RELAZIONI L EVOLUZIONE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA DIAGNOSTICA

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1 RELAZIONI L EVOLUZIONE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA DIAGNOSTICA TEST GENETICI PER LO STUDIO DI MALATTIE EREDITARIE: LINEE GUIDA E CONTROLLO QUALITA F. Torricelli UO Citogenetica e genetica, AOU Careggi, Firenze I test genetici sono utilizzati nella pratica clinica sia in ambito prenatale che postatale, sia con finalità diagnostica che di screening. Le tecnologie attualmente disponibili permettono l esecuzione di tali test su vari tipi di tessuti, sia freschi che conservati. Le indicazioni per un test genetico sono però la base per un buon utilizzo dello stesso sia da un punto di vista clinico che di utilizzo delle risorse sanitarie. Per test genetico si intende l'analisi a scopo clinico di DNA, RNA, cromosomi, proteine, metaboliti o altri prodotti genici per evidenziare genotipi, mutazioni, fenotipi o cariotipi correlati o meno con patologie ereditabili umane. Questa definizione include gli screening prenatali, neonatali e dei portatori, così pure i test sulle famiglie a rischio. I risultati di queste indagini si possono applicare alla diagnosi ed alla prognosi di malattie ereditarie, alla predizione del rischio-malattia, all'identificazione dei portatori sani. I test genetici sono ormai ampliamente utilizzati nella pratica medica, senza che al momento, vi sia una adeguata regolamentazione. Rispetto ad altri esami di laboratorio, i test genetici presentano alcune peculiarità, in quanto i risultati coinvolgono l'identita' biologico-personale non solo del singolo ma anche della sua famiglia di origine e della sua discendenza. I test genetici possono predire i rischi di future patologie prima della comparsa dei sintomi clinici; molto raramente però questa predizione raggiunge la certezza. Inoltre non sempre la predizione di un test genetico può essere avvalorata dal riscontro di segni clinici o strumentali indipendenti. In mancanza di questi segni, una conferma potrà venire solo dalla comparsa della malattia. Infine poichè i genotipi responsabili di malattia possono essere diversi per tipo e frequenza nelle diverse popolazioni, spesso è necessario considerare il gruppo etnico a cui appartiene il soggetto analizzato sia per decidere l'effettuazione dei test sia per interpretarne i risultati. Queste caratteristiche richiedono particolari cautele e competenze sia nella validazione clinica dei test genetici sia nell interpretazione dei risultati. L organizzazione di controlli di qualità, sia nazionali che europei si è resa necessaria proprio per l ampio utilizzo dei test genetici sia in strutture private che pubbliche. Dai dati del censimento SIGU2002 emerge che la domanda di analisi di Genetica molecolare aumenta al ritmo di oltre 20% per anno; il numero di analisi molecolari prenatali è raddoppiata rispetto all anno 2000 (aumento medio annuo +43%). In alcuni casi viene proposta la vendita di pacchetti diagnostici (Alcuni numeri anomali : 4517 diagnosi prenatali di Fibrosi Cistica; 2598 di Ritardo Mentale (FRAXA) di FRAXE; 3 di Sordità (DFNB1); 2304 di Distrofia di Duchenne) Quindi è necessario sviluppare linee-guida per garantire livelli omogenei di intervento sul territorio nazionale dal momento che i test genetici utili ai fini della diagnosi e della gestione di una malattia restano ancora fondamentalmente quelli collegati alle patologie che hanno un meccanismo semplice (cromosomico, genico); la mancanza di informazione adeguata porta gli utenti all acquisto di pacchetti diagnostici inutili o dannosi; la qualità della diagnosi non è sempre garantita (errori di diagnosi o di interpretazione dei risultati), per la mancanza di controlli di qualità; è molto inadeguata l informazione collegata ai test genetici, una percentuale troppo elevata di diagnosi non riceve la Consulenza Genetica. LigandAssay 9 (3)

2 LA FIBROSI CISTICA: ITER DIAGNOSTICO DI UNA MALATTIA EREDITARIA E. Pelo UO Citogenetica e genetica, AOU Careggi, Firenze La Fibrosi Cistica (FC) è la più comune malattia autosomica recessiva letale nella popolazione caucasica. La prevalenza dei neonati con FC è stimata in 1/2200-1/2500; mentre si stima che i portatori siano 1 ogni soggetti nella popolazione generale con una stima di 1 coppia su 650 di portatori sani con 8un rischio quindi ¼ di figli affetti da FC. La FC segrega come mutazione autosomica recessiva, con rischi di ricorrenza di 1 su 4 per coppie di portatori, ed un aumentato rischio di risultare portatori sani di FC in familiari di pazienti affetti. La fibrosi cistica si presenta come una malattia sistemica e i cui primi segni e sintomi tipicamente si hanno nell'infanzia; in circa il 3% dei pazienti la diagnosi viene fatta in età adulta. In seguito ai progressi terapeutici attualmente la sopravvivenza media di un paziente FC è circa 30 anni.si tratta essenzialmente di una malattia generalizzata delle ghiandole esocrine, caratterizzata dalla produzione di secrezioni mucose particolarmente dense, che evolvono in una malattia polmonare ostruttiva ad andamento cronico, insufficienza pancreatica esocrina e, in alcuni casi, ostruzione intestinale dell ileo distale nel periodo neonatale (ileo da meconio). L apparato epatobiliare è massivamente coinvolto in quasi tutti i pazienti. La principale sintomatologia clinica riguarda comunque l apparato respiratorio con un esordio di solito nei primi mesi di vita con evoluzione in un quadro bronchiectasico. Sono comuni le infezioni causate da Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. In entrambe i sessi sono presenti alterazioni dell apparato riproduttivo. Nel maschio l azospermia è dovuta ad ostruzioni meccaniche del sistema di trasporto spermatico oppure ad atresia dei dotti spermatici, mentre nella femmina la fertilità è ridotta per un eccesso di muco cervicale, che agisce come barriera alla penetrazione spermatica. Sono particolarmente elevate le concentrazioni di sodio, cloro e potassio nelle secrezioni delle ghiandole salivari e sudoripare. Su questa anomalia si basa il test maggiormente utilizzato nella diagnosi della malattia, il test del sudore, che ha i suoi presupposti nella ionoforesi della pilocarpina. La concentrazione del cloro è considerata patologica quando supera i 60 meq/l, ma il risultato è attendibile solo dopo il I-II mese di vita.il gene, localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7, è contenuto in una regione di DNA lunga 230 Kb, contiene 27 esoni e codifica per una proteina di 1480 aminoacidi. La proteina, altamente conservata nelle diverse specie, appartiene ad una grande famiglia di glicoproteine che posseggono siti intracellulari di legame con l ATP e svolgono funzioni essenziali nel trasporto ionico attivo. Per questo motivo è stata definita "cystic fibrosis transmembrane conductance regulator" (CFTR), cioè proteina regolatrice della conduttanza transmembrana della FC. CFTR è composto da due domini transmembrana TM1 e TM2, due siti intracellulari di legame con l ATP (NBF: Nucleotide Binding Fold) ed una regione intracellulare regolatrice (R), che separa i due domini proteici. La proteina è un canale ionico strutturale di membrana controllato dall AMP ciclico.una normale conduttanza al cloro è essenziale per la secrezione dei fluidi e l assorbimento dei sali nei tessuti epiteliali. Fino ad oggi sono state identificate oltre 1000 mutazioni e numerosi polimorfismi, sia nelle regioni codificanti che in quelle non codificanti, su oltre cromosomi FC analizzati in tutto il mondo (Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium). Le mutazioni si localizzano lungo tutto il gene CFTR, ma esistono "siti caldi" corrispondenti a domini proteici essenziali per il corretto funzionamento del canale CFTR. La mutazione più frequente è una delezione ( ) di tre paia di basi (CTT), che causa la perdita dell aminoacido fenilalanina in posizione 508 ( F508) nell esone 10 del gene e rappresenta circa il 70% dei cromosomi FC nel mondo. La sua frequenza varia notevolmente nelle diverse popolazioni: dal 50% degli alleli FC nell Europa meridionale (Italia, Spagna, Grecia) al 90% circa nelle popolazioni del Nord Europa (Danimarca, Olanda, Regno Unito), secondo un gradiente di frequenza decrescente in Europa da Nord verso Sud Est. Si distinguono 5 classi di mutazioni. Quelle di classe I (circa il 54% del totale) causano la totale assenza del prodotto proteico a seguito di mutazioni nonsenso, frameshift o di splicing. La classe II comprende le mutazioni che non permettono alla proteina di raggiungere la membrana epiteliale (un esempio è la F508) in quanto determinano il suo anomalo posizionamento o precessamento e quindi la sua degradazione. Nella classe III sono comprese le mutazioni nei domini di legame nucleotidico, associate ad un difetto di regolazione del canale CFTR del cloro; nella classe IV le mutazioni missense localizzate nei domini transmembrana associate a difetti nella conduttanza del canale; nella classe V le mutazioni di splicing, che provocano una ridotta sintesi della proteina. La diagnosi di fibrosi cistica si basa ormai da 40 anni sulla positività del test del sudore; attualmente si conoscono forme atipiche con con test del sudore borderline che necessitano di una specifica valutazione clinicoanamnestica e test genetici approfonditi. Le possibilità diagnostiche offerte dalla biologia molecolare permettono attualmente la diagnosi di forme atipiche di FC con la ricerca di mutazioni rare nel gene CFTR; l esecuzione di diagnosi prenalate in coppie a rischio ¼ e di gravidanze a rischio per la presenza di marcatori fetali indicativi di FC; la diagnosi di portatore nei familiari dei pazienti e nei loro partners, ovviamente oltre al test 208 LigandAssay 9 (3) 2004

3 diagnostico in pazienti con forme classiche di FC. È però necessario precisare che le diverse indicazioni ad uno studio genetico per FC richiedono iter diagnostici differenziati sempre però accompagnati da una appropriata consulenza genetica. LigandAssay 9 (3)

4 LE TECNOLOGIE NELLA DIAGNOSI GENETICA: PASSATO, PRESENTE E FUTURO S. Bernabini, C. Centrone UO Citogenetica e genetica, AOU Careggi, Firenze Attualmente i laboratori di biologia molecolare hanno a disposizione numerose tecniche per la ricerca delle mutazioni del gene CFTR. Esse si dividono essenzialmente in due gruppi: quelle utilizzate per la ricerca di mutazioni frequenti e note e quelle utilizzate per la ricerca di mutazioni rare o non ancora conosciute. Le prime sono alla base di alcuni kit diagnostici creati e commercializzati a questo scopo ed hanno il limite di una sensibilità non elevata e comunque variabile da regione a regione data la diversa frequenza delle mutazioni sul territorio nazionale. Le tecniche che raggiungono sensibilità elevata, DHPLC, sono in grado di identificare un numero elevatissimo di mutazioni tra cui quelle rare o addirittura non ancora conosciute. Queste tecniche hanno costi più elevati e richiedono tempi più lunghi di esecuzione. La metodica DHPLC può essere impiegata come tecnica per la rilevazione di nuove mutazioni (SNPs, inserzioni, delezioni e tandem repeat) o per lo screening per la ricerca di una specifica mutazione Si basa sulla differente velocità di migrazione, in un mezzo simile ad un gel quale è la colonna HPLC, per gli eteroduplex e omoduplex. Questi duplex si formano quando un frammento amplificato di DNA mutato ed uno non mutato vengono denaturati termicamente e lasciati ricombinare. L'eteroduplex si comporta cromatograficamente in modo differente dall'omoduplex non mutato. I tempi di ritenzione sono differenti, in particolare l'eteroduplex è solitamente più veloce (meno trattenuto) dell'omoduplex e da ciò si può caratterizzare la presenza di una mutazione in un campione.i campioni sono amplificati normalmente come da protocolli standard della PCR. L analisi microarray è una tecnologia emergente con diverse applicazioni: è stata già ampiamente utilizzata per studi di espressione genica e sembra una promettente metodica anche per l identificazione delle mutazioni e per lo studio di polimorfismi. Le varie metodologie array sviluppate in questi ultimi anni si distinguono fondamentalmente in tre gruppi, a seconda del principio su cui si basano: ibridazione, estensione dell oligonucleotide e oligonucleotide ligation assay (OLA). Tra quelle che prevedono ibridazione ritroviamo la tecnologia Nanogen che prevede l utilizzo del campo elettrico per il trasporto rapido ed accurato del DNA ai siti testo (microelettrodi o pad) del chip e per incrementare l efficienza di ibridazione (si parla in questo caso di ibridazione attiva ). I microchip hanno dimensioni di 1cm x 1cm e possono contenere 25 o 100 siti testo: si possono pertanto avere array 5x5 o 10x10. I siti testo sono localizzati nell'area centrale dell'array e ciascuno di essi ha una connessione elettronica individuale con il sistema (Nanogen NanochipTM Molecular Biology Workstation). Il trasporto selettivo degli oligonucleotidi e dei prodotti di PCR viene effettuato applicando una carica positiva ai pad selezionati. La tecnologia Nanogen, grazie a questo trasporto selettivo delle molecole biologiche in posizioni specifiche dell'array, risulta essere estremamente accurata ed altamente versatile, consentendo infatti l'analisi contemporanea su uno stesso chip di più mutazioni/polimorfismi in molteplici campioni di DNA. La tecnologia microarray elettronico prevede differenti approcci per lo studio di mutazioni/polimorfismi noti; le metodiche maggiormente utilizzate sono: l amplicon down base stacking e la SNPmine per la ricerca di tutte le possibili mutazioni/polimorfismi nel target di interesse. La tecnologia Nanogen potrebbe essere applicata alla diagnosi di Fibrosi Cistica per lo studio dei polimorfismi presenti nei geni modificatori, in modo da poter stabilire correlazioni tra la presenza di tali polimorfismi e differenti fenotipi clinici. I geni modificatori sono dei geni, diversi dal gene CFTR, che possono influenzare il decorso clinico della malattia; hanno infatti un ruolo rilevante nel processo infiammatorio e nella difesa immunitaria. La tecnologia microarray elettronico è sicuramente adatta a tale applicazione poiché permette di realizzare in breve tempo studi su larga scala e perché è in grado di individuare, nei geni in esame, la presenza sia di polimorfismi già noti che di polimorfismi non ancora descritti in letteratura. 210 LigandAssay 9 (3) 2004

5 TECNOLOGIE AVANZATE PER LA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DALLA GENOMICA ALLA PROTEOMICA: INTRODUZIONE ALLE TECNICHE E SIGNIFICATO DIAGNOSTICO M. Ferrari Laboratorio di Biologia Molecolare, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele, Milano Il completamento del progetto Genoma Umano ha aperto nuove frontiere per la diagnostica di Laboratorio. Nello stesso tempo ha posto anche degli interrogativi legati alle tecnologie disponibili. Verranno presentati i nuovi approcci molecolari, quali i microarray, per trasferire la diagnostica molecolare da una attività a bassa produttività ad una ad alta produttività. Inoltre tali avanzamenti permetteranno sempre più di comprendere e ricercare nuovi marcatori proteici. Verrà affrontato anche il problema della ricerca e diagnostica di proteine e quindi gli aspetti del futuro della Medicina di Laboratorio. LigandAssay 9 (3)

6 GENOMICA: ANALISI DI MUTAZIONI E POLIMORFISMI NELLA DIAGNOSTICA MOLECOLARE V. Mantovani Centro Ricerca Biomedica Applicata, Policlinico S.Orsola-Malpighi, Bologna La realizzazione del progetto genoma ha reso oggi disponibile un'enorme quantità di informazioni sulla sequenza primaria del DNA umano. Inoltre, la letteratura scientifica riporta quasi quotidianamente l identificazione di nuovi geni: dei circa geni umani stimati, quasi sono già stati identificati e alterazioni in circa di questi sono state associate a patologia. Parallelamente all individuazione di mutazioni nei geni-malattia, è cresciuta in maniera esponenziale l informazione sulla diversità genetica tra gli individui, in particolare sulle variazioni più frequenti, i polimorfismi del singolo nucleotide (SNPs): attualmente sono caratterizzati oltre 4 milioni di SNPs e si prevede che l intero genoma umano ne comprenda almeno 10 milioni. E quindi oggi indispensabile disporre di metodi e tecnologie adeguate a rispondere alla crescente domanda di analisi genetico-molecolari generata da tale mole di informazioni. Le tecniche per identificare varianti di sequenza possono essere sinteticamente suddivise in tre gruppi: metodi di screening per ricercare varianti ignote in sequenze pre-definite, metodi diagnostici per rivelare mutazioni o SNPs noti in posizioni definite e metodi di sequenziamento per identificare tutti i tipi di variazioni genetiche, a prescindere se ignote o definite. I metodi di screening includono tecniche basate sulla differente mobilità elettroforetica delle molecole mutate, quali Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) e Heteroduplex Analysis (HA). Includono anche metodi basati su cleavage chimico o enzimatico di molecole di RNA o DNA, come Chemical Cleavage of Mismatch (CCM) e Enzyme Mismatch Cleavage (EMC). Il metodo più recente, denominato Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC), è basato sulla tecnica separativa di cromatografia di ripartizione a fase inversa. I metodi diagnostici sono numerosissimi e i più comuni comprendono quelli basati sulla Oligonucleotide Ligation Assay (OLA), quelli basati sulla ibridizzazione di oligonucleotidi con il DNA target (Allele Specific Oligonucleotide Hybridization-ASOH, Dynamic Allele Specific Oligonucleotide Hybridization-DASH e TaqMan assay), quelli basati su PCR allele specifica (Amplification Refractory Mutation System-ARMS, Allele Specific Amplification-ASA e Apyrase Mediated Allele Specific Extension-AMASE) e i metodi basati su minisequenziamento (Single Base Extension-SBE), con rivelazione del nucleotide incorporato mediante diversa idrofilia (DHPLC), massa (MALDI-TOF), fluorescenza, o fluorescenza abbinata a polarizzazione della luce (FP-TDI). I metodi di sequenziamento includono quello più diffuso dei terminatori di catena fluorescenti utilizzato nei moderni sequenziatori automatici e il Pyrosequencing, adatto per sequenze brevi o per SNPs. Infine, l introduzione di tecniche di multiplexing, l utilizzo di micropiastre, la costruzione di micro-arrays con oligonucleotidi immobilizzati al supporto, la tecnologia dei DNA-Chip e la robotizzazione per automatizzare i processi consentono di raggiungere livelli di throughput d analisi molto elevati. 212 LigandAssay 9 (3) 2004

7 LA PROTEOMICA E LE SUE APPLICAZIONI NELLA DIAGNOSTICA CLINICA A. Caldini Laboratorio Centrale Analisi, Dipartimento di Laboratorio, Azienda Ospedaliero - Universitaria di Careggi, Firenze INTRODUZIONE Con la conclusione del Progetto Genoma è diventato definitivamente chiaro come la conoscenza delle sequenze genomiche, seppure indispensabile, non sia di per sè sufficiente a spiegare tutti gli eventi biologici complessi e tutte le patologie rendendo così necessario lo studio dei prodotti genici, i.e. mrna e proteine. Con il termine Proteoma (usato per la prima volta nel 1994 da Wilkins et al.) si identifica il complemento proteico del genoma, così come con il termine genoma si intende il complemento genico dei cromosomi. Sebbene lo studio del mrna sia metodologicamente più semplice, lo studio del proteoma si rende necessario per due motivi principali: la correlazione tra quantità di mrna e quantità di proteina intracellulari è scarsa e variabile tra le diverse proteine e, fatto ancor più rilevante, le proteine vanno incontro a cambiamenti co- e post-traduzionali molto complessi che rendono il numero di isoforme delle proteine di fatto superiore a quello prevedibile sulla sola base dell analisi degli acidi nucleici. Inoltre le modificazioni post-traduzionali sono il risultato di più vie metaboliche intersecantesi e risentono dell influenza dei fattori ambientali. Di conseguenza il paradigma un gene una proteina va in qualche modo rivisitato in quanto da un singolo gene si ottengono in realtà più isoforme proteiche. Dal momento che l espressione delle diverse isoforme sembra essere un processo altamente regolato e controllato e suscettibile di cambiamenti in seguito a processi morbosi o esposizione a farmaci e tossine, la comprensione del significato della variabilità proteica post-traduzionale potrebbe aprire nuovi scenari in molti campi della medicina. Il notevole sviluppo che la proteomica ha avuto negli ultimi anni è dovuto sia alla grande crescita delle conoscenze scientifiche e tecnologiche, che alla chiara evidenza che la maggior parte delle patologie umane origina dalla perdita di controllo dei fini meccanismi di regolazione delle interazioni tra proteine. La comprensione del ruolo che il network proteico gioca nelle patologie umane creerà probabilmente in un prossimo futuro grandi opportunità cliniche, in quanto se è vero che nel DNA risiede l archivio di tutte le informazioni, è altrettanto vero che gli effettori di queste informazioni a livello cellulare sono le proteine e che sono le proteine a determinare il fenotipo cellulare. TECNICHE DI STUDIO DEL PROTEOMA La tecnologia più conosciuta e più utilizzata per gli studi proteomici è sicuramente l elettroforesi bidimensionale o 2-DE (Two Dimensional Polyacriylamide Gel Electrophoresis), in cui le proteine vengono separate sulla base della sola carica elettrica nella prima dimensione (Isoelectrofocusing) e quindi nella seconda sulla base della sola massa molecolare (Elettroforesi su gel di poliacrilamide/sds). Con questo tipo di tecnica separativa, partendo da miscele complesse di proteine quali liquidi biologici o lisati cellulari, si ottiene la separazione su un singolo gel di parecchie centinaia di proteine. Con sistemi computerizzati di analisi di immagine si possono quindi, confrontando ad esempio campioni di tessuto sano e frammenti bioptici di tumore, individuare le proteine che presentano un diverso grado di espressione. L identificazione delle proteine così individuate viene effettuata con notevole velocità e accuratezza tramite spettrometria di massa e con l ausilio di banche dati internazionali. Inoltre usando tecniche di immuno-blotting le isoforme di una particolare proteina possono essere evidenziate e analizzate, tramite l uso di anticorpi specifici. Le tecniche basate sulla 2D-E, a causa della loro complessità, scarsa riproducibilità e scarsa resa, sono difficilmente proponibili per applicazioni cliniche che prevedano studi multicentrici su un adeguato numero di campioni e sono di fatto scarsamente utilizzabili per campioni biologici quali il plasma in cui proteine come l albumina e le immunoglobuline, presenti in elevate concentrazioni, mascherano le proteine di origine tissutale potenzialmente interessanti per la caratterizzazione delle condizioni patologiche. Più recentemente sulla scia di metodologie nate per lo studio degli acidi nucleici e nel tentativo di superare i limiti della 2D-E, si sta assistendo allo sviluppo di tecnologie dedicate alla proteomica e basate sull utilizzo di componenti microfabbricati (protein chip e protein array). Mentre i protein arrays sono costruiti secondo la filosofia degli arrays utilizzati per la genomica, i protein chip uniscono la tecnologia dei chip per la separazione di sottopopolazioni proteiche sulla base delle loro caratteristiche biofisiche alla spettrometria di massa come sistema di rivelazione e misura delle masse molecolari delle singole proteine. Un altro tipo di tecnologia che potrebbe portare in tempi brevi alla disponibilità di strumentazione automatizzata ad alta resa è quella della cromatografia bi o tridimensionale, in cui il campione viene sottoposto a separazioni cromatografiche sequenziali. E altresì evidente che le informazioni generate da questo tipo di analisi sono di tale complessità da richiedere l ausilio di strumenti informatici potenti in grado di individuare, da un enorme numero di combinazioni possibili di patterns proteici, quello che in modo ottimale è in grado di segregare la popolazione di interesse. LigandAssay 9 (3)

8 APPLICAZIONI CLINICHE Nella letteratura internazionale si sta registrando un crescente interesse in questo settore come è dimostrato dall impressionante incremento dei lavori pubblicati negli ultimi anni e, cosa ancor più interessante, dalla comparsa dei primi lavori con un risultati clinici molto promettenti. Uno dei settori in cui lo studio del Proteoma potrebbe avere un interesse clinico rilevante è certamente l oncologia, come è testimoniato dal continuo aumento del numero di pubblicazioni sull argomento. L interesse del clinico è rivolto all identificazione di potenziali markers specifici che siano in grado di fornire informazioni diagnostiche, prognostiche e sull efficacia del trattamento e in tutte queste situazioni l approccio proteomico potrebbe offrire informazioni interessanti. Particolarmente interessanti, per la potenziale ricaduta clinica che potrebbero avere, sono alcuni lavori recentemente pubblicati che, utilizzando la tecnologia dei protein chip, riportano valori di sensibilità e specificità per il tumore dell ovaio, della prostata e della mammella che, se confermati in studi multicentrici controllati, potrebbero aprire nuovi orizzonti per quanto riguarda la diagnosi precoce delle patologie oncologiche. BIBLIOGRAFIA 1. Lawrie LC, Fothergill JE and Murray GI. Spot the differences: proteomics in cancer research. The Lancet Oncology 2: , Charrier JP et al. Differential diagnosis of prostate cancer and benign prostate hyperplasia using two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 22: , Le Naour F et al. Proteomic-based identification of RS/JD-1 as a novel circulating tumor antigen in breast cancer. Clinical Cancer Research 7: , Anderson NL and Anderson NG. The human plasma proteome: history, character and diagnostic prospects. Molecular & Cellular Proteomics 1: , Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 359(16): , Adam B-L, Qu Y, Davis JW et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benigne prostate hyperplasia and healthy men. Cancer Res 62: , Li J, Zhang Z, Rozenweig J et al. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer. Clin Chem 48(8): , QuY. et al. Boosted decisiion tree analysis of SELDI mass spectral serum profiles discriminates prostate cancer from noncancer patients. Clinical Chemistry 48(10): , Lubman DL et al. Two-dimensional liquid separation-mass mapping of proteins from human cancer cell lysates. Journal of Chromatography B 782: , Cutler P. Protein arrays: the current state-of-the-art. Proteomics 3:3-18, Miller JC et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics 3:56-63, Kozak KR et al. Identification of biomarkers for ovarian cancer using strong anion-exchange ProteinChips: potential use in diagnosis and prognosis. PNAS 100: , Koopmann et al. Serum diagnosis of pancreatic adenocarcinoma using Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization Mass Spectrometry. Clin Cancer Res 10: , LigandAssay 9 (3) 2004

9 IL CONTROLLO DELLA FUNZIONE GONADICA MISURA DELLE GONADOTROPINE E FISIOPATOLOGIA DELL ASSE IPOFISI-GONADI P. Beck-Peccoz Istituto di Scienze Endocrine, Università degli Studi, Ospedale Maggiore IRCCS, Milano Le gonadotropine sono ormoni glicoproteici strutturalmente molto com-plessi, essendo eterodimeri composti da due subunità codificate da geni diversi posti su cromosomi differenti: una é la subunità a, comne a tutte le glicoproteine (LH, FSH, TSH e CG) e l'altra é la subunità b, specifica per ogni singolo ormone; solo l'ormone intero é in grado di svolgere la specifica azione biologica, essendo le subunità libere del tutto prive di bioattività. Notevoli progressi sono stati recentemente compiuti nell ambito della misurazione dell LH e dell FSH. Infatti, l utilizzo di anticorpi monoclonali di cui uno legato ad una fase solida ed un'altro marcato ha permesso di costruire una metodica non competitiva a "sandwich" nella quale il segnale finale é direttamente proporzio-nale alla quantità di ormone presente nel campione. Contrariamente a quanto osservato con le vecchie metodiche RIA, tale approccio metodologico evita che le subunità libere delle glicoproteine, particolarmente la subunità a, vengano riconosciute come ormone intero, così causando una sovrastima dei reali livelli di LH o di FSH presenti nel campione. Questi nuovi metodi immunometrici possiedono una elevata sensibilità e una elevata specificità, il che rende più sicura l'interpretazione del dato di laboratorio e la valutazione della possibile discrepanza tra dato di laboratorio e dati clinici, discrepanza che può suggerire l esistenza di vari disordini tra cui la possibile presenza di adenomi ipofisari secernenti LH e/o FSH, oppure di mutazioni dei geni che codificano l una o l altra gonadotropina. Di grande rilievo è stata l osservazione che i livelli di LH e/o FSH misurati con i nuovi metodi immunometrici paiono correlare in maniera molto più precisa con l attività biologica delle molecole circolanti. E però chiaro che nessun metodo immunometrico potrà sostituire la misurazione diretta della bioattività dell ormone secreto, dipendendo questa dal grado di glicosilazione e dalla composizione oligosaccaridica delle catene glicosidiche che non necessariamente modificano l immunoreattività delle molecole circolanti. Recenti studi hanno comunque rivelato che anche alcuni metodi di dosaggio immunometrico a sandwich possono dare valori di LH falsamente ridotti. Ciò avviene se uno degli anticorpi monoclonali utilizzati nel metodo di dosaggio è specifico per un epitopo a/b conformazionale. Nel caso delle varianti dell LH, mutazioni del gene per l LHb fan sì che questo epitopo sia mascherato e, quindi, non disponibile a formare il sandwich. L attività biologica del mutante è pressoché normale e i pazienti omozigoti per tale mutazione sono clinicamente eugonadici. LigandAssay 9 (3)

10 APPLICAZIONI CLINICHE DELLE DETERMINAZIONI DI INIBINA, ACTIVINA E MOLECOLE CORRELATE S. Luisi, P. Florio, G. Calonaci, L. Galleri, A. Imperatore, F. M. Severi, F. Petraglia Cattedra di Ostetricia e Ginecologia, Dipartimento di Pediatria, Ostetricia e Medicina della Riproduzione, Università degli Studi, Siena Le inibine sono proteine appartenenti alla superfamiglia del trasforming growth factor beta (TGF-β). L inibina ha una struttura dimerica, formata dalla combinazione della subunità α e di una delle due subunità β, βa e βb che variamente associate danno origine alla inibina A (αβa) e alla inibina B (αβb). Sono prodotte principalmente dall ovaio a livello delle cellule della granulosa, della teca e dalle cellule luteiniche, mentre, nel corso della gravidanza, la placenta umana, la decidua e le membrane fetali ne sono i maggiori siti di produzione. Durante il ciclo mestruale i livelli di inibina A sono elevati durante la fase follicolare tardiva e la fase luteale, mentre la secrezione di inibina B aumenta gradualmente durante la fase medio-follicolare per poi decrescere durante la fase luteale. In premenopausa una graduale diminuzione del numero di follicoli ovarici sottolinea il declino delle potenzialità riproduttive. E noto che in questa fase della vita le donne mostrano cicli mestruali regolari, con un aumento dei livelli sierici di FSH durante la fase follicolare, con livelli di estrogeni e LH normali. Tale aumento è direttamente correlato alla diminuzione della riserva follicolare e quindi al tasso di fertilità. Infatti, donne in età perimenopausale mostrano: a) livelli di inibina B ridotti durante la fase follicolare, con livelli di FSH elevati ed estradiolo normali; b) i livelli di inibina B durante la fase follicolare decrescono più rapidamente; c) livelli di inibina A ridotti durante la fase luteale. I livelli di inibina A e di inibina B sono significativamente ridotti in donne con menopausa precoce, come accade nelle donne sane in postmenopausa. L utilizzo dell inibina B nei programmi di fecondazione assistita, i cui livelli circolanti sono direttamente correlati alla riserva follicolare, sembra proponibile come marker attendibile di risposta ovarica. Infatti bassi livelli circolanti di inibina B al 3 giorno nel siero di donne che si sottopongono a programmi di fecondazione assistita sono correlati ad una scarsa risposta all induzione dell ovulazione. Questi dati suggeriscono che l inibina B può essere considerato come indicatore di riserva follicolare e rivestire un ruolo predittivo di risposta ovarica alle terapie per la fecondazione assistita. Durante il primo trimestre di gravidanza, l unità feto-placentare è la maggiore sorgente di inibina A. L mrna delle subunità dell inibina (α βa βb) sono state localizzate, tramite ibridazione in situ, nel trofoblasto placentare, nelle membrane fetali e nella decidua. Da questi tessuti l inibina A è secreta nel circolo materno e nel liquido amniotico. A tale epoca gestazionale i livelli sierici di inibina A sono più alti che nelle non gravide, mentre i livelli di inibina B non variano significativamente rispetto a quelli nelle donne non gravide. Diversi studi hanno dimostrato una possibile applicazione clinica nella misurazione di tali proteine nella diagnosi, nella valutazione prognostica e nel follow-up di diverse patologie gestazionali, quali aborto, pre-eclampsia, ipertensione indotta dalla gravidanza, e Sindrome di Down. In conclusione, il caratteristico andamento delle inibine deriva da un diverso ruolo fisiologico. Mentre l inibina B, prodotta prevalentemente dalle cellule della granulosa sotto lo stimolo dell FSH, sembra essere un marker significativo di crescita follicolare, l inibina A è secreta prevalentemente dal corpo luteo e sembra svolgere un ruolo di feedback inibitorio sulla sintesi e secrezione ipofisaria di FSH nel passaggio dalla fase follicolare a quella luteinica. 216 LigandAssay 9 (3) 2004

11 IL FENOMENO DELLA MACROPROLATTINEMIA E. Martino Dipartimento di Endocrinologia e Metabolismo, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi, Pisa RIASSUNTO NON PERVENUTO LigandAssay 9 (3)

12 INDAGINI BIOCHIMICHE E GENETICHE NELL INSUFFICIENZA OVARICA PRECOCE L. Persani, E. Di Pasquale, M. Bonomi, R. Rossetti, M. Busnelli, S. Borgato Istituto di Scienze Endocrine, Università degli Studi, Laboratorio di Ricerche Endocrinologiche, IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano. La insufficienza ovarica primitiva o menopausa precoce (premature ovarian failure, POF) è una malattia frequente (1-2% delle donne di età inferiore a 40 anni) ed eterogenea. Le forme più gravi sono conseguenza di disgenesia ovarica e si manifestano con amenorrea primaria (50% delle amenorree primarie sono dovute a disgenesia ovarica). Nella maggioranza dei casi la POF si associa ad anomalie del cromosoma X (delezioni, traslocazioni), ma frequente è anche la possibilità di una patogenesi autoimmune. Sono numerosi i casi di POF idiopatica con cariotipo 46,XX in cui la causa rimane sconosciuta. Una accurata definizione del quadro clinico e biochimico è necessaria per individuare il meccanismo patogenetico. Recentemente abbiamo identificato la prima mutazione umana del gene BMP15 associata a disgenesia ovarica e amenorrea primaria in due sorelle che hanno ereditato l alterazione genetica dal padre (DiPasquale et al, Am J Hum Genet 2004). Dal momento che BMP15 ha un ruolo ovaio-specifico e il suo gene mappa sul cromosoma X, questa famiglia rappresenta un caso eccezionale di malattia legata al cromosoma X che colpisce le femmine eterozigoti che hanno ereditato la anomalia dal portatore maschio emizigote. Sono in corso studi rivolti a chiarire la frequenza del coinvolgimento di alterazioni in questo ed altri fattori di crescita prodotti dall ovaio nella patogenesi della POF. 218 LigandAssay 9 (3) 2004

13 PROGRESSI NEI SAGGI PER LE MALATTIE CARDIOVASCOLARI LA DETERMINAZIONE DEL BNP: APPLICAZIONI CLINICHE E PROBLEMI ANALITICI A. Clerico,C. Prontera Istituto di Fisiologia Clinica, CNR, Pisa Fino a circa 25 anni fa, il laboratorio metteva a disposizione del cardiologo solo pochissimi test diagnostici, per lo più utilizzati per la valutazione del danno al tessuto miocardico, in verità assai poco sensibili e specifici. Del tutto recentemente, sono stati sviluppati metodi altamente sensibili e specifici (come il dosaggio della troponina) che hanno praticamente rivoluzionato la classificazione ed in parte anche la fisiopatologia dell'infarto miocardico, contribuendo ad accrescere enormemente l'importanza del laboratorio di analisi nella pratica clinica cardiologica. Ancora più recentemente sono stati messi a punto dei metodi di dosaggio per marcatori ritenuti in grado di fornire informazioni sulla funzionalità cardiaca, fra questi soprattutto i Peptidi Nariuretici Cardiaci (PNC) Le miocellule cardiache (sia atriali che ventricolari) sono in grado di secernere dei peptidi con attività natriuretica, come l'anp (Atrial Natriuretic Peptide) ed il BNP (Brain Natriuretic Peptide). I PNC mostrano una caratteristica forma ad anello, costituito da un ponte di cisteine. Questo anello è essenziale per la loro attività biologica, in quanto è proprio attraverso questa porzione della catena peptidica che i PNC si legano ai loro recettori specifici. I PNC posseggono numerosi effetti biologici, fra cui i più importanti per il sistema cardiovascolare, sono l'aumento di diuresi e natriuresi, l'inibizione della secrezione, produzione e/o azione di molti fattori neuro-ormonali (catecolamine, sistema renina-angoiotensina-aldosterone, endoteline, sistema vasopressina/adiuretina ed alcune citochine), la diminuzione della pressione arteriosa e l'azione inibente sul fenomeno della restenosi post-angioplastica e sul rimodellamento cardiaco post-infarto. Sia l ANP che il BNP sono peptidi prodotti dalle cellule cardiache in forma di pro-ormoni, cioè come parte di una catena peptidica molto più lunga. Per quanto concerne il BNP, al momento del rilascio nel circolo ematico, la catena del pro-ormone viene tagliata da specifici enzimi che determinano la formazione di una catena più corta, che è l ormone vero e proprio (il BNP) ed una catena più lunga costituita da ciò che rimane del pro-ormone originario (NT-proBNP). A livello del circolo ematico si può quindi ritrovare sia l'ormoni attivo BNP che il relativo pro-ormone rimanente, NTproBNP, che è inattivo. Gli ormoni attivi (ANP e BNP) hanno una velocità di degradazione in vivo molto rapida, con una emivita plasmatica di pochi minuti; per contro, i pro-ormoni hanno una emivita molto più lunga. Per tale motivo, i pro-ormoni inattivi, NT-proANP e NT-proBNP, presentano delle concentrazioni plasmatiche che sono molto più elevate rispetto ai peptidi attivi. Si ritiene attualmente che l ANP sia prodotto prevalentemente a livello del tessuto atriale, mentre il BNP a livello del tessuto ventricolare. Lo stimolo predominante per la secrezione e produzione a livello atriale dei PCN è lo stiramento della parete atriale. Recenti studi suggeriscono che non solo la distensione delle parete ventricolari, ma anche la sola ipertrofia, come anche l'ischemia miocardica, possono stimolare la produzione/secrezione di BNP nel tessuto ventricolare. Poiché la massa ventricolare è molto maggiore rispetto a quella atriale, uno stimolo cronico produce molte più molecole di BNP (e NT-proBNP) che di ANP. Per esempio, nello scompenso cardiaco si osserva che il rapporto fra il numero di molecole circolanti di BNP, rispetto a quelle di ANP, tende ad aumentare con la gravità della disfunzione miocardica e dei sintomi di insufficienza cardiaca; così che, mentre nel soggetto normale il rapporto fra le molecole di BNP ed ANP è circa uguale all unità, nello scompenso grave vi sono da 3 a 5 molecole circolanti di BNP per una di ANP. Tuttavia, i livelli circolanti dei PNC possono essere aumentati anche in alcune condizioni fisiologiche (soprattutto esercizio fisico e gravidanza) e patologiche (ipertiroidismo, insufficienza renale ed epatica, embolia polmonare, ecc.), come anche per la somminstrazione di farmaci (estro-progestinici, ormoni tiroidei, cortisonici, simpatico-mimetici con attività beta-stimolante, digitale, e talvolta anche beta-bloccanti). E' stato suggerito che i PNC possono essere considerati dei marcatori di funzionalità cardiaca, che possono essere utilizzati nella pratica clinica sia per motivi diagnostici che prognostici, sia per valutare la risposta terapeutica.. Dal punto di vista diagnostico, è importante sottolineare come il dosaggio del BNP (o NT-proBNP) non possa sostituire l'esame eocardiogarfico, ma entrambi devono essere presi in considerazione nella valutazione di un paziente con sospetto di insufficienza cardiaca e devono pertanto essere eseguiti in serie: prima il dosaggio meno costoso ed impegnivo (il dosaggio del BNP/NT-proBNP) e dopo l'esame strumentale (ecocardiografia). Infatti, questi due esami LigandAssay 9 (3)

14 producono informazioni complementarari, entrambe utili per l'inquadramente diagnostico e prognostico del paziente con sospetto di insufficienza cardiaca. In questi ultimissimi anni, si stanno accumulando sempre più dati sul valore prognostico del dosaggio dei PNC anche in pazienti con sindrome coronarica acuta e/o infarto del miocardio. I livelli circolanti dei PNC presentano un valore prognostico indipendente di mortalità o di morbilità (aumento degli interventi sanitari, reinfarto od altri eventi cardiaci), rispetto a quello dei risultati dell'esame emodinamico e/o cardiografico, della dimensione dell'area infartuale e dei livelli circolanti dei marcatori di necrosi e dell'infiammazione. Pochi dati sono invece reperibili in letteratura sull'analisi dei costi/benefici di utilizzare il dosaggio dei PNC nel follow-up di pazienti con scompenso cardiaco, anche se alcuni studi suggeriscono che il dosaggio del BNP (o del NTproBNP) possa guidare il clinico verso una terapia più personalizzata del paziente con insufficienza cardiaca. 220 LigandAssay 9 (3) 2004

15 DETERMINAZIONE DEI MARCATORI DI DANNO MIOCARDICO M. Poggesi AOU Careggi, Firenze La determinazione della Troponina si è aggiunta nella pratica clinica a quella dei marcatori enzimatici tradizionali accentuando così l eterogeneità dei criteri diagnostici per l infarto miocardico (IM) anche se di fatto l impiego dei vecchi marcatori quali l aspartato aminotransferasi (AST), la creatinfosfochinasi totale (CK) e la lattato deidrogenasi (LDH) è stato sostituito da quello di marcatori più recenti come la mioglobina ma soprattutto l isoenzima CK-MB e la troponina: fra questi il più precoce (nelle prime 3-6 ore) per la diagnosi dell IM risulta essere la Mioglobina, mentre il CK-MB è positivo nel 95% intorno alle 12 ore e la Troponina è il marcatore più specifico nelle prime 6-12 ore. Alla luce del documento congiunto, redatto dalla Società Europea di Cardiologia (ESC) e dall American College of Cardiology (ACC) sulla ridefinizione dell IM e pubblicato nella sua forma definitiva nel 2000, ogni grado di necrosi miocardica causata da un evento ischemico sembra debba essere etichettata come infarto, per cui un soggetto al quale in precedenza veniva diagnosticata una severa angina pectoris, stabile o instabile, potrebbe attualmente ricevere la diagnosi di IM di piccole dimensioni. L impiego della TnI risulta dunque importante non solo per la diagnosi di IM ma anche per la stratificazione del rischio di infarto miocardico. Dal momento inoltre che proprio secondo le raccomandazioni del documento congiunto ESC/ACC viene indicata per soglia di TnI e CK-MB un valore maggiore del 99 percentile dei valori di un gruppo di controllo e il valore più basso con CV minore o uguale al 10%, visto anche che per molti metodi attualmente disponibili l imprecisione analitica ai livelli decisionali suggeriti dal documento risulta troppo elevata, Architect TnI sembra essere un valido metodo di indagine dati i valori di sensibilità analitica e funzionale mostrati: Sensibilità analitica Architect TnI= ng/ml Sensibilità funzionale Architect TnI 10%CV = ng/ml Il Valore di Architect TnI al 99 percentile nella nostra osservazione è risultato al di sotto della sensibilità analitica del metodo. LigandAssay 9 (3)

16 ASPETTI ANALITICO - ORGANIZZATIVI DEI MARCATORI CARDIACI IN ELEVATA AUTOMAZIONE S. Valaperta Ospedale Istituto Clinico Humanitas, Rozzano (MI) Viene presentata l organizzazione del Laboratorio Analisi Cliniche del Istituto Clinico Humanitas, un moderno teching-hospital ad alta complessità con 600 letti e 22 sale operatorie, per quanto attiene l esecuzione di indagini ematochimiche richieste in regime di emergenza. Vengono altresì presentati i risultati, in termini di accuratezza analitica, significatività diagnostica ed efficienza di processo, dell introduzione di nuove metodiche in immuno-chemioluminescenza potenziata per la misura della concentrazione sierica della troponina I, della CPK-MB e della mioglobina. 222 LigandAssay 9 (3) 2004

17 RUOLO ED EVOLUZIONE DEI PROGRAMMI DI VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITÀ (VEQ) EVOLUZIONE DEI PROGRAMMI DI VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITÀ GC Zucchelli, A Pilo, R Conte, F Cantini, MR Chiesa, A Mercuri Istituto di Fisiologia Clinica, CNR, Pisa L Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa (IFC-CNR) organizza da oltre 20 anni i programmi EQAS-CNR per la Valutazione Esterna di Qualità (VEQ) di ormoni e marcatori tumorali. Nel corso degli anni, per rendere più facilmente interpretabili i riepiloghi preparati per i partecipanti, numerose modifiche sono state introdotte nella elaborazione e nella presentazione dei dati. Inoltre l applicazione della ICT (Information and Communication Technology), ha apportato importanti e significativi miglioramenti alle modalità di gestione e di trasmissione dell informazione (invio a IFC-CNR del modulo risposta, invio ai laboratori dei riepiloghi periodici e cumulativi, comunicazioni ai partecipanti). Elaborazione e presentazione dei dati L ultima versione (2004) del riepilogo periodico del programma Immunocheck è riportata in figura dev% dalla media di tutti il tuo risultato dev% dalla media del tuo metodo valore di z punteggio statistiche di tutti i risultati statistiche del tuo metodo numero dei risultati codici dei metodi statistiche dei metodi più usati numero dei risultati aberranti istogramma del tuo metodo posizione del tuo risultato statistiche e istogrammi del singolo campione di controllo valutazione del tuo risultato istogramma di tutti i risultati il punteggio medio quantifica la prestazione del tuo laboratorio grafico cumulativo dei valori di z e dei punteggi del tuo laboratorio n campione, metodo, valore di z = dev% dal bersaglio/cv% stato dell arte punteggio: 4: ottimo ( Z <0.5), 3: buono (0.5< Z <1), 2: sufficiente (1< Z <2) 1: insufficiente (2< Z <3), -2: inaccettabile ( Z >3) LigandAssay 9 (3)

18 I punti principali del riepilogo che hanno subito importanti evoluzioni rispetto alle versioni precedenti sono: 1. Il risultato del laboratorio viene giudicato confrontandolo con la media del metodo considerata valore bersaglio. Questa scelta quasi sempre adottata nelle VEQ di ormoni e marcatori tumorali- è determinata dalla difficoltà a definire un valore vero con metodi indipendenti di riferimento e dalla constatazione di notevoli differenze sistematiche tra metodi, che rendono meno efficace e più questionabile l uso della media di consenso come bersaglio. D altra parte l uso della media del metodo è possibile soltanto per gruppi di risultati omogenei (evitando errori di classificazione dei metodi) e abbastanza numerosi da garantire l affidabilità statistica della media calcolata; in pratica questo implica che il numero di partecipanti deve essere molto elevato (i controlli con numerosi partecipanti sono sempre i più informativi) in modo che, quando i risultati sono raggruppati per metodo, molti gruppi abbiano una numerosità sufficiente (e.g. almeno 5 risultati). 2. La prestazione del laboratorio è valutata anche attraverso l attribuzione di un punteggio. Per questo lo scarto % del risultato dal bersaglio viene normalizzato per il CV% stato-della-arte (variabilità tipo della misura dello specifico analita ricavata dall analisi di numerosi campioni di controllo); questa normalizzazione permette di esprimere lo scarto dal bersaglio in termini di valore Z (cioè in unità di SD) e rende naturale l attribuzione al risultato di un punteggio (vedi figura). Adottando questo criterio, i risultati giudicati insufficienti ( Z > 2) risultano, come atteso, ca. il 5% di tutti i risultati. 3. Istogramma di tutti i risultati e dei risultati del metodo; indicazione grafica del risultato del laboratorio, del valore bersaglio e dei limiti di accettabilità ( scarto <2SD dal valore bersaglio). 4. Grafico cumulativo (o storico ) dei risultati ottenuti dal laboratorio nell ultimo esercizio di controllo e nei 3 esercizi precedenti. Sul grafico il laboratorio può leggere i valori Z e i punteggi corrispondenti; è riportato anche il punteggio medio che quantifica la prestazione cumulativa del laboratorio. 5. L uso del colore (nella tabella delle statistiche, negli istogrammi, nel grafico storico dei punteggi) per permettere una più facile leggibilità del riepilogo. Trasmissione e gestione delle informazioni Attraverso l applicazione ai programmi EQAS-CNR delle nuove tecnologie informatiche (ICT) è stato sviluppato un sistema di gestione basato sul web che permette di: 1) velocizzare i processi automatici e manuali di inserimento dei dati; 2) velocizzare la produzione dei riepiloghi; 3) ridurre gli errori; 4) incrementare l affidabilità statistica delle informazioni mediante la capacità di gestire un numero elevato di partecipanti; 5) aumentare l interazione tra organizzatori e partecipanti. Il nuovo sistema per la gestione dei programmi EQAS-CNR è basato sull uso di un server dedicato; i risultati dei controlli sono archiviati su un database relazionale la cui interfaccia è costituita da un sito web di amministrazione (riservato a IFC-CNR come gestore del controllo) e da un sito web dedicato ai partecipanti. Il sito di amministrazione permette di gestire l anagrafica dei laboratori, di inserire i dati non inviati direttamente via internet ma pervenuti per posta o fax, di effettuare le analisi statistiche, di visualizzare i risultati di queste analisi facilitando l individuazione di risultati anomali (errori di unità, errori di classificazione dei metodi, ecc.) che devono essere eliminati per non inquinare l analisi definitiva. Il sito web dedicato ai partecipanti (cui si accede mediante password) permette al laboratorio di inserire nel database -direttamente attraverso internet- i propri risultati (attraverso il modulo risposta/pagina web) e di verificare la correttezza dei dati inseriti, grazie alla ricevuta che il sistema invia loro automaticamente tramite . Alla scadenza dell esercizio di controllo (appena le statistiche sono state calcolate e verificate da IFC-CNR) il laboratorio può generare il riepilogo, consultarlo ed eventualmente scaricarlo (in formato pdf) per produrne una copia cartacea. Il laboratorio può anche consultare, accedendo alla propria area riservata nel sito web, l archivio dei campioni degli esercizi di controllo precedenti e verificare i propri risultati e le statistiche del proprio o di altri metodi. La consultazione dei riepiloghi attraverso pagine web permette una informazione più dettagliata superando le limitazioni di spazio imposte dal supporto cartaceo. 224 LigandAssay 9 (3) 2004

19 USO DEGLI SCHEMI DI VEQ PER LA VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI DEI LABORATORI CLINICI E DEI TEST DIAGNOSTICI: PROSPETTIVE E LIMITI F. Ceriotti Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele, Milano La relazione tratterà delle problematiche relative all utilizzo dei programmi di VEQ al fine di valutare le prestazioni dei kit diagnostici, oppure come strumento di un qualsiasi ente normativo per valutare le prestazioni dei laboratori clinici. Sarà illustrato il documento ISO che descrive le caratteristiche degli schemi di controllo di qualità che possono essere utilizzati come sistemi di sorveglianza post vendita. Si discuteranno in particolare i limiti degli schemi di VEQ, limiti che li rendono strumenti deboli per una valutazione completa e oggettiva delle prestazioni, sia di un sistema analitico che di un laboratorio. Il punto più critico del sistema sono i materiali impiegati in questi schemi, materiali che raramente sono in grado di comportarsi esattamente come un siero umano fresco. Saranno quindi illustrati con alcuni esempi gli effetti della mancanza di commutabilità e come questi problema costituisca un limite importante all uso degli schemi di VEQ come strumenti di controllo fiscale (sia dei reattivi che dei laboratori). LigandAssay 9 (3)

20 VEQ E ACCREDITAMENTO DEI LABORATORI L. Sciacovelli Centro di Ricerca Biomedica, PO Castelfranco Veneto (TV) RIASSUNTO NON PERVENUTO 226 LigandAssay 9 (3) 2004

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