AVVISO. Lunedì 26 MAGGIO ore 14:00 aula P1/P2 nuova prova APP

Transcript

1 AVVISO MARTEDI 6 MAGGIO I/II GRUPPO :45 GIOVEDI 8 MAGGIO III/IV GRUPPO :45 II PIANO V MEDICA VISIONE DELLA PROVA SCRITTA APP E VERBALIZZAZIONE Lunedì 26 MAGGIO ore 14:00 aula P1/P2 nuova prova APP

2 Recettori con attività enzimatica Dominio catalitico inattivo Dominio catalitico attivo Segnalazione intracellulare

3 RECETTORI CON ATTIVITA ENZIMATICA INTRINSECA RECETTORI COLLEGATI AD ENZIMI

4 Classi di recettori con attività enzimatica Recettori tirosina-chinasi Recettori associati a tirosina-chinasi Recettori serina-treonina chinasi Recettori tirosina-fosfatasi Recettori guanilico ciclasi Recettori associati a istidina-chinasi

5 La fosforilazione in tirosina coinvolge una minima parte del fosfato legato alle proteine (la maggior parte di questo modifica post-trascrizionalmente le proteine su serina e treonina): Le proteine fosforilate in tirosina sono generalmente coinvolte nel controllo della proliferazione e del differenziamento. La prima chinasi specifica per la fosforilazione di questo aa fu identificata negli anni 80. Da allora, per omologia di sequenza, sono state identificate decine e decine di tirosin-chinasi, tutte coinvolte in proliferazione e differenziamento.

6 Molti fattori di crescita agiscono tramite recettori tirosin-chinasici (RTK) - Fattore di crescita dell epidermide (EGF) Stimola la proliferazione di vari tipi cellulari - Insulina Stimola l utilizzo dei carboidrati e la sintesi proteica - Fattore di crescita insulino-simile (IGF-1) Stimola la crescita e la sopravvivenza di molti tipi cellulari - Fattore di crescita dei nervi (NGF) Stimola la crescita e sopravvivenza dei neuroni - Fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) - Fattore che stimola le colonie macrofagiche (M-CSF) - Fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) - Fattore vascolare endoteliale (VEGF) Stimola la proliferazione di fibroblasti e altri tipi cellulari Stimola la proliferazione e il differenziamento dei macrofagi Stimola sopravvivenza e proliferazione di vari tipi cellulari Stimola l angiogenesi

7 Finora sono stati individuati circa cinquanta RTK che condividono parti della loro struttura Porzione extracellulare Singolo dominio transmembrana Porzione intracellulare con il dominio enzimatico e con il sito di interazione per i substrati

8

9 Il ligando si lega simultaneamente a due catene recettoriali adiacenti provocando la dimerizzazione e attivazione del recettore con legame di ATP in siti specifici Una volta attivato il dominio chinasico trasferisce gruppi fosfato su residui di tirosina del recettore stesso (autotrans-fosforilazione) Le tirosine fosforilate vengono riconosciute da molecole citoplasmatiche dotate di particolari domini e comincia la trasduzione del segnale

10 La dimerizzazione e la trans-fosforilazione spiegano il comportamento dominante-negativo di alcune mutazioni nei geni per i RTK Mutazioni dominanti nel gene FGFR-3 sono responsabili dell acondroplasia (mancato sviluppo armonico della cartilagine di accrescimento delle ossa lunghe degli arti).\

11 Il dominio SH2 (Src Homology 2) è una sequenza di circa 100 aa contenenti, nella porzione centrale, un aa basico in grado di interagire con la carica negativa del fosfato. Gli aa circostanti la tirosina fosforilata stabilizzano l interazione. Dalla sequenza aa del dominio recettoriale si può dedurre la molecola segnale con cui interagisce.

12 I domini SH2 sono presenti in proteine cellulari con diversa funzione chinasi Proteine che modificano i lipidi tirosina fosfatasi Inibitori delle proteine G adattatori Fattori trascrizionali

13 Alcune delle proteine reclutate dai recettori RTK che attivano diverse vie di segnalazionedi segnalazione Via della fosfolipasi C Attivata anche dalle proteine G trimeriche Via della fosfatidilinositolo 3-chinasi Attivata anche dalle proteine G trimeriche Via di Ras

14 L attivazione della via di Ras ha un ruolo importante nella mitogenesi (altamente conservata nel corso dell evoluzione dal lievito ai mammiferi) L attivazione della via della PI3K ha un ruolo importante nella sopravvivenza e nella crescita cellulare, e nel metabolismo del glucosio

15 La proteina Ras è una proteina G monomerica, che si attiva per legame di GTP ed ha attività GTPasica L attivazione del recettore stimola lo scambio GTP/GDP Attività GTPasica intrinseca Attiva una cascata di chinasi a valle

16 L attivazione di Ras da parte di un recettore tirosina chinasi attivato Ras inattiva Ras attiva Proteina adattatrice Grb2 Fattore di scambio del nucleotide guanilico Sos Ras non è in grado da sola di sostituire il GDP con il GTP. Per questo utilizza il fattore di scambio Sos Sos è una proteina citoplasmatica presente in un complesso con la proteina adattatrice Grb2 reclutato dal recettore attivato tramite i

17 Le piccole GTPasi (distinte dalle grandi GTPasi eterotrimeriche associate a recettore a 7 eliche transmembrana GPCR) della famiglia RAS; Proliferazione, della famiglia RHO: Rho, Rac, Cdc42 regolazione del citoscheletro ed espressione genica Ran: trasporto dentro e fuori del nucleo Rab: formazione di vescicole e traffico di membrana

18 L attività delle piccole GTPasi è regolata da: GEF (GTP exchange factor): Sos. Possono essere fosforilate in tirosina (Vav1) GAP (GTPases activating protein) p190rhogap favoriscono lo scambio GTP per GDP GDI Inibitori della dissociazione del GDP. Rho GDI forma un complesso Con Rho e lo mantiene inattivo nel citoplasma

19 Gismondi et al. Journal of Immunology, 2003 Integrine b2 attivano Rac in linfociti Integrine inducono fosforilazione In tirosina della GEF VAV in linfociti

20 Le piccole GTPasi, una volta attivate, possono attivare la via delle MAP chinasi (Mitogen Activated Protein Kinases) Le MAPK sono chinasi a Serina/Treonina. Sono conservate dal lievito in poi e presenti in tutte le cellule in quanto sovrintendono a funzioni essenziali dell organismo. Il dominio di attivazione contiene un motivo caratteristico Treonina-X- Tirosina. La loro attivazione segue un caratteristico schema MKKK- MKK-MK (vedi la successiva diapositiva) Le MAPK vengono inattivate da fosfatasi (dual specific phosphatases, DUSP) che defosforilano i residui di tirosina e treonina del motivo di attivaziobne

21 La cascata delle MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) Raf Proteina Ras attiva MEK ERK Attivazione di proteine e geni coinvolti nella crescita e nella proliferazione cellulare

22 Fattore di crescita (mitogeno) Un modello semplificato di un modo in cui i mitogeni stimolano la divisione cellulare Attivazione di una proteina che regola geni Gene myc Gene ciclina D Gene SCF Gene E2F Attivazione di G1-cdk Degradazione di p27 (inibitore cdk) Trascrizione di geni di fase S Ingresso in fase S

23 KSR (kinase suppressor for RAS) as a scaffold for MAPK pathway

24 Paxillin (focad adhesion protein) as a scaffold for MAPK pathway

25 la via delle MAPK è attivata anche dalle integrine

26

27 p38 MAPK pathway

28 FORMAZIONE DEL COMPLESSO AP-1 DA PARTE DELL ATTIVAZIONE DELLE VIE DI ERK E JNK

29 AP-1 regulates Interleukin-2 (IL-2) gene expression

30 Attivazione del recettore dell Insulina recettore con attività tirosinochinasica

31 Signalling dell IR: induzione del pathway PI3K/AKT +mtor IRS=substrato per il recettore dell insulina (IRS1/2)

32 AKT controlla l espressione in membrana del trasportatore del glucosio tramite esocitosi

33 L attivazione della via della fosfatidil-inositolo 3 chinasi (PI3K) ha un ruolo importante nella sopravvivenza e nella crescita cellulare

34 Un modo in cui la segnalazione tramite PI3K promuove la sopravvivenza (chinasi TOR) Fattore di crescita amminoacidi Recettore attivato PI3K attivata

35

36 La famiglia di recettori di TGFbeta (transforming growth factor) regola sviluppo, fibrosi, sviluppo del sistema immunitario e ha un ruolo nella tumorigenesi

37 Convergenza, divergenza e interazione tra diverse vie di trasduzione del segnale La fosfolipasi C è una proteina con dominio SH2, attivata anche dalla via dei recettori accoppiat1 a proteine G. La PKC, attivata da I3P e DAG, della via delle proteine G trimeriche,fosforila anche le MAPK, che solo così sono competamente attivate.

38 Integrazione tra i vari pathway indotti da diversi recettori: integrine e fattori di crescita

39 Cross talk recettore per EGF/recettore per adrenalina

40 Centralità del pathway di RAS/MAPK

41 La morte cellulare programmata è regolata da una complessa rete di segnali alcuni agiscono inducendo la morte della cellula mentre altri ne promuovono la sopravvivenza

42 Ruolo della Morte Cellulare Sviluppo Morfogenesi Organogenesi Teratogenesi Mantenimento dell'omeostasi tissutale Inestino, Pelle, Sangue, etc..

43

44

45

46 First studies: Caenorabditis elegans The proximal cause of apoptosis in C. elegans is the activation of the cysteine protease ced-3, which is mediated by its oligomerization at the activator protein ced-4. Activity of the ced-3/ced-4 complex is regulated by the apoptosis inhibitor ced-9 and the apoptosis inducer egl-1

47 Ruolo della Morte Cellulare Malattie Cancro Neurodegenerazione,Alzheimer's, Parkinson s Autoimmunità, Lupus Infezioni HIV, Influenza, EBV Infarto Cardiaco, Ischemia

48 Morte Cellulare e Patologie Diminuzione della Morte Cellulare Cancro (incontrollata proliferazione cellulare) Infezioni Croniche (Adenovirus ed Herpes virus) Malattie Autoimmuni

49 Morte Cellulare e Patologie Aumento della Morte Cellulare Neurodegenerazione (Parkinson ed Alzheimer) Ischemia Cerebrale (in seguito a riperfusione) Autoimmunità (Lupus; linfociti B producono anticorpi che riconoscono il self) Infezioni virali (HIV)

50 Necrosi Morte cellulare incontrollata - Rigonfiamento cellulare e di tutti i compartimenti Apoptosi Morte cellulare programmata - Perdita dei contatti cellulari - Condensazione citoplasmatica e riduzione del volume cellulare - Permeabilita alterata della membrana - Permeabilita normale della membrana - Lisi cellulare con rilascio di enzimi lisosomiali nel fluido extracellulare - Infiammazione - Cromatina condensata in tipici aggregati granulari - Frammentazione tipica della cromatina - Frammentazione della cellula in corpi apoptotici senza rilascio di citoplasma - Esposizione della fosfatidilserina - Infiammazione assente

51 Compattamento e separazione della cromatina Condensazione del citoplasma Frammentazione del nucleo Formazione di vescicole Frammentazione della cellula necrosi apoptosi FAGOCITOSI Corpo apoptotico Cellula fagocitica

52 L esposizione della fosfatidil-serina sul versante extracellulare della membrana funziona da segnale eat me

53 Il macchinario intracellulare responsabile dell apoptosi dipende dall attivazione di una famiglia di proteasi chiamate caspasi C = cisteina nel centro reattivo; ASP = riconoscono un residuo di acido aspartico nell ambito di una sequenza di 4 amminoacidi; ASI = sono enzimi proteolitici Sono presenti nella cellula come precursori inattivi (procaspasi) che si attivano a seguito di taglio proteolitico Attivazione via taglio proteolitico da parte di un altra caspasi procasp asi inattiva caspasi attiva

54 BERSAGLI DELLE CASPASI: Proteine chinasi come FAK, PKB, PKC e RAF Lamine nucleari Proteine del citoscheletro Una endonucleasi chiamata CAD (Dnasi attivata dalla caspasi)

55 La cascata delle caspasi attiva l apoptosi

56 L attivazione delle caspasi può essere innescata attraverso due strade LA VIA ESTRINSECA Segnali extracellulari e recettori di superficie LA VIA INTRINSECA Segnali endogeni regolati dai mitocondri

57 Una via di trasduzione di un segnale apoptotico mediato da una molecola extracellulare solubile (TNF) o dall Interazione tra CD95 (FAS) e il suo ligando (FAS-ligando)

58 Una via di trasduzione di un segnale apoptotico mediato da una molecola extracellulare di membrana FasL membrana cellulare di un linfocita killer recettore Fas membrana di una cellula bersaglio citoplasma attivazione della caspasi detta iniziatore precursore della caspasi detta iniziatore cascata di attivazione delle caspasi

59 Nella via estrinseca, la Caspasi-8 agisce da iniziatore della via delle caspasi. Una azione chiave è l attivazione della caspasi effettore che è La Caspasi-3

60 ATTIVAZIONE DELL APOPTOSI DALL INTERNO DELLA CELLULA (via intrinseca) La proteina antiapoptotica Bcl2 controlla la permeabilità della membrana mitocondriale al citocromo C La via intrinseca è indotta in seguito a vari stress, come danni al DNA, scompensi nella progressione del ciclo, mancanza di sostanze nutritive, ipossia ecc. In molti tipi cellulari la via intrinseca dell apoptosi è costitutivamente attiva in assenza di fattori di sopravvivenza, che quindi agiscono come fattori anti apoptotici

61 Nella via estrinseca, la Caspasi-8 agisce da iniziatore della via delle caspasi. Una azione chiave è l attivazione della caspasi effettore che è La Caspasi-3 Nella via intrinseca, i mitocondri innescano l apoptosi rilasciando citocromo c nel citosol. La proteina anti-apoptotica Bcl2 impedisce il rilascio di citocromo c dai mitocondri. Quando Bcl2 è inattivata, il citocromo c stimola rilascio del calcio dal reticolo endoplasmico, dove si lega ai recettori di IP3. Il citocromo c è in grado di attivare la procaspasi-9, associata ai mitocondri, mediante il reclutamento di Apaf- 1, che assembla le molecole di procaspasi-9 in un complesso, detto APOPTOSOMA. Questo complesso attiva la caspasi effettore che è sempre la Caspasi-3

62 Un esempio: la sopravvivenza dei neuroni dipende da una molecola segnale secreta dalle cellule bersaglio

63 Un modo in cui la segnalazione tramite PI3K promuove la sopravvivenza (chinasi Akt) Segnale di sopravvivenza Recettore attivato PI3K attivata Fosforilazione e attivazione di Akt dissociazione Bad inattiva Akt attiva Inibizione di BCL2 FOSFORILAZIONE DI Bad Attivazione di BCL2 INIBIZIONE DELL APOPTOSI

64 Due modi in cui i fattori di sopravvivenza possono inibire l apoptosi Produzione aumentata della proteina anti-apoptotica Bcl2 Inattivazione della proteina pro-apoptotica Bad La proteina anti-apoptotica Bcl2 impedisce il rilascio di citocromo c dai mitocondri

65 File:Signal transduction pathways.svg