Genetica e e gametogenesi, risposta alle terapie per l infertilità,, FIV

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1 Journal Club della Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Genetica e e gametogenesi, risposta alle terapie per l infertilità,, FIV Prof. Alberto Revelli

2 Alterazioni genetiche gametogenesi femminile Alterazioni genetiche gametogenesi maschile Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Preimplantation Genetic Diagnosis

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5 Alterazioni genetiche gametogenesi femminile POF POI Primary amenorrhea or premature depletion of ovarian follicles (<40 yrs) Occult: normal menses and Gn Biochemical: normal menses, Gn Overt: irregular menses, Gn + Reduced fecundity

6 Alterazioni genetiche gametogenesi femminile POF Manifestazioni cliniche Amenorrea primaria con assenza sviluppo puberale Amenorrea secondaria e deplezione follicolare/arresto follicogenesi (extrasistoli,flushes, sudorazione notturna, irritabilità, ansia, depressione, disturbi del sonno..) Infertilità Osteopenia, osteoporosi Patologie neurologiche, metaboliche, cardiovascolari

7 Alterazioni genetiche gametogenesi femminile POF Cause Idiopatiche Iatrogene Genetiche Autoimmuni

8 Alterazioni genetiche gametogenesi femminile Cause genetiche di POF Turner s syndrome X chromosome defects Numerical (45XO, 47XXX, 45X0/46XX mosaicism) Structural (deletions, translocations) Single gene mutations BMP15 FMR1 Autosomal defects FOXL2

9 Alterazioni genetiche gametogenesi femminile Cause genetiche di POF Simpson et al., 2008

10 FMR1 X-linked Premutation Chr X FMR1 gene CGG repeats 35-55: normal individuals : Premutation carriers >200: X-fragile syndrome Trend to expand in size during transmission to offsprings 1/250 women (0.4% of women) 11.5% among women with familial POI, 3.2% among women with sporadic POI 16% of carriers have POI, 3.5% have POI before 29 yrs

11 FMR1 X-linked Premutation and AMH AMH Rohr et al., 2008 AMH AMH Premutation carriers with >70 repeats have significantly lower AMH levels at any age, as early as 18 (precocious depletion of preantral follicles)

12 FMR1 X-linked Premutation Age at menopause repeats repeats repeats Non-carriers Allen et al., 2007 Premutation carriers have shorter intercycle length (FP), higher dizygotic twinning rates, lower bone mineral density vs. age-matched non-carriers

13 BMP15 mutations Chr X Member of TGFbeta superfamily Expressed in the oocyte, forms omo/etherodimers with GDF9 and is involved in follicular growth (proliferation of GCs) Mutations: subfertility/infertility in the mouse and in the ewe

14 Autosomal mutations FOXL2 CYP 17 CYP 19 NOBOX LHX8 NANO53 BPE (Blepharophimosis, Ptosis, Epicanthus) Syndrome type I Ile160Thr Asp224Val Ala189Val Asn191Ile GDF9 GPR3 GALT FSHβ FSHR LHβ LHR Chr 3 Chr 2 exon 10 FSHR inactivating mutations Pro519-Thr, Phe591-Ser, Ala189-Val Pro348Arg Ser680Asn Ala419Thr Pro519Thr Arg573Cys Phe591Ser Thr449Ala Thr449Ile Ile545Thr Ala307Thr Leu601Val Asp567Gly Asp567Asn

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17 Alterazioni genetiche gametogenesi maschile 15-30% delle cause di infertilità maschile Aneuploidie cromosomiche Microdelezioni del cromosoma Y Polimorfismi Mutazioni di geni autosomici

18 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Aneuploidie cromosomiche Causa frequente di azoospermia secretiva S. di Klinefelter (47 XXY) nel 10% delle azoospermie nel 5% delle oligozoospermie

19 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Traslocazioni Perdita di materiale genetico nel punto di rottura Autosomiche: 4-10 volte negli infertili Traslocazioni Robertsoniane (fusione di cromosomi acrocentrici): 9 volte negli infertili

20 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Microdelezioni cromosoma Y braccio lungo del cromosoma Y Regione correlata con spermtogenesi (AZF) Nel 5-10% delle oligozoospermie Nel 10-15% delle azoospermie = FR e PR in caso di ICSI Trasmesse all embrione

21 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Microdelezioni cromosoma Y AZFa AZFb AZFc

22 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile AZFa USP9Y Azoospermia/ Oligoastenoteratospermia DBY Sertoli cell-only Syndrome (assenza di spermatozoi nell eiaculato) AZFb RBMY arresto spermatogenesi PRI spermatozoi anomali AZFc DAZ alterato controllo della meiosi

23 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Microdelezioni del cromosoma Y Altri geni CDY TSPY Y-linked espresso esclusivamente nel testicolo coinvolto nel processo di sostituzione e acetilazione degli istoni nella spermatogenesi braccio p del cromosoma Y regola l ingresso meiosi spermatog

24 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Mutazioni e polimorfismo geni autosomici CFTR cromosoma 7 mutato nel 60-90% dei casi di agenesia congenita bilaterale dei vasi deferenti (CBAVD)

25 Alterazioni genetiche della gametogenesi maschile Mutazioni e polimorfismo geni autosomici ESR1 cromosoma 6 Sequenze ripetute (TA)n Sequenze lunghe spermatogenesi INSL3 Associati a criptorchidismo LGR8

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28 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Recettore FSH (FSHR): gene Cr2 p21-p16 10 esoni + 9 introni Promoter con 2 response elements

29 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Recettore FSH (FSHR): struttura Dominio extracellulare 349 aminoacidi 10 ripetizioni di 24 aminoacidi (LLR- leucine rich repeats)

30 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Recettore FSH (FSHR): struttura Dominio transmembrana 264 aminoacidi 7 alfa eliche idrofobiche di aminoacidi ciascuna separate da loop intra e intercellulari

31 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Recettore FSH (FSHR): struttura Dominio intracellulare Aa Ricco di residui di serina e treonina siti fosforilazione di kinasi Attivazione trasduzione segnale

32 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Ile160Thr Asp224Val Ala189Val Asn191Ile Alterazioni geniche FSHR Pro348Arg Ala307Thr Mutazioni attivanti Ala419Thr Pro519Thr Arg573Cys Phe591Ser Leu601Val Mutazioni inattivanti Ser680Asn Thr449Ala Thr449Ile Ile545Thr Asp567Gly Asp567Asn Polimorfismi

33 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Mutazioni attivanti Asp 567 Asn Thr449 Ile Thr449 Ala Ile 545 Thr Asp 567 Gly Sensibilità FSHR vs FSH/hCG OHSS spontanee/ iatrogene

34 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Mutazioni inattivanti Asp 567 Gly Arg 573 Cys Ala 189 Val Ile 160 Thr Asn 191 Ile Alterata trasduzione segnale(camp) /amenorrea ipergonadotropa (omozigosi)

35 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Mutazioni inattivanti Pro 348 Arg Pro 519 Thr Leu 601 Val Phe 591 Ser Amenorrea primaria e POF (omozigosi) Predisposizione tumori ovarici (cordoni sex (eterozigosi) Ala 419 Thr

36 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Polimorfismi 1488 SNPs -polimorfismi singolo nucleotide- ( Thr307Ala (rs6165) Asn680Ser (rs6166) dominio extracellulare dominio intracellulare Introne 10

37 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Thr 307/Asn 680 (TN):60% Ala 307/ Ser 680 (AS) Ala 307/ Asn (AN) Thr 307/ Ser (TS) Polimorfismi TN/TN TN/AS AS/AS TN/AN TN/TS AS/AN AS/TS AN/AN TS/TS

38 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Polimorfismi Polimorfismo 680Ser Elevato FSH basale Elevati dosaggi di gonadotropine in IVF Perez Mayorga et al, J Clin Endocrinol Metab 2000 Sudo et al, Mol Hum Reprod, 2002 De Castro et al, J Natl Cancer Inst 2005 Livshyts et al, J Assist Reprod Genet 2009 Moron et al, Pharmacogenomics, 2010 Yao et almol Genet Metabol, 2011

39 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Alterazioni geniche FSHR Polimorfismi Polimorfismo Ile160Thr OHSS Binder et al, Reproduction, 2008 D Alva et al, Fert Ster, 2005 Kerkela et al, Fert Ster, 2007

40 Ile160Thr Asp224Val Ala189Val Asn191Ile Chr 2 exon 10 Ala/Ala Ala/Thr Thr/Thr Normal ovary 38.7% 35.5% 25.8% PCO 16.7% 66.6% 16.7% Ala/Ala Ala/Thr Thr/Thr p Age (years) 33.4 ± ± ± 2.3 ns Basal FSH (IU/ml) 8.2 ± ± ± 1.6 ns AFC ± ± ± ± ± 10.4 ns tot FSH (IU) 1568* 2053 ± <0.05 FSH/Oocyte (IU) 768 ± 158* 392 ± ± 534 <0.05 Pro348Arg Ser680Asn Ala419Thr Pro519Thr Arg573Cys Phe591Ser Thr449Ala Thr449Ile Ile545Thr Ala307Thr Leu601Val Asp567Gly Asp567Asn

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42 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Beta polipeptide LH (LHB) Gene LHB Codifica subunità beta LH Cr13 p11 3 esoni 179 polimorfismi -SNPs- ( Trp8Arg Ile15Thr Gly102Ser Attività LH Haavisto et al, J Clin Endocrinol Metab, 1995

43 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Beta polipeptide LH (LHB) 8Arg-15Thr Pazienti iporesponsive FSH Pazienti con resistenza ovarica FSH ( FSH/ovocita) Alviggi et al, Int J Gynecol Obstet, 2009 Alviggi et al, Reprod Biomed Online 2009

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45 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Recettori estrogenici ER1 >2200 SNPs ( Pvull T/C ER2 720 SNPs ( Pregnancy Rate Pvull C/C: numero follicoli qualità ovociti Pvull T/T: Pregnancy Rate

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47 Genetica e risposta alle terapie per l infertilità Recettore progesterone PGR 11q isoforme PGR-A PGR-B Espressi allo stadio di follicolo antrale 910 SNPS G/A 331 A/A PR fallimento impianto

49 Preimplantation Genetic Diagnosis Aneuploidie (%) ovocitarie < 25 anni: 5% 30 anni: 10-25% > 40 anni: 50% Fragouli et al, Mol Hum Reprod 2011, Fragouli et al, Hum Reprod 2006, Hassold et al, Hum Mol Genet, 2006 Sandalinalis et al, Mol Hum Reprod 2002

50 Preimplantation Genetic Diagnosis Aneuploidie Embrionarie (stadio clivaggio) >36 anni : 45% Munne et al, Reprod Biomed Online, 2001 Cromosomi 15, 16, 21, 22, X, Y Munne et al, Reprod Biomed Online, 2006 Polipoidi: 7% Aploidi 3% Munne et al, Reprod Biomed Online, 2001

51 Preimplantation Genetic Diagnosis PGD Diagnosi di anomalie genetiche/cromosomiche in embrioni generati in vitro da coppie con malattie genetiche note Inizialmente utilizzata per determinare il sesso di embrioni in coppie a rischio di trasmettere patologie X-linked Wilton L. Prenat Diagn, 2002

52 PGD Patologie identificabili Acondroplasia Agammaglobulinemia Anemia falciforme Anemia di Fanconi Atrofia muscolare spinale / bulbare Deficienza di antitripsina a1 Deficienza della catena lunga dell enzima idrossiacil CoA deidrogenasi Deficienza dell enzima ornitinatranscarbamilasi Deficienza della proteina trifunzionale mitocondriale Displasia efiseale multipla Distrofia miotonica Distrofia muscolare di Becker Malattia del core centrale Malattia di Gaucer Malattia di Huntington Malattia di Alport Malattia di Tay-Sachs MELAS Miopatia miotubolare legata al cromosoma X Neurofibromatosi I e II Neoplasia endocrina multipla tipo II Osteogenesi imperfetta I e IV Poliposi coli adenomatoso familiare Retinite pigmentosa Distrofia muscolare di Duchenne Rhesus (Rh D) Emofilia A e B Epidermolisi bullosa Esclusione HD FAP-Gardner Fenilchetonuria Fibrosi cistica Sclerosi tuberosa Sindrome di Cruzon Sindrome di Di George Sindrome di Hunter MPS II Sindrome di Lesch-Nyhan Sindrome di Marfan Idrocefalo legato al cromosoma X Sindrome oro-facciale-digitale tipo 1 Incontinentia pigmenti Ipoglicemia iperinsulinemica PHH1 Insorgenza precoce malatia di Alzheimer Malattia di Charcot-Marie-Tooth 1 e 2A Sindrome di Stickler Sindrome dell X fragile Sindrome di Wiskott-Aldrich Talassemia

53 Preimplantation Genetic Diagnosis PGS Screening anomalie cromosomiche in embrioni generati in vitro da coppie senza malattie genetiche note per migliorare l outcome dei cicli di fecondazione assistita Ripetuti fallimenti di impianto Abortività ricorrente Donne con età avanzata Hardason T, Hum Repr 2008

54 Preimplantation Genetic Diagnosis Tecniche FISH Metaphase CGH Array CGH SNP microarray

55 FISH 5-12 cromosomi Analisi citogenetica di aborti spontanei e anomalie genetiche alla nascita X-Y % aborti

56 CGH (ibridazione genomica comparativa) Competizione tra due DNA genomici (DNA test + DNA riferimento) marcati con fluorocromi differenti per il legame Cromosomi metafasici (metaphase CGH) Sequenze omologhe di DNA su un array (array-cgh)

57 a-cgh Identifica anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi e dei cromosomi sessuali e anomalie strutturali (duplicazioni, delezioni e traslocazioni sbilanciate). Valutazione intero assetto cromosomico dell embrione (Risoluzione 600 Kb)

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59 Microarray SNP Rileva aneuploidie tramite analisi SNPs

60 Preimplantation Genetic Diagnosis OVOCITI I GLOBULO POLARE ZIGOTE II GLOBULO POLARE EMBRIONE 1-2 BLASTOMERI (stadio di clivaggio riduzionale) BLASTOCISTI TROFOECTODERMA

61 Preimplantation Genetic Diagnosis BIOPSIA GLOBULO POLARE: studia 5 cromosomi (provenienti dall ovocita) BIOPSIA EMBRIONE STADIO DI CLIVAGGIO: (studia 7-12 cromosomi provenienti dall embrione) Una significativa percentuale di aneuploidie non viene identificata Molti embrioni cromosomicamente normali arrestano il proprio sviluppo prima di arrivare a blastocisti

62 Preimplantation Genetic Diagnosis Embrioni allo stadio di preimpianto spesso sono MOSAICI e qualche volta si autocorreggono nelle fasi avanzate dello sviluppo. La biopsia di una singola cellula può essere fuorviante False negative rate: % False positive rate: circa 15%

63 Preimplantation Genetic Diagnosis Meccanismi di correzione 50% degli errori a livello dei cromatidi si autorisolve Anomalia nella meiosi I può essere corretta da errore nella meiosi II Autocorrezione in punti di controllo del ciclo cellullare (p53) durante lo stadio di blastocisti Fragouli et al, Hum Rep, 2006 Lighfoot et al, Dev Biol, 2006

64 Preimplantation Genetic Diagnosis Sicurezza Il follow up dei bambini nati dopo PGS non evidenzia differenze nella prevalenza di malforamazioni congenite se paragonati a bambini ICSI senza PGS

65 Preimplantation Genetic Diagnosis Sicurezza Studi europei e americani indicano che la biopsia embrionaria in corso di PGS interferisce negativamente con le potenzialità di impianto embrionario e comporta un rischio di perdita dell embrione

66 Preimplantation Genetic Diagnosis Sicurezza I vantaggi della PGS superano i rischi???? LA PGS migliora l outcome della fecondazione in vitro????

67 PGS : effectiveness in advanced age women 20 Live birth rate (%) PGS Metanalysis. Two prospective randomized studies. Women yrs. Primary outcome: live birth rate. no PGS Twisk et al., Cochrane Database Syst Rev 2006

68 PGS : effectiveness in advanced age women 40 p < 0.01 Ongoing pregnancy rate (%) PGS Prospective randomized study. Women yrs. Primary outcome: ongoing pregnancy at 12W. 434 IVF cycles with PGS vs. 402 without PGS no PGS Mastenbroek et al., N Eng J Med 2007

69 PGS : effectiveness in advanced age women biopsia embrionaria riduce il numero di embrioni disponibili per il transfer donne giovani donne con età avanzata Minor impatto dell eventuale perdita embrionaria sull outcome della fecondazione in vitro

70 PGS : effectiveness in repeated pregnancy loss Molti aborti precoci hanno un origine genetica Tuttavia, quando il numero di aborti aumenta (abortività ricorrente) diminuiscono le cause genetiche e aumentano quelle mediche PGS può ridurre le chances di gravidanza se vengono scelti gli aborti sbagliati

71 PGS : effectiveness in repeated implantation failure Molti embrioni trasferiti in utero non si impiantano Molti embrioni geneticamente alterati non continuano il loro sviluppo e non si impiantano Numerosi fattori uterini ( di cui molti non ancora ben identificati) possono interferire con il ripetuto fallimento di impianto

72 PGS : ASRM and SART guidelines Le evidenze attuali non supportano l utilizzo della PGS per aumentare la pregnancy rate in pazienti con età avanzata, abortività ricorrente o ripetuti fallimenti di impianto In considerazione dei costi e dei rischi non dovrebbe essere proposta come procedura di routine Practice Committee of SART and ASRM, Fertil Steril 2007