Corso di Formazione Genopom-Pro. Dr.ssa Angela Flagiello

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1 Corso di Formazione Genopom-Pro Studio del Proteoma Dr.ssa Angela Flagiello Lab. Proteomica (Prof. P. Pucci) CEINGE Biotecnologie Avanzate s.c.a r.l. Via Comunale Margherita, Napoli Tel

2 I parte (parte teorica): PROGRAMMA Proteoma e proteomica. Tecniche elettroforetiche e tecniche cromatografiche. La spettrometria di massa. Spettrometria di massa tandem ed identificazione di proteine mediante spettrometria di massa e spettrometria di massa tandem. II parte (parte di attività di laboratorio o pratica): Idrolisi in situ di campioni proteici su gel. Estrazione di peptidi ed analisi di massa di miscele peptidiche. Ricerca in banca dati per identificazione di proteine. N.B. Da svolgere al Dipartimento di Scienze Chimiche presso il Complesso Universitario di Monte S.Angelo, Via Cinthia, 4, NAPOLI.

3 Proteoma = Proteine codificate dal Genoma I l proteoma Ë líinsieme di tutte le proteine espresse in un organismo nello stesso momento allo stesso tempo, incluse tutte le isoforme e le modificazioni post-traduzionali. Il genoma Ë líinsieme dei geni di un organismo, parte dei quali codificanti per le sue proteine (ESONI), parte dei quali regolativi della trascrizione (INTRONI). Alla trascrizione segue la traduzione, processo con il quale vengono espresse le proteine. Mentre il genoma Ë costante per una data cellula, identico per tutte le cellule di un organismo e non cambia molto allíinterno di ogni specie, il proteoma Ë molto dinamico nel tempo e in risposta a fattori esterni e differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari. La Proteomica Ë la scienza che studia il Proteoma ovvero líinsieme delle proteine, che derivano dai vari tessuti o tipi cellulari, nella globalit della loro funzione e/o espressione.

4 Nel 2003 è stato completato il sequenziamento del Genoma umano.

5 Nel 1994 in un Congresso Internazionale a Siena, Mark Wilkins, un ricercatore americano, usò per la prima volta pubblicamente il termine Proteome. L insieme di tutte le PROTeine espresse da un genoma. Proteomica: Analisi sistematica delle proteine di estratti cellulari, tessuti, interi microorganismi o di proteine che mostrano una comune funzione biologica.

6 What is proteomics? The identification, characterization and quantification of all proteins involved in a particular pathway, organelle, cell, tissue, organ or organism that can be studied in concert to provide comprehensive data about that system The analysis of structural/functional genomics through the systematic study of the functions, interactions, cellular location, expression and post-translational modifications of proteins on a high-throughput scale. New York, 2001

7 Le scienze omicheª Genomica Trascrittomica Proteomica G Complessit sistema crescente Metabolomica

8 Le scienze OMICHE e l era high-throughput Genome sequencing MicroArray 2D-MS GC-MS

9 La rivoluzione copernicana dellíera postgenomica Conventional path Function Structure Gene Post-genomic age Gene sequence Protein sequence Protein Map 2D-PAGE, pi, mol. wt. Functional Genomics Structure of Protein Proteomics Function

10 Confronto APPROCCI SPERIMENTALI CONVENZIONALE PROTEOMICO Identificazione di attività enzimatica Purificazione della singola proteina Caratterizzazione funzionale in vitro Caratterizzazione strutturale in vitro Sequenziamento e determinazione struttura primaria mediante EDMAN Identificazione del gene Predizione dell intera sequenza amminoacidica a partire da quella genica Studio dell espressione della proteina Studio dell intero proteoma Identificazione delle proteine significative Determinazione struttura primaria mediante de novo sequencing e ricerche in banche dati Identificazione del gene Caratterizzazione funzionale in vivo (organismi knock out, silenziamento genico, studio dei pathways cellulari ecc) Caratterizzazione strutturale in vivo (PTMs, NMR, interazioni, ecc) Studio dell espressione della proteina

11 Approccio Convenzionale Approccio proteomico

12 RELAZIONE DNA-RNA- PROTEINA Proteoma e trascrittoma sono due entità temporalmente sfasate e difficilmente correlabili. Non c è correlazione tra quantità di mrna e quantità di proteina (aggresomi, degradazione mrnas, turn over delle proteine, ecc). Il proteoma mette in evidenza varianti di splicing e modifiche post traduzionali.

13 Sconfessione del DOGMA CENTRALE della BIOLOG Splicing alternativo Transcription (Reverse) Translation Modifiche posttraduzionali

14 PROGETTO GENOMA UMANO Human Proteome 100,000-1,000,000 protein variants Human Genome 20,000-30,000 genes

15 Varianti di splicing

16 Modifiche post-traduzionali (PTM) Acetilazione, Metilazione Fosforilazione, Nitrazione etc.. Ci sono più di 250 modifiche posttraduzionali.

17 SECONDA SCONFESSIONE

18 CARATTERISTICHE DI UN PROTEOMA Complessità Variabilità Dinamicità

19 E.coli S.cerevisiae D.melanogaster Zebrafish 4397 genes 7103 genes genes genes?! H.sapiens C.elegans genes genes

20 Protein Interactome Gavin AC & Superti Furga G (2003) Curr.Opin.Chem.Biol.; 7(1):21-27

21 Il principio dell economia molecolare

22 CARATTERISTICHE DI UN PROTEOMA Complessità Variabilità

23 Cerca le differenze.

24 Il Proteoma può variare tra due individui della stessa specie. Il Proteoma in uno stesso individuo può variare nel tempo. Il Proteoma può variare in risposta ai cambiamenti ambientali.

25 Un genoma Molti proteomi

26 Bruco Farfalla Stesso genoma Ö diverso proteoma! SINGOLO GENOMA MOLTEPLICI PROTEOMI

27 CARATTERISTICHE DI UN PROTEOMA Complessità Variabilità Dinamicità

28 La dinamicità del Proteoma

29 La dinamicità del Proteoma

30 CAMPIONE DI SIERO: PROTEINE PIU ABBONDANTI IgG e ALBUMINA DEPLEZIONE ALBUMINA

31

32 Principali domande alle quali la proteomica tenta di rispondereöö 1) Quali proteine, anche solo differentemente modificate, sono presenti in una cellula o in un tessuto in un dato momento ed in certe condizioni? PROTEOMICA D ESPRESSIONE 2) Quali proteine sono differentemente sovra e/o sottoespresse, oppure modificate e/o degradate in una cellula o in un tessuto in certe condizioni? 3) Con quali altri partners molecolari interagisce una specifica proteina (networks, interattomica)? PROTEOMICA DIFFERENZIALE PROTEOMICA FUNZIONALE

33 Molti proteomi -> diverse proteomiche..

34 Identificazione di proteine a partire da molecole intatte e NON dai peptidi da esse generati mediante trattamenti di idrolisi. Identificazione di proteine a partire dai peptidi da esse generati mediante trattamenti di idrolisi. Metodologia applicabile a proteine frazionate mediante elettroforesi mono o bidimensionale oppure a proteine NON pre-frazionate e trattate secondo líapproccio della Shot-gun proteomics (idrolisi dellíintero proteoma di interesse con successiva separazione della complessa miscela di peptidi ottenuti mediante tecniche cromatografiche mono o pi spesso bidimensionali).

35 Ci_ che Ë necessario per il successo di questo approccioö.. Un modo facile e veloce per purificare proteine (e peptidi). Un metodo sensibile per ottenere informazioni strutturali (MS). Accesso a databases di sequenze di proteine o DNA. Sistemi informatici capaci di tradurre e collegare il linguaggio della sequenza del DNA con le informazioni strutturali delle proteine.

36 Approccio proteomico e tecnologia Preparazione e prefrazionamento Campioni ( Isolamento dei complessi proteici) Identificazione delle proteine (studio delle PTM) Utilizzo della Bioinformatica Cromatografia di affinità Immunoprecipitazione Gel Filtrazione Blue Native Tecniche di spettrometria di massa: -Peptide Mass Fingerprinting -LC-MS MS Softwares e databases

37 The Computational Biology Challenge

38 High-throughput mapping Separation of all proteins 2-DE electrophoresis Differential comparison Protein-interaction mapping Multiprotein complexes purified by affinity (antibodies) Identification of all proteins by MS Control Cells Apoptotic Cells Identification of proteins by MS Complexes separated by electrophoresis 1-D or 2-DE or 2-D nano HPLC Databases 2-DE databases Accessible on the Net Bioinformatic Identification of proteins by MS

39 La tecnologia di 2 a generazione. Protein separation Peptide separation 4 Multidimensional (SCX-RF) Capillary Chromatography 4 Affinity chromatography of labelled peptides Identification and quantitation 4 MS/MS Peptide sequencing 4 Quantitation by isotopic tagging (SILAC, ICAT, itraq)

40 LASER Sorgente MALDI Opportuna matrice organica Analiti di origine batterica Cellule batteriche intatte Analiti proteici Analiti LPS Analiti LOS Analiti peptidici

41 Tecnologia che consente di analizzare componenti sia endogeni che esogeni presenti nei tessuti, mantenendo nel contempo la loro orientazione spaziale. Mass spectrometric images of a mouse brain section. Stoeckli M et al. Nat Med 2001, 7:

42 Blood identification by Proteomics

43 seeembra facile!!! Human Blood Human hemoglobin

44 Ovotransferrina Ovalbumina Vitellogenina Lisozima Mioglobina di Balena

45 Giotto and Cimabue s frescos in the Basilica of Assisi Enzymatic hydrolysis Bovine Beta Casein Bovine Kappa Casein Bovine Alfa S1 Casein MILK Anal Bioanal Chem. 395 (2009) 2269

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