Trascrizione. Testi Watson et al. Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli Nelson et al, Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli

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1 Trascrizione Testi Watson et al. Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli Nelson et al, Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli Maurizio Crestani

2 I componen) fondamentali del DNA Polimero di nucleo.di Legami 5 3 fosfodiestere Legami idrogeno tra basi complementari 2

3 Funzioni degli acidi nucleici DNA RNA proteine Conservazione dell informazione gene.ca Decodificazione dell informazione gene.ca Interazione con altre molecole Propagazione dell informazione alla progenie 3

4 Flusso dell informazione La regolazione della trascrizione è importante nel controllo di mol. processi cellulari: 1.embriogenesi 2.differenziamento e sviluppo (espressione tessuto specifica di par1colari geni) 3.metabolismo (in risposta a s1moli ambientali) 4.patologie (tumori, aterosclerosi, mala8e neurodegenera1ve etc.) 4

5 Ruolo RNA messaggero DNA RNA proteine DNA localizzato nel nucleo (eucarioti) Sintesi proteica: citosol (ribosomi) DNA e ribosomi non sono in contajo tra loro (eucario)) mrna: intermedio tra DNA e proteine (F. Crick 1958) 5

6 Trascrizione Processo enzima.co ajraverso il quale l informazione contenuta in un gene è decodificata per sinte.zzare un filamento di RNA complementare (trascrijo primario) RNA polimerasi procario. un unico enzima sinte.zza i tre.pi di RNA RNA polimerasi eucario. RNA polimerasi I (rrna) RNA polimerasi II (mrna) RNA polimerasi III (trna e rrna 5S e altri piccoli RNA) 6

7 Trascrizione 3 stadi INIZIO ALLUNGAMENTO TERMINE Direzione di sintesi:

8 Trascrizione: procario) α2ββ ω (core) RNA polimerasi procario. α β ω β α σ Riconoscimento di promotori specifici α2ββ ωσ (oloenzima) Pribnow box 8

9 RNA polimerasi nei procario) Cos.tuita da 5 subunità: α 2 ββ'ω (449 kda) Si lega al promotore tramite fajore σ FaJore σ: specifico per diversi geni Tratto da Voet Voet & Pratt, "Fondamenti di Biochimica" 9

10 RNA polimerasi nei procario) K d oloenzima= 10 7 M (per DNA non promotore; emivita complesso ~ 1 s) K d oloenzima= M (per DNA promotore) K d nucleo enzima= 5x10 12 M (per DNA non promotore; emivita ~ 60 min) Ipotesi: la subunità σ consente di scorrere lungo il DNA fino ad incontrare il promotore specifico. Quando la trascrizione è iniziata la subunità σ si dissocia ed il nucleo dell enzima rimane saldamente ajaccato al DNA 10

11 Inizio e allungamento della trascrizione 11

12 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

13 FaKori σ Specificità per il promotore Φ SPO1 infeja Bacillus sub1lis σ B. sub.lis geni precoci (σ gp28 ) σ gp28 geni mediali (σ gp33/34 ) σ gp33/34 geni tardivi 13

14 Meccanismo d azione della RNA polimerasi

15 Organizzazione dei geni in procario) ed eucario) Procario.: messaggeri policistronici Eucario.: messaggeri monocistronici Gene regolatore Siti di regolazione Geni strutturali I P O Z Y A Operone lattosio 15

16 Terminazione della trascrizione: meccanismo ρ indipendente

17 Terminazione della trascrizione: meccanismo ρ indipendente

18 Terminazione della trascrizione: meccanismo ρ dipendente

19 Terminazione della trascrizione RNA pol RNA + proteine inizio trascrizione fine trascrizione Direzione trascrizione FaJore ρ : esamero (419 aa) È un elicasi che srotola ibridi DNA RNA (richiede energia) 19

20 Trascrizione negli eucario) Complessa Sviluppo embrionale Differenziamento Proliferazione Metabolismo 20

21 RNA polimerasi in eucario) RNA polimerasi I (rrna 18S e 28S) RNA polimerasi II (mrna) RNA polimerasi III (trna, rrna 5S e piccoli RNA) 21

22 RNA polimerasi II 22

23 RNA polimerasi II RNA pol II di lievito: 10 subunità (550 kda) (RNA pol II dei mammiferi ha 12 subunità) RNA pol II non è in grado di iniziare trascrizione: necessari GTFs (General Transcrip.on Factors) (i procario. necessitano solo del fajore σ) GTFs: isola. purificando estral cellulari 23

24 RNA polimerasi II: riconoscimento del promotore

25 Assemblaggio del complesso di preinizio TFIID: lega TATA box complesso mul)proteico (TBP=TATA Binding Protein + TAF=TATA Associated Factors TFIIH: asva RNA polimerasi II mediante fosforilazione del C terminale della subunità grande (Ser2 e Ser5 CTD repeat, YSPTSPS) ASvità elicasica: bolla di trascrizione Tratto da Voet Voet & Pratt, "Fondamenti di Biochimica" 25

26 Inibitori della trascrizione Ac.nomicina D (procario. ed eucario.) si lega al DNA al complesso di inizio e ne previene l allungamento Rifampicina (procario.) si lega alla subunità β della RNA polimerasi e impedisce l allungamento α amani.na (eucario.) si lega all elica a ponte dell RNA pol II impedendo così lo spostamento di DNA e RNA e la liberazione del sito di polimerizzazione 26

27 Maturazione mrna Modificazioni poskrascrizionali Splicing Gli enzimi di maturazione dell RNA sono recluta) dalla coda della RNA polimerasi 27

28 Modificazioni poskrascrizionali Capping al 5 del mrna Poliadenilazione mrna 28

29 Capping avviene quando mrna è nt 29

30 Poliadenilazione mrna (AAUAAA) CstF: cleavage s.mula.on factor CPSF: cleavage and polyadenyla.on specificity factor 30

31 Splicing 31

32 L informazione gene)ca negli eucario) non è con)nua 32

33 Maturazione mrna 33

34 Meccanismo di splicing 34

35 Meccanismo di splicing la strukura a cappio (lariat) L adenosina della strujura a cappio ha tre legami fosfodiesterici 35

36 Meccanismo di splicing L ossidrile in 2 di una specifica adenosina dell introne agisce come nucleofilo, ajaccando l estremità 5 dell introne per formare una strujura a laccio 36

37 Complessi proteici dello splicing 37

38 Splicing alterna)vo 38

39 RNA edi)ng apolipoproteina B100 e B48 39

40 Trasporto di mrna maturo nel citosol 40