Aggiornamento sugli Aspetti Clinici della Procreazione Medicalmente Assistita

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1 Aggiornamento sugli Aspetti Clinici della Procreazione Medicalmente Assistita Prof. Marco FILICORI GynePro Riproduzione Centri Medici GynePro Bologna

2 Aggiornamenti sulla PMA aspetti legali e legislativi procedure diagnostiche AMH/AFC ERA PGD/S la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC) supporto fase luteale

3 Aspetti legali e legislativi Legge 40/2004 Sentenza del Corte Costituzionale Linee guida Ministero della Salute Sentenze di Tribunali Ordinari Sentenza della Corte Europea dei Diritti dell Uomo

4 Legge 40, 19 Febbraio 2004 e Sentenza della Corte Costituzionale del 31 Marzo 2009 Articolo 14 Comma 2. Non devono creare un numero di embrioni superiore a quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre. Comma 3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile. Illegittimità costituzionale nella parte in cui non prevede che il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, come stabilisce tale norma, debba essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna per estensione rispetto alla legge 194/1978, sia la salute fisica che mentale della donna

5 Revisione del Ministero della Salute delle linee guida sulla procreazione medicalmente assistita, 30 Aprile 2008 versione 21 Luglio 2004 revisione 30 Aprile 2008

6 Sentenze tribunali ordinari e regionali Procreazione Medicalmente Assistita ordinanza Tribunale di Firenze, 26 Agosto 2008 solleva questione di legittimità costituzionale dell'art. 14 sentenza Tribunale di Cagliari, 22 settembre 2007 deve essere dunque affermata la liceità della diagnosi preimpianto sentenza TAR del Lazio, 31 ottobre 2007 annulla le Linee Guida laddove si statuisce che ogni indagine relativa allo stato di salute degli embrioni creati in vitro, ai sensi dell'articolo 13, comma 5, dovrà essere di tipo osservazionale. sentenza Tribunale di Bologna, 29 Giugno 2009 sentenzia che: il Centro esegua l applicazione delle metodiche di PMA previa diagnosi preimpianto di un numero minimo di 6 embrioni, provvedendo alla crioconservazione per un futuro impianto degli embrioni risultati idonei che non sia possibile trasferire immediatamente.. sentenza Tribunale di Salerno, 9 Gennaio 2010 pazienti non ammessi al programma di PMA per mancanza della condizione di sterilità richiesta dall art. 4 della Legge 40/2004 definisce la diagnosi preimpianto, al pari della altre diagnosi prenatali, una normale forma di monitoraggio con finalità conoscitiva della salute dell embrione. e sentenzia che: Deve pertanto affermarsi,.., il diritto dei ricorrenti coniugi a. diagnosi preimpianto degli embrioni da prodursi e di trasferimento nell utero di embrioni che non evidenzino la mutazione del gene dell Atrofia Muscolare Spinale (SMA1).

7 Corte Europea dei Diritti dell Uomo Diagnosi pre-impianto Sentenza del 28 Agosto 2012 Coppia di portatori sani di fibrosi cistica, con figlia affetta nata nel 2006 e IVG eseguita nel 2010 in gravidanza con feto affetto a cui non era stato permesso l accesso a procedure di PMA in quanto non sterili Condanna il Governo Italiano per violazione dell art. 8 della Convenzione per la Salvaguardia dei Diritti dell Uomo e delle libertà fondamentali Novembre 2012 Il Governo Italiano presenta ricorso contro la sentenza Febbraio 2013 la Corte Europea boccia il ricorso

8 Aggiornamenti sulla PMA novità legislative procedure diagnostiche AMH/AFC ERA PGD/S la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC) supporto fase luteale

9 Selezione dei pazienti valutazione della riserva ovarica approcci tradizionali età livelli sierici di FSH nuovi parametri bioumorali antral follicle count (AFC) livelli sierici di Anti-Müllerian Hormone (AMH)

10 Standardizzazione della antral follicle count (AFC) Broekmans et al, Fertil Steril 94:1044, 2010 strumentazione ecografo bi- o tridimensionale sonda transvaginale bi- o tridimensionale di almeno 7 MHz e risoluzione 2 mm più accurato in donne con cicli mestruali regolari eseguire preferibilmente il 2-4 giorno di un ciclo mestruale spontaneo contare i follicoli di 2-10 mm in entrambe le ovaie

11 Correlazione dei livelli di AMH con il conteggio dei follicoli antrali (AFC) de Vet et al, Fertil Steril 77:357, Follicle number r = 0.71, p < AMH level (μg/l)

12 Livelli sierici di AMH nel corso della vita e del ciclo mestruale La Marca et al, Hum Reprod 21:3103, 2006 principali cause di calo dell AMH età patologia ovarica (POF) interventi chirurgici sull ovaio Overbeek et al, RBM Online 24:664, 2012

13 Lee et al, Reprod Biol Endocrinol 7:100, 2009

14 Misurazioni di AMH ed AFC forniscono un indicazione sulla potenziale riserva ovarica (risposta follicologenetica alla stimolazione ormonale) e la possibilità di recupero ovocitario all OPU non permettono di prevedere la qualità ovocitaria ed embrionale (aneuploidie) pertanto sono solo debolmente predittivi del possibile successo delle tecniche di PMA (gravidanza clinica)

15 Aggiornamenti sulla PMA novità legislative procedure diagnostiche AMH/AFC endometrio (ERA, P) PGD/S la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC) supporto fase luteale

16 Key Factors Determining Clinical Outcome in IVF Identification of the viable embryo Identification/Modification of receptive endometrium Window of Implantation 60%-90% of transferred embryos do not implant or die. 15% of cycles end in implantation failure of endometrial origin.

17 Preovulatory endometrial biopsy features in spontaneous and stimulated menstrual cycles Pellicer, 2012 DAY OF OVULATION SPONTANEOUS CYCLE DAY OF OOCYTE RETRIEVAL GnRH AGONIST AND GONADOTROPIN STIMULATION CYCLE no secretory features evident secretory features

18 Correlations between progesterone levels (area under the curve) and gonadotropin activity administered P AUC (ng/ml.day) r=0.447 P< r=0.010 P NS FSH activity administered (IU) LH activity administered (IU) 0 Filicori et al, Hum Reprod 17:2009, 2002

19 LH/CG FSH LH/CG in LFP THECA CELLS cholesterol pregnenolone progesterone P450 scc 3b-HSD GRANULOSA CELLS cholesterol pregnenolone progesterone P450 scc 3b-HSD P450 17a X X P450 17a X androgens P450 arom X estrogens P450 arom androgens estrogens blood BM blood

20 Serum progesterone on hcg day and ongoing pregnancy rates in IVF n=3,972 pregnancy rates (%) * p < * MH test for trend Serum P on day of hcg (ng/ml) Bosch et al, Hum Reprod 25:2092, 2010

21 Duration of pre-hcg progesterone elevation (>1 ng/ml) and clinical pregnancy rates in IVF Huang et al, Hum Reprod 27:2036, 2012

22 Aggiornamenti sulla PMA novità legislative procedure diagnostiche AMH/AFC endometrio (ERA, P) Antonio PGD/S la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC) supporto fase luteale

23 Endometrial Receptivity Array (ERA) - Timing of the biopsy NATURAL CYCLE The endometrial biopsy must be taken on the 7th day after the LH surge (LH+7) (urine or serum preferible). HORMONE REPLACEMENT THERAPY CYCLE The endometrial biopsy must be taken on day P+5, after proper E priming ( at least 10 days). E 2 valerate 6 mg/day P 800 mg/day Pellicer, 2012

24 Consensus genes for endometrial receptivity Gene name Natural cycle COH IUD Glutathione peroxidase ,4 Placental protein FXYD domain containing ion transport regulator ,43 Dipeptidylpeptidase Leukemia inhibitory factor Insulin-like growth factor binding protein Growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha Hyaluronan binding protein ,42 Endothelin receptor type B Leiomodin Calponin 1, basic, smooth muscle Clusterin Transgelin Cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide ,49 Inositol -1 -monophosphatase Calpain Tissue factor pathway inhibitor Mitogen-activated protein kinase kinase Catenin, alpha Sorbitol dehydrogenase ,87 Major histocompatibility complex, class II, DO beta Branched chain keto acid dehydrogenase E1, beta polypeptide Aldehyde dehydrogenase 3 family, member B NDRG family member Folate receptor

25 Endometrial Receptivity Array (ERA) Agilent e-array: https://earray.chem.agilent.com/earray/ -298 Genes -Probe selection: Cross-linking -569 probes -8 copies per probe -Controls Patented in 2009: PCT/ES 2009/ Pellicer, 2012

26 Endometrial Receptivity Assay (ERA) outcome receptive profile non-receptive sample NR receptive sample RC1 non-receptive sample NR Pellicer, 2012

27 Aggiornamenti sulla PMA novità legislative procedure diagnostiche AMH/AFC ERA PGD/S la stimolazione ovarica ciclo spontaneo prevenzione OHSS (GEC) supporto fase luteale

28 Patologie diagnosticabili con la diagnosi pre-impianto (PGD) malattie autosomiche recessive fibrosi cistica atrofia muscolare spinale talassemia anemia falciforme malattie autosomiche dominanti distrofia miotonica corea di Huntington malattia di Charcot-Marie-Tooth rene policistico sindrome di Marfan malattie legate al cromosoma X sindrome da X fragile distrofia muscolare di Duchenne emofilia A

29 Incidence of aneuploidy in over 20,000 oocytes Kuliev et al, RBM Online 22:2, 2011

30 Analisi genetiche invasive nella PMA Diagnosi pre-impianto Preimplantation Genetic Diagnosis PGD mirata al riconoscimento di patologie genetiche già identificate nei genitori e/o nella famiglia Screening pre-impianto Preimplantation Genetic Screning PGS finalizzata all identificazione di embrioni aneuploidi privi di possibilità di normale ulteriore sviluppo teoricamente dovrebbe permettere di migliorare le probabilità di successo delle tecniche di PMA

31 Biopsia per PGS ovocita solo 1 o 1 e 2 globulo polare embrione in 3 giorno asportati 1 o 2 blastomeri congelamento o transfer in 5 giorno blastocisti in 5 giorno asportate cellule del trofoectoderma congelamento o transfer in 6 giorno

32 Tecniche per l analisi genetica FISH (fluorescence in-situ hybridization) solitamente analizzati solo alcuni cromosomi (13, 18, 21, x, y) può sovrastimare le aneuploidie quando applicata clinicamente non ha permesso di migliorare i tassi di gravidanza comprehensive chromosome screening (CCS) microarray CGH (comparative genomic hybridization) amplificazione dell intero genoma che permette l analisi dei 22 autosomi e dei 2 gonosomi (x, y) microarray SNP (single nucleotide polymorphism) il microarray contiene sonde per identificare i SNP può fornire maggiori informazioni rispetto alla CGH (origine parentale delle aneuploidie, dati su crossover) quantitative PCR (polymerase chain reaction) non richiede l amplificazione del genoma

33 Limiti della PGS in pazienti di età elevata: ridotto numero di ovociti ed embrioni diminuite possibilità di sviluppo a blastocisti presenza di mosaicismi nell embrione possibilità di autocorrezione delle aneuploidie blastocisti: discrepanze genetiche tra trofoectoderma e massa cellulare interna

34 Status della tecnologia per la PGS nel 2013 PGS con tecnica FISH finora non si è dimostrata efficace per migliorare l efficacia delle tecniche di PMA Mastenbroek et al, Hum Reprod Update 17:454, 2011 PGS con tecnica microarray CGH appare promettente per una più efficace e sicura identificazione degli embrioni aneuploidi Rubio et al, Fertil Steril, in press, 2013 (disponibile online)

35 Aggiornamenti sulla PMA novità legislative procedure diagnostiche AMH/AFC ERA PGD/S rendere la stimolazione ovarica più sicura e accettata ciclo spontaneo user friendly prevenzione OHSS (GEC)

36 Terminology of ovarian stimulation Nargund et al, Hum Reprod 22:2801, 2007 natural cycle IVF spontaneous menstrual cycle, no drugs used modified natural cycle IVF (MNC-IVF) 1. only hcg is used to trigger final follicle maturation, luteal support optional 2. GnRH antagonist and FSH/hMG added in late stimulation, hcg to trigger final follicle maturation, luteal support (progesterone or hcg) administered mild IVF low dose gonadotropins and GnRH antagonist administered conventional IVF standard IVF with full dose gonadotropins and GnRH agonists or antagonists

37 Come rendere la stimolazione ovarica «user friendly» via di somministrazione dei farmaci sottocutanea piuttosto che intramuscolare possibile sia con farmaci ricombinanti che di derivazione umana altamente purificati sistemi ad elevate concentrazioni di farmaco e con dosi facilmente modulabili sistemi multidose o con penna tarabile riduzione della frequenza di somministrazione modifiche strutturali della molecola ormonale

38 Semplificazione dei metodi di stimolazione ovarica FSH HP di derivazione umana siringhe pre-riempite da 75, 150, 225 e 300 UI hmg HP di derivazione umana flaconi multidose da 600 e UI FSH ricombinante a penne pre-riempite da 300, 600 e 900 UI FSH ricombinante b cartucce per penna da 300, 600 e 900 UI corifollitropina a

39 Trigger della maturazione follicolare e ovocitaria human Chorionic Gonadotropin (hcg) cicli con soppressione con GnRH agonisti o GnRH antagonisti hcg ricombinante flaconi 250 mg ( UI hcg) penna a dosi modulabili hcg di derivazione umana formulazione unica UI in 1 ml, modulabile agonisti del GnRH solo in cicli di soppressione con GnRH antagonisti triptorelina 200 mg, s.c. leuprorelina mg, s.c. buserelina mg, s.c.

40 Uso degli agonisti del GnRH per il trigger dell ovulazione giorno del g. -7 ciclo g. +2 g. +6 GnRH agonista GnRH antagonista FSH/hMG

41 clinical G. E. Cognigni W. Ciampaglia F. Infante P. Pocognoli C. Tabarelli S. Taraborrelli M. Pavanati psychologists E. Dumit G. Rifelli geneticist E. Pompilii laboratory L. Parmegiani S. Bernardi E. Troilo A. Arnone A. Maccarini A. Rastellini S. Lanzilotti administration J. Filicori R. Avella D. Morselli D. Balboni G. Benassi S. Trombin reception & tech S. Agnini C. Cavallin G. Corazza S. D Alessandro F. Fedon V. Maleca R. Pancaldi P. Rampa D. Scapuzzo E. Stasi paramedics C. Aliprandi P. Ferrari G. Mattace S. Poli G. Nowbuth G. Tomacelli

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