultura vanno sottoposte alla prova di conferma per la verifica delle produzione di ammonio da acetamide. KAIROSafe review n. 12, maggio /5

3 5.1. Produzione di ammonio da acetamide Le colonie cresciute su Nutrient Agar vengono trasferite in provette contenenti 5 ml di Acetamide Broth (codice 20041), quindi incubate a 36 ± 2 C per 22 ± 2 ore. Dopo l incubazione, si aggiungono 1-2 gocce di Reattivo di Nessler (codice 72190): Pseudomonas aeruginosa è in grado di produrre ammonio e in presenza del reattivo si svilupperà una colorazione giallo-rossa (l intensità dipenderà dalla concentrazione di ammonio prodotto). Le colonie positive saranno quindi confermate come Pseudomonas aeruginosa, senza la necessità di ulteriori conferme. 6. Conferma delle colonie marroni-rossastre Le colonie che apparivano marroni-rossastre, dopo subcultura vanno sottoposte a varie prove di conferma: prova della citocromo ossidasi, verifica della produzione di fluorescenza su terreno King B, verifica delle produzione di ammonio da acetamide Prova della citocromo ossidasi Le colonie cresciute su Nutrient Agar vanno prelevate con ansa sterile e strisciate su appositi dischetti impregnati con Reattivo alla Tetrametil-parafenilendiammina dicloridrato (codice 70439), che in presenza dell enzima porta alla formazione di blu indofenolo. Pseudomonas aeruginosa, come anche le altre specie di Pseudomonas, è un microrganismo citocromo ossidasi positivo e svilupperà in pochi secondi una colorazione blu-violetta. La positività a questo test non dà comunque un risultato definitivo: le colonie devono essere sottoposte anche alle successive prove di conferma Verifica della produzione di fluorescenza su King B Le colonie cresciute su Nutrient agar che sono risultate positive alla prova di citocromo ossidasi vanno trasferite in provette con 5 ml di Pseudomonas King B Agar (codice 20023). L incubazione viene effettuata a 36 ± 2 C fino a 5 giorni, verificando giornalmente l eventuale fluorescenza con lampada di Wood Produzione di ammonio da acetamide Le colonie dopo subcultura vanno sottoposte anche al test per la produzione di ammonio da acetamide, seguendo quanto indicato al punto 5.1. Le colonie fluorescenti su King B e positive a questo test sono confermate come Pseudomonas aeruginosa. KAIROSafe review n. 12, maggio /5

4 7. Tabella riassuntiva Le prove necessarie per la conferma finale delle colonie di Pseudomonas aeruginosa sono riassunte nella tabella seguente. Caratteristiche colonie su Pseudomonas CN agar Blu-verdi Fluorescenti (non blu-verdi) Marronirossastre Produzione di ammonio da acetamide nt + + Produzione di ossidasi nt nt + Fluorescenza su King B nt nt + Pseudomonas aeruginosa Confermate Confermate Confermate Nt: test non necessario +: test positivo Terreni di coltura e reagenti per la ricerca di Pseudomonas, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Membrane filtranti e flaconi Codice Descrizione Formato TS15-D Flaconi sterili da 500 ml con 50 mg sodiotiosolfato 100 pz ME47NC45100/01 Terreni di Coltura e Reattivi Membrana filtrante sterile, grigliata, 47 mm, pori 0,45 µm, conf. singola 100 pz 127 Pseudomonas CN Agar 10 piastre 60 mm Nutrient Agar 20 piastre 90 mm Nutrient Agar 4 flaconi da 100 ml Acetamide Broth 10 provette da 5 ml Reattivo di Nessler 500 ml Dischi di reattivo per citocromo ossidasi 50 dischi Pseudomonas King B Agar 10 provette da 5 ml I terreni di coltura sono disponibili anche in formato disidratato, con i supplementi necessari KAIROSafe review n. 12, maggio /5

5 Ceppi microbici di controllo per la ricerca di Pseudomonas, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Ceppi di controllo Codice Ceppo liofilizzato ATCC * Controllo Confezione 1 MP-GP-P02 Pseudomonas aeruginosa 9027 Positivo 5 MicroPellets MS-P030 Pseudomonas aeruginosa 9027 Positivo 2 Microswabs MP-GP-E02 Escherichia coli Negativo 5 MicroPellets MS-E025 Escherichia coli Negativo 2 Microswabs 1 MicroSwabs: Sistema costituito da una provetta di plastica con tappo a serbatoio a cui è applicato un tampone ovattato. Il pellet di microrganismi si trova sul fondo della provetta mentre il liquido di ricostituzione è all'interno del tappo/serbatoio e viene fatto defluire con un semplice movimento. Il tampone permette lo striscio diretto sui terreni in piastra. Il pellet contiene un minimo di 1000 UFC. MicroPellets: Sistema costituito da un pellet liofilizzato e da 1 ml di soluzione reidratante. Il pellet, una volta reidratato, dà origine ad una sospensione a titolo noto ( CFU / 0.1 ml), permettendo una semina quantitativa. * The ATCC Licensed Derivative emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark and the ATCC catalog marks are trademarks of ATCC used under license. Kairosafe is licensed to use these trademarks and to sell licensed products manufactured for Mecconti using ATCC materials derived from ATCC cultures. Look for the ATCC Licensed Derivative emblem for products derived from ATCC cultures. Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: KAIROSafe review n. 12, maggio /5