I fosfolipidi. Figura 3: tipica struttura di un fosfolipide. Schema 1. Struttura del fosfolipide POPE.

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1 Proprietà chimico-fisiche di modelli di sistemi biologici Materiale didattico per lo stage presso il laboratorio NanoBioLab Abstract L attività è basata sull utilizzo di tecniche sperimentali avanzate per lo studio di nanostrutture di interesse biologico. Gli studenti prenderanno familiarità con due tecniche sperimentali: la tecnica Langmuir-Blodgett (LB) ed il microscopio a forza atomica (AFM). Con la prima tecnica impareranno a formare e caratterizzare monostrati di fosfolipidi (i mattoni elementari delle membrane biologiche) all interfaccia aria-acqua. I monostrati formati verranno poi trasferiti su un supporto solido. Il campione così formato verrà poi analizzato a risoluzione nanometrica con il microscopio a forza atomica. Gli studenti apprenderanno la fisica alla base delle tecniche utilizzate e utile per la comprensione degli esperimenti. Verranno fornite dispense relative agli argomenti trattati. Al termine dello stage, gli studenti acquisiranno una autonomia sufficiente per eseguire l esperimento. La durata dello stage è di una settimana. Introduzione Gli studenti delle scuole superiori hanno spesso una familiarità con le trasformazioni di fase da gas a liquido visualizzate in un diagramma pressione-volume (p-v). In questi diagrammi (un esempio è riportato in figura 1) viene riportato l andamento della pressione di un gas in funzione del volume mantenendo la temperatura costante (isoterme). Per un gas ideale vale la legge pv = cost, per cui le isoterme sono rappresentate da iperboli, mentre landamento sperimentale osservato per gas reali è interpretabile ricorrendo all equazione di van der Waals. Seguendo l andamento delle curve partendo da volumi elevati si ha una prima regione in cui la sostanza, al diminuire del volume aumenta la sua pressione rimanendo nella sua fase di gas. Ad un certo punto, nell isoterma inizia una regione orizzontale in cui alla diminuzione di volume non corrisponde più un aumento di pressione (tra a e b). Questa è la regione in cui si ha la transizione di fase da gas a liquido. La pressione costante in questa regione è la tensione di vapore del liquido alla temperatura Figura 1: Diagramma p-v per un gas reale

2 corrispondente all isoterma. Terminata la regione orizzontale comincia una regione in cui tutto il gas si è trasformato in liquido e ad ogni piccola diminuzione di volume si ha un notevole aumento di pressione. Nel diagramma mostrato esiste un punto particolare, il punto C, che prende il nome di punto critico. Esso è associato ad una temperatura, pressione e volume critici. Isoterme effettuate ad una temperatura inferiore alla temperatura critica presentano una regione di coesistenza tra la fase gas e liquido, mentre isoterme effettuate a temperature superiori non consentono di passare ad una fase liquida. Quest'ultima situazione è quella dei gas ideali. Se molecole anfifiliche, dotate cioè sia di una parte idrofobica che di una idrofilica, insolubili in acqua vengono disperse all'interfaccia tra una subfase acquosa e l'aria esse rimarranno all'interfaccia con la parte idrofilica rivolta verso la subfase acquosa e la parte idrofobica rivolta verso l'aria. Se la superficie di interfaccia disponibile per le molecole disperse viene diminuita, l'aumento della densità delle molecole avrà un effetto sulla tensione superficiale della subfase. Le variazioni di tensione superficiale al variare dell'area a disposizione delle molecole vengono studiate mediante uno strumento chiamato "Langmuir trough" (figura 2). In esso l'area superficiale a disposizione delle molecole viene variata spostando delle barriere in teflon e la tensione superficiale viene misurata con una bilancia detta di "Wilhelmy" (vedere più avanti). In questo modo, se viene controllata la temperatura della subfase, è possibile effettuare un analogo bidimensionale di ciò che viene fatto nei diagrammi p-v di gas in tre dimensioni. La pressione in 3 dimensioni diventa la variazione della tensione superficiale (pressione superficiale) e il volume è l'area a disposizione delle molecole. Comprimendo le molecole, il film in due dimensioni va incontro, analogamente al gas reale, a transizioni di fase. Nella esperienza proposta per lo stage gli studenti impareranno ad effettuare isoterme di film di fosfolipidi per diversi valori di temperatura. I fosfolipidi dispersi all'interfaccia verranno compressi misurando la tensione superficiale partendo da basse temperature della subfase. La temperatura verrà alzata e le corrispondenti variazioni nelle isoterme di compressione verranno studiate. Verrà anche studiato l'effetto della presenza di ioni nella subfase nel caso in cui la componente idrofilica delle molecole abbia una carica elettrica netta diversa da zero. a b Figura 2: a) schema di un "Langmuir trough" con molecole di fosfolipide disperse all'interfaccia. B) Foto dello strumento usato nell'esperienza di laboratorio. Il "Langmuir trough" permette inoltre di trasferire film dall'interfaccia subfase/aria su supporti solidi. Questa possibilità permette di trasferire i film e, utilizzando uno strumento capace di ottenere immagini di superfici ad alta risoluzione sia laterale che verticale, di visualizzare la struttura del film e le possibili separazioni di fase presenti. Nell'esperienza i film verranno trasferiti su supporti di mica a diversi valori di pressione superficiale e la loro struttura verrà visualizzata mediante l'uso del microscopio a forza atomica (AFM).

3 I dati che verranno presentati in questo materiale didattico sono presi in larga parte dalla esperienza di laboratorio svolta da studenti a febbraio del 29. Prima di illustrare i dati verrà illustrata la rilevanza biologica dello studio di film di fosfolipidi. I fosfolipidi I fosfolipidi so molecole anfifiliche composte da una testa polare e una componente idrofobica apolare costituita da una catena alifatica degli acidi grassi. In essi la parte idrofobica prevale e i fosfolipidi risultano insolubili in acqua. Lo schema di un tipico fosfolipide è mostrato in figura 3. Figura 3: tipica struttura di un fosfolipide La caratteristica di anfifilicità dei fosfolipidi è ciò che spiega il loro modo di assemblarsi in acqua a formare il doppio strato lipidico. Il doppio strato lipidico rappresenta la membrana attraverso cui una cellula regola gli scambi con l'esterno. Nonostante il singolo monostrato di fosfolipidi non possa essere utilizzato per studi sulle proprietà di trasporto delle membrane, lo studio delle sue proprietà chimico-fisiche ha una notevole importanza per comprendere il comportamento del doppio strato lipidico. Inoltre, è possibile studiare l'interazione tra il monostrato lipidico e proteine che interagiscono con la superficie della membrana cellulare. Lo studio del trasferimento di molecole da una interfaccia liquido/gas ad una superficie solida ha anche notevoli implicazioni di tipo tecnologico. Si pensi per esempio alla possibilità di rendere una superficie biocompatibile ricoprendola con uno strato ordinato di molecole di origine biologica. Durante l esperienza di laboratorio gli studenti lavoreranno con fosfolipidi di tipo 1- Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (POPE), la cui struttura è riportata nello schema 1. Schema 1. Struttura del fosfolipide POPE.

4 La tecnica del Langmuir Trough In un esperimento con un Langmuir trough viene generalmente misurata la pressione superficiale in funzione dell'area a disposizione per molecola. La pressione superficiale è ottenuta come la differenza tra il valore di tensione superficiale per una superficie pura γ (la subfase senza molecole in grado di alterarne la tensione superficiale) e la tensione superficiale dovuta alla presenza di molecole tensioattive γ: = γ γ Π La tensione superficiale è una conseguenza del fatto che le molecole dell'interfaccia non sono completamente circondate da altre molecole come accade invece per le molecole all'interno della sostanza. Da questo sbilanciamento deriva una forza netta che attira le molecole all'interfaccia verso l'interno e ne consegue che il sistema tende a minimizzare la sua superficie di interfaccia. Dal punto di vista termodinamico la tensione superficiale può essere vista come l'energia richiesta per aumentare l'area di interfaccia. Le equazioni termodinamiche richiedono comunque che il numero di molecole rimanga costante. Questo si traduce nel fatto che le molecole anfifiliche all'interfaccia non dovrebbero passare nella subfase. Questa condizione è però generalmente valida solo in prima approssimazione. Misura della tensione superficale In un trough di Langmuir la tensione superficiale viene generalmente misurata attraverso la forza esercitata proprio dalla tensione superficiale su una lamina (tipicamente un rettangolo metallico e fatto con carta da filtro) parzialmente immersa nella subfase (figura 4). Le forze che agiscono sulla Figura 4: Schema di funzionamento di una bilancia di Wilhelmy. lamina sono la forza di gravità e la forza di tensione superficiale rivolte verso il basso e la spinta di Archimede verso l'alto. Complessivamente si può scrivere per la forza sulla lamina: F = F + 2 γ t wcosθ peso F Archimede

5 in cui t è lo spessore della lamina e w è la larghezza della lamina. Se consideriamo il caso in cui la lamina è stazionaria per quanto riguarda la sua immersione nella subfase, la variazione di forza risulterà direttamente collegata alla variazione di tensione superficiale γ. Per una lamina idrofilica (ad esempio una rettangolo di carta da filtro completamente bagnato) l'angolo θ risulta essere. Il sistema può anche essere configurato in modo da mantenere costante la pressione superficiale. Questo viene realizzato attraverso un sistema di retroazione che chiude o apre le barriere al variare del numero di molecole comprese tra le barriere. L'isoterma, ovvero la variazione di pressione superficiale al variare dell'area per molecola L'esperimento più importante al fine di determinare la struttura di un monostrato di Langmuir consiste nell'eseguire una compressione delle barriere misurando la variazione di tensione superficiale che ne consegue. Ciò viene effettuato mentre un bagno termico tiene la temperatura della subfase costante ad un valore fissato. Un esperimento tipico effettuato con lipidi di POPE è quello mostrato in figura 5. POPE 9 C LC LE/ LC LE G 4 Pressione P (mn/m) Area per Molecola (Å 2 ) Figura 5: Isoterma di POPE ottenuta a 9 C su subfase composta di acqua pura. Nel grafico è mostrato l'andamento ottenuto ad una temperatura di 9 C e sono anche indicate le diverse fasi attraverso le quali il monostrato evolve durante la compressione. Per un alto valore dell'area per molecola, la presenza dei fosfolipidi non ha effetto sulla tensione superficiale della subfase pura, per cui la pressione superficiale sarà pari a. Questa fase viene definita gas (G) e corrisponde al caso del gas ideale in cui le molecole non intergiscono tra loro. Per un certo valore di area per molecola le molecole cominciano ad interagire tra loro e ciò causa una diminuzione della tensione superficiale e quindi un aumento della pressione. Questa regione viene definita di liquido espanso (LE). In pratica in questa regione le molecole interagiscono debolmente tra loro e la conformazione della regione idrofobica è disordinata (figura 6a). Continuando la compressione, ad un valore di area per molecola (nel grafico corrispondente a 47 Å 2 ) comincia una regione in cui sono presenti contemporaneamente due fasi del monostrato: la fase LE e una nuova fase detta liquido condensata (LC) in cui le molecole interagiscono fortemente tra loro e la regione idrofobica è ordinata (figura 6b).

6 Figura 6: a) Configurazione delle catene idrofobiche dei fosfolipidi nella fase Liquido Espansa (LE); b) configurazione nel caso della fase Liquido Condensata (LC). Nel caso in tre dimensioni, all'aumentare della temperatura è necessaria una pressione maggiore per indurre la trasformazione in liquido di un gas. Allo stesso modo, in due dimensioni, all'aumentare della temperatura la pressione superficiale che segna l'inizio della transizione di fase aumenta. Tale comportamento può essere descritto dall'equazione di Clapeyron. Una sequenza di isoterme ottenute per lipidi di tipo POPE per temperature comprese tra 8 C e 28 C è riportata in figura 7. All'aumentare della temperatura si può notare sia l'innalzamento della pressione superficiale alla quale comincia la transizione sia la diminuzione della regione di transizione. Pressure P (mn/m) T C Area / Molecola Å 2 Figura 7: Isoterme di POPE in subfase costituita da acqua distillata per un intervallo di temperature da 8 a 28 C. Si può notare come l'andamento delle curve in figura 7 assomigli alle curve mostrate inizialmente in figura 1 per un gas. La zona di transizione tra la fase LE e la fase LC non è orizzontale molto probabilmente a causa della inevitabile presenza di contaminazioni all'interfaccia. La tecnica del Langmuir trough permette anche di trasferire i film formati all'interfaccia liquido gas su una superficie solida. Effettuato il trasferimento è poi possibile studiare i film con tecniche microscopiche in grado di visualizzare la struttura del film. Nel caso il trasferimento avvenga su un supporto idrofilico lo schema da adottare è quello mostrato in figura 8. Il supporto solido viene immerso nella subfase e vengono dispersi i fosfolipidi all interfaccia. Successivamente si comprime il film fino ad una pressione prestabilita alla quale effettuare il successivo trasferimento. Raggiunta la pressione, un sistema di retroazione mantiene

7 costante tale valore aggiustando la chiusura delle barriere. Successivamente si estrae il supporto solido dalla subfase con un conseguente trasferimento di molecole dall interfaccia subfase/aria sul Figura 8: Schema di trasferimento di un monostrato di molecole anfifiliche su un supporto idrofilico tramite tecnica di Langmuir Blodgett. supporto come mostrato in figura 8. La rimozione di molecole dall interfaccia fa sì che le barriere debbano chiudersi al fine di mantenere costante la pressione superficiale durante il trasferimento. Questo consente anche di determinare la resa di trasferimento confrontando la diminuzione di area dovuta alla chiusura delle barriere e l area del supporto solido immersa nella subfase. Una volta trasferito, il film può essere studiato con il microscopio a forza atomica (AFM). La figura 9 mostra le immagini AFM relative a tre trasferimenti effettuati a pressioni superficiali crescenti nella zona di transizione (32 mn/m, 34 mn/m e 36 mn/m) per un monostrato di POPE a 18 C. Le regioni più chiare nelle immagini (di forma circolare) rappresentano zone più alte del monostrato associate con le ragioni di fase liquida condensata (LC). E evidente come all aumentare della pressione superficiale la frazione di fase LC aumenti rispetto alla fase LE. P = 36 mn/m 5 µm P = 34 mn/m 4 Pressione P (mn/m) µm P = 32 mn/m 5 µm Area per Molecola (Å 2 ) Figura 9: Immagini AFM relative ai film trasferiti a diverse pressioni superficiali per un film di POPE a 18 C in subfase di acqua distillata.

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