Salmonella: patogenesi, epidemiologia e diagnostica

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1 Salmonella: patogenesi, epidemiologia e diagnostica Elisabetta Delibato elisabetta.delibato@iss.it Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Istituto Superiore di Sanità

2 Malattie trasmesse da alimenti Sono un grave problema di Sanità Pubblica che interessa tutti gli strati sociali della popolazione in tutti i paesi del mondo Sono la maggior causa di morbilità (numero di malati) sia nei paesi industrializzati che in quelli in via di sviluppo, ed in questi ultimi anche di mortalità

3 Sono patologie prevedibili mediante il rispetto di corrette norme igieniche nella manipolazione degli alimenti Il numero di tossinfezioni alimentari che si verifica in un Paese è stato proposto dall Organizzazione Mondiale della Sanità quale indicatore dello stato di benessere sociale

4 Fattori che condizionano l insorgenza delle tossinfezioni nell uomo Concentrazione della carica microbica nell alimento Virulenza del ceppo Età del soggetto Presenza di patologie intestinali, deficit proteico, alterato ecosistema intestinale Malattie concomitanti, deficit immunologici,

5 Salmonella Due specie: S. enterica e S. bongori La specie enterica èsuddivisa in sei sottospecie. Oggi si conoscono più di 2400 sierotipi della specie enterica La Salmonella è: bastoncello gram-negativo aerobio-anaerobio facoltativo asporigeno mobile per la presenza di flagelli

6 Caratteristiche fisiche Salmonella è un microrganismo che si sviluppa bene a temperatura ambiente e ancora meglio a C Possiede un intervallo di temperatura utile alla moltiplicazione compreso tra +5,2 e +46 C, il freddo ne rallenta lo sviluppo Non viene inattivata dal congelamento Viene uccisa dal calore a 70 C per 15 min Viene uccisa dalla pastorizzazione e non produce tossine termoresistenti E sensibile ai più comuni disinfettanti (mercurocromo, ipoclorito di sodio, acido fenico, formaldeide, acqua ossigenata..)

7 Caratteristiche antigeniche La Salmonella possiede numerosi antigeni e tra questi quelli più conosciuti sono: vantigeni somatici (O), termostabili e resistenti all azione di acidi e alcool, vantigeni ciliari (H) termolabili, vantigene Vi che dà virulenza Le caratteristiche antigeniche permettono di differenziare i diversi sierotipi

8 MANIFESTAZIONI CLINICHE Il periodo di incubazione èmolto breve: solitamente dopo ore dall ingestione dell alimento contaminato compaiono i principali sintomi: Dolori addominali Nausea e vomito Febbre Diarrea Nei soggetti debilitati, nei lattanti e nei bambini la sintomatologia può essere dominata dai segni della disidratazione ed assumere un decorso più grave

9 Patogenesi delle infezioni da Salmonella E un fenomeno complesso e multifattoriale: Ingestione della salmonella attraverso il cibo Moltiplicazione nell intestino Invasione della mucosa intestinale Replicazione rapida con liberazione di LPS Processo infiammatorio (febbre, nausea, vomito, dol. add). Dopo 15 h insorge la diarrea con feci molli e acquose con tracce di muco e sangue

10 Avvenuta l ingestione del germe, lo sviluppo dell infezione sintomatica dipende dal numero di batteri ingeriti (dose minima infettante cellule), ma può variare nei diversi sierotipi e in dipendenza delle condizioni dell ospite. Nei neonati e negli adulti immunocompromessi si assiste talvolta al passaggio da una forma enterica ad una sistemica con complicanze a livello di vari organi.

11 Fattori di patogenicità Le salmonelle possiedono diversi fattori di virulenza, necessari ad attuare tutte le varie fasi dell infezione: Sistemi di difesa che permettono la sopravvivenza in ambienti a ph acido, utili per superare la barriera gastrica Fattori che intervengono al momento della colonizzazione dell intestino, permettendo al batterio di aderire efficacemente alle cellule del lume intestinale Fattori che consentono di attraversare l epitelio intestinale e di sopravvivere nei macrofagi

12 CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA da Salmonella Contaminazione all'origine (Primaria); La contaminazione è primaria quando le materie prime nascono nei luoghi di produzione con all interno il pericolo Contaminazione dovute alle pratiche di lavorazione (Secondaria). La principale fonte di contaminazione secondaria degli alimenti sono l uomo e le attrezzature utilizzate per la lavorazione. Contaminazione crociata. E il passaggio diretto o indiretto di microrganismi da alimenti contaminati (solitamente crudi) ad alimenti pronti al consumo o che hanno già subito trattamenti di bonifica come la cottura

13 Fattori di rischio L infezione da salmonella si trasmette per via oro-fecale. Gli alimenti contaminati rappresentano quindi uno dei veicoli più importanti di diffusione per l uomo. In particolare, sono a rischio: le uova crude o poco cotte, derivati a base di uova, latte crudo e derivati dal latte crudo (compreso il latte in polvere), acqua contaminata, carne di bovino e di maiale, polli e derivati (specie se poco cotti), salse e condimenti per insalate, dolci alla crema, gelato, cacao, vegetali crudi.

14 Alimenti di origine vegetale Essendo coltivati in ambienti naturali sono soggetti alla contaminazione da organismi patogeni. I prodotti vengono spesso consumati crudi o comunque senza interventi che possano ridurre la presenza di tale patogeno. Il cambiamento delle abitudini alimentari con la maggiore disponibilità dei prodotti della IV gamma hanno notevolmente incrementato la produzione alimenti pretagliati. L acqua, i fertilizzanti, la presenza di animali nei campi di coltura, la scarsa sanitizzazione delle attrezzature, l igiene del personale durante le fasi produttive possono essere causa di tali contaminazioni..

15 Fattori di rischio sono anche le superfici e gli utensili contaminati, l'abuso della temperatura, la contaminazione crociata. Negli animali da fattoria, la trasmissione èmediata da mangimi e fertilizzanti Negli animali l'infezione si diffonde durante l'allevamento o l'abbattimento.

16 La PREVENZIONE delle salmonellosi prevede: Applicazione di misure igieniche atte a prevenire o almeno limitare la contaminazione oro-fecale Controllo sulle fonti di approvvigionamento idrico e sulle acque di balneazione Riconoscimento dei portatori nell ambito del personale ospedaliero e degli addetti alle industrie alimentari Proteggere gli alimenti dal contatto con veicoli importanti di contaminazione

17 Cuocere con cura tutti i cibi di origine animale in modo particolare pollame, maiale, uova, prodotti derivati dalle uova, piatti a base di carne e i frutti di mare di qualunque tipo Evitare il contatto tra gli alimenti di diverso genere, tra i cibi cotti e crudi, ponendo attenzione agli utensili usati, stoviglie e i piani di lavoro Lavare i vegetali accuratamente con acqua potabile prima del consumo

18 Epidemiologia In Italia, le infezioni umane da Salmonella sono soggette a notifica obbligatoria al SSN I dati riportati nel bollettino epidemiologico del Ministero della Salute mostrano: casi di salmonellosi per anno 50% dei focolai epidemici di tossinfezione alimentare èsostenuto da Salmonella La mortalità causata da infezioni da Salmonella èdi circa 20 decessi annui e principalmente in soggetti anziani I sierotipi più frequentemente isolati nell uomo, negli ultimi anni, sono S. Enteritidis e S. Typhimurium

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26 Regolamento (CE) 2073/2005 Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari Entrato in vigore il a complemento della 852/2004 Il regolamento sostituisce le precedenti normative della UE che riportano criteri microbiologici Destinatari dei criteri microbiologici Imprese di produzione Produzione primaria Trasformazione Distribuzione Vendita al dettaglio Ristorazione Controllo ufficiale L autorità competente verifica che vengano rispettati i criteri da parte delle imprese attraverso appositi audit sulle procedure basate sull HACCP

27 CRITERI DI SICUREZZA ALIMENTARE PARAMETRI MICROBIOLOGICI Listeria monocytogenes Salmonella Enterobacter sakazakii Escherichia coli Enterotossine stafilococciche Istamina

28 CRITERI DI IGIENE DI PROCESSO PARAMETRI MICROBIOLOGICI Conteggio colonie aerobiche Salmonella Escherichia coli Stafilococchi coagulasi postivi Enterobacteriaceae Bacillus cereus

29 Salmonella e Criteri di Sicurezza

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32 In tutte le categorie è prevista l assenza di Salmonella?

33 REGOLAMENTO (UE) N. 1086/2011 DELLA COMMISSIONE del 27 ottobre 2011 che modifica l allegato II del regolamento (CE) n. 2160/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio e l allegato I del regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione per quanto riguarda la salmonella presente nella carne fresca di pollame REGOLAMENTO (CE) N. 2160/2003 DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 17 novembre 2003 sul controllo della salmonella e di altri agenti zoonotici specifici presenti negli alimenti «Lo scopo del presente regolamento è quello di garantire che siano adottate misure adeguate ed efficaci di individuazione e di controllo della salmonella e di altri agenti zoonotici in tutte le fasi pertinenti di produzione, trattamento e distribuzione, segnatamente a livello di produzione primaria, compresi i mangimi, in modo da ridurne la prevalenza e il pericolo per la sanità pubblica.»

34 Il regolamento definisce la necessità di adozione di obiettivi di riduzione e del controllo delle salmonelle a carattere zoonosico lungo tutta la filiera alimentare in varie specie animali, a partire dai controlli su: Controllo sui mangimi Controllo sugli animali dalla schiusa fino alla macellazione mangimi pulcino Galline ovaiole Polli da riproduzione Polli da ingrasso Tacchini Controllo delle feci e tamponi su stivali/calze Controllo sui prodotti finiti

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36 EFSA Panel on Biological Hazards Panel Members Type: Opinion of the Scientific Committee/Scientific Panel On request from: European Commission Question number: EFSA-Q Adopted: 26 March 2009 Published: 14 April 2009 Il gruppo di esperti scientifici sui pericoli biologici ha sottolineato che: Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium sono responsabili dell 80% dei casi riportati di malattie nell uomo, e sono considerate di primaria importanza per la salute pubblica. Tutti gli altri sierotipi presi singolarmente costituiscono meno dell 1% dei casi segnalati nell uomo

37 Salmonella Enteritidis è il sierotipo associato più frequentemente a malattie legate a polli e carne di pollo, a uova e prodotti a base di uova. Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium presentano il più alto potenziale di trasmissione verticale e pseudoverticale, a partire dalle galline da riproduzione fino alla progenie di polli da carne e galline ovaiole.

38 REGOLAMENTO (UE) N. 1086/2011 DELLA COMMISSIONE del 27 ottobre 2011 che modifica l allegato II del regolamento (CE) n. 2160/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio e l allegato I del regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione per quanto riguarda la salmonella presente nella carne fresca di pollame La definizione di un criterio per Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium costituirebbe il miglior equilibrio possibile tra la riduzione della salmonellosi umana attribuita al consumo di carne di pollame e le conseguenze economiche derivanti dall applicazione del criterio.

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40 Da ciascuna carcassa di pollame, proveniente dallo stesso branco prelevare 10 g di pelle di collo 25 g g g g 25 g gg n = 50, c = 5Polli/7 Tacchini criterio di igiene di processo Se positivi per Salmonella spp. SE o ST = criterio di sicurezza

41 Piani nazionali di controllo salmonella coordinati dall IZS Venezie Misure del programma Le misure di controllo previste sono: controllo veterinario sistematico in allevamento; campionamenti ufficiali e di autocontrollo; vaccinazione dei gruppi destinati al ripopolamento; misure in caso di riscontro di positività; ottimizzazione delle misure di biosicurezza. Analisi dei campioni con: EN/ISO 6579/2002 Amd 1:2007 Metodo alternativo se validati secondo EN/ISO 16140

42 Misure del programma Le misure di controllo previste sono: controllo veterinario sistematico in allevamento campionamenti ufficiali e di autocontrollo vaccinazione dei gruppi destinati al ripopolamento; misure in caso di riscontro di positività ottimizzazione delle misure di biosicurezza

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47 METODICHE DI ANALISI DI RIFERIMENTO Metodi colturali di riferimento affidabili ma lunghe: hanno l obiettivo di isolare o numerare, mediante l impiego di terreni colturali, i microrganismi presenti nei campioni da sottoporre ad analisi I metodi per il rilevamento di microrganismi in campioni alimentari possono essere divisi in due gruppi: qualitativi o presenza/assenza, nei quali viene richiesto semplicemente di rilevare se un particolare organismo è presente o assente in un dato campione. quantitativi o enumerativi, nei quali viene determinato il numero di microrganismi presenti nel campione e il risultato viene espresso come numero di organismi presenti per unità in peso di campione

48 METODICHE APPLICABILI ALLA DETERMINAZIONE DELLA SALMONELLA NEGLI ALIMENTI Metodiche tradizionali affidabili ma lunghe: hanno l obiettivo l di isolare o numerare, mediante l impiego l di terreni colturali, i microrganismi presenti nei campioni da sottoporre ad analisi Metodiche rapide presentano il vantaggio di potere ottenere i risultati in 24 ore e consentono di prendere misure tempestive, ai fini del: controllo delle materie prime rilascio dei prodotti verifica dei piani HACCP sistema di allerta controllo ufficiale

49 EN/ISO 6579 Metodo orizzontale per rilevare la presenza di Salmonella spp. in alimenti per uso umano e mangimi Prearricchimento realizzato in BPW. Previsto anche per la rivitalizzazione dei di cellule danneggiate dai processi di conservazione degli alimenti. Tale fase non è selettiva e tende ad innalzare il numero dei microrganismi Arricchimento selettivo in RVS e MKTTn serve a limitare lo sviluppo della flora accessoria. MKTTn RVS

50 Isolamento permette l identificazione presuntiva mediante semina su terreni agarizzati selettivi: Xylose lisine desoxycholate (XLD) e Brilliant grenn agar (BGA) XLD non inoculato Salmonella su XLD BGA non inoculato Salmonella su BGA

51 Identificazione viene effettuata mediante prove biochimiche e sierologiche Prova di conferma biochimica per l utilizzazione di 3 zuccheri (lattosio, saccarosio e glucosio) su TSI. TSI agar a becco di clarino Colture tipiche di Salmonella: superficie rossa, fondo giallo (acido da glucosio) con formazione di gas. (Nota: Salmonellelattosio +: superficie gialla). Nel 90 % dei casi si nota annerimento dell'agar per formazione di idrogeno solforato TSI: terreno non inoculato, Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium. Prova di conferma biochimica con API 20E Prova di conferma sierologica

52 Metodo orizzontale per rilevare la presenza di Salmonella spp. in alimenti per uso umano e mangimi: EN/ISO 6579 Campione 25g Tempo totale di analisi:5-7 giorni Sacchetto sterile Acqua peptonata tamponata (APT) 225 ml 0.1 ml Omogenizzazione in "Stomacher" per 1' 1 ml Mueller Kauffman (10 ml) Rappaport Vassiliadis Soya broth (10 ml) 37 C x 24 h 37 C x 24 h 41.5 C x 24 h 1 ansata 1 ansata XLD BGA XLD BGA 37 C x 24h Prelievo colonie sospette Triple sugar iron agar XLD BGA XLD BGA 37 C x 24h Test di agglutinazione sierologica

53 Il Regolamento 2073 specifica i metodi di riferimento EN/ISO con cui verificare la conformità degli alimenti e consente l impiego di metodi alternativi ARTICOLO 5 L impiego di metodi alternativi èaccettabile quando tali metodi sono validati in base al metodo di riferimento, e se èutilizzato un metodo proprietario certificato da una terza parte in base al protocollo definito nella norma EN/ISO o ad altri protocolli analoghi accettati a livello internazionale Necessità di ricorrere a metodi rapidi in grado di dare nei tempi più brevi possibili le informazioni sull origine e la diffusione dei prodotti contaminati

54 Metodi di analisi alternativi applicabili alla determinazione della Salmonella negli alimenti Maggiore rapidità di risposta Maggiore sensibilità e specificità Automazione di molte fasi Costi più contenuti Possibilità di avere una risposta quantitativa

55 Metodi molecolari (PCR e Real time PCR) Metodi alternativi Metodi immunologici che si basano su reazioni Ag-Ab supportati da vari sistemi di rivelazione MAb di mouse Salmonella PAb di mouse Metodi microbiologici che utilizzano una fase di arricchimento (terreno + substrato selettivo) seguito da una fase di isolamento su terreno cromogeno