CORSO BIOLOGIA MOLECOLARE I. Testi consigliati

Transcript

1 CORSO BIOLOGIA MOLECOLARE I Dott. Massimo Pancione e.mail massimo.pancione@unisannio.it Obiettivo del corso: Comprendere i meccanismi molecolari dei processi biologici fondamentali, descrivere le tecniche sperimentali più comuni e le recenti acquisizioni in Biologia Molecolare. Testi consigliati

2 Concetti di Base 1) Studio delle molecole biologiche 2) Loro interazioni per lo svolgimento delle funzioni vitali della cellula. Struttura e funzione degli acidi nucleici

3 IL DNA e concetto di eredità 1. Conservazione del Materiale genetico 2. Decodificazione e trasmissione dell informazione genetica 1. Mendel Teoria cromosomica dell ereditarietà Geni e cromosomi Ipotesi sulla natura dei geni 1930

4 Scoperta del principio trasformante

5 Scoperta del principio trasformante Avery: anni 40 (dimostra che il DNA è il principio trasformante)

6 GENI VIRALI e DNA Batteriofago o fago (Hershey 1952) Dopo il ciclo di replicazione (infettivo) ricompare nella progenie principalmente il DNA marcato con isotopi radioattivi parentale di partenza

7 La doppia elica

8 La doppia elica

9 La doppia elica

10 La doppia elica

11 La doppia elica

12 La doppia elica

13 La doppia elica

14 Composizione e struttura degli acidi nucleici

15 Composizione e struttura degli acidi nucleici 4 nucleotidi non in egual misura Rapporto varia tra le specie Ordine preciso tra loro; specificità genetica Rapporto non casuale (A/T=1; G/C=1) Purine/pirimidine=1

16 Composizione e struttura degli acidi nucleici

17 Composizione e struttura degli acidi nucleici Basi azotate

18 Composizione e struttura degli acidi nucleici

19 Composizione e struttura degli acidi nucleici

20 Composizione e struttura degli acidi nucleici

21 Composizione e struttura degli acidi nucleici

22 Composizione e struttura degli acidi nucleici

23 Composizione e struttura degli acidi nucleici

24 Composizione e struttura degli acidi nucleici

25 Composizione e struttura degli acidi nucleici

26 polinucleotidi

27 polinucleotidi

28 Composizione e struttura degli acidi nucleici

29 Composizione e struttura degli acidi nucleici

30 Composizione e struttura degli acidi nucleici

31 Composizione e struttura degli acidi nucleici

32 Composizione e struttura degli acidi nucleici

33 Composizione e struttura degli acidi nucleici

34 Composizione e struttura degli acidi nucleici

35 Composizione e struttura degli acidi nucleici

36 Composizione e struttura degli acidi nucleici

37 Composizione e struttura degli acidi nucleici

38 Composizione e struttura degli acidi nucleici

39 Composizione e struttura degli acidi nucleici

40 Composizione e struttura degli acidi nucleici

41 Composizione e struttura degli acidi nucleici

42

43

44

45

46

47 Strutture tridimensionali del DNA La struttura tridimensionale del DNA descritta da Watson e Crick è definita forma B del DNA. Sono state trovate altre possibili strutture che il DNA può assumere: la forma A e la forma Z (in figura). La forma A è favorita in soluzione povere di acqua. Il DNA si organizza in una doppia elica destrorsa più larga, che contiene 11 residui per ogni giro. La forma Z è una doppia elica sinistrorsa che consta di 12 residui per ogni giro d elica. Strutture tridimensionali del DNA Il confronto tra le strutture tridimensionali del DNA mostra che la forma A è più larga mentre la forma Z più stretta rispetto alla forma B.

48 Composizione e struttura degli acidi nucleici

49 Composizione e struttura RNA

50 Composizione e struttura RNA

51 Composizione e struttura RNA

52 Composizione e struttura RNA

53 Composizione e struttura RNA Stelo-ansa forcina

54 Composizione e struttura RNA pseudonodi

55 Composizione e struttura RNA Coppie di basi non canoniche Favorita la forma A

56 Composizione e struttura RNA Può formare strutture terziarie complesse

57 Forze deboli e dissociazione del DNA

58 Forze deboli e dissociazione del DNA

59 Forze deboli e dissociazione del DNA

60 Forze deboli e dissociazione del DNA

61 Forze deboli e dissociazione del DNA

62 Forze deboli e dissociazione del DNA

63 Curve di rinaturazione La rinaturazione può essere seguita allo stesso modo mediante valutazione di assorbanza in funzione del tempo. Poichè la reazione è bimolecolare, bisogna tenere conto anche della concentrazione. Tipicamente i risultati sono rappresentati in funzione di Cot, cioè il prodotto della concentrazione per il tempo. Il Cot 1/2 è definito come il valore di Cot per cui metà del DNA è rinaturato Rinaturazione genoma umano puo essere approssimata dalla combinazione di tre curve di rinaturazione 1) una lenta, 2) intermedia e 3) veloce. Le tre curve corrispondono ai profili di rinaturazione rispettivamente del DNA a copia singola, delle sequenze ripetitive di tipo ALU e del DNA satellite.

64 Topologia del DNA La maggior parte dei cromosomi batterici (plasmidi) ed anche virus (SV40) sono circolari

65 Topologia del DNA Durante i vari processi replicazione, trascrizione i due filamenti che sono avvolti l uno sull altro debbono Separarsi, perciò la cellula deve rispettare dei vincoli topologici.

66 Il DNA è flessibile La molecola chiusa alle Estremità viene indicata come topologicamente definita Topologia del DNA

67 Topologia del DNA a) Rilassata b) Superavvolta c) Numero di legame topologico d) LN nuumero di volte che un filamento deve passare attraverso l altro Affinchè le due catene possano separarsi l una dall altra

68 Topologia del DNA Lk= Twist + Writhe Twist = numero di volte che Un filamento gira attorno All altro Write = il modo in cui si incrociano I due filamenti Positivo elica destrorsa Negativo

69 Topologia del DNA LN= Twist + Writhe 40 Lk 40 Tw 0 Wr 36 Lk 40Tw -4 Wr

70 Topologia del DNA I super avvolgimenti possono essere rimossi Dalle Dnasi. Con il taglio (idrolisi del legame fosfodiesterico) Il dna non è più topologicamente costretto La quantità di super avvolgimenti Viene chiamata delta Lk. Se molto diversa da zero il DNA È sottoposto a forte torsione Può avere segno negativo o positivo

71 Topologia del DNA

72 Topologia del DNA I batteri termofili hanno il DNA superavvolto + Meccanismo che preserva il DNA dalla denaturazione

73 Lk può essere cambiato Da enzimi specifici Topo. Introducono un taglio Uno o due filamenti Temporaneo dove viene Fatta passare l elica integra prima che venga Rinsaldata. Oppure possono concatenare o decatenare Molecole circolari di DNA Topoisomerasi

74 DNA 1) Lineare eucarioti 2) Circolare batteri, virus

75 cromatina

76 Differenze procarioti ed eucarioti Dimensione e complessità del genoma (1kb =10000 b) Compartimentazione del genoma Organizzazione strutturale del genoma 1) Aploide unica copia cromosoma 2) Diploide due copie di ciascun cromosoma

77 DNA aploide e diploide

78 Grandezza del Genoma e ed evoluzione The idea was that the more complex the species the more genes it needed. Preliminary data seemed to confirm this idea. The C-value is the amount of DNA in the haploid genome of an organism It varies over a very wide range, with a general increase in C-value with complexity of organism from prokaryotes to invertebrates, vertebrates, plants.

79 Genoma e ed evoluzione

80 Genoma e ed evoluzione

81

82

83

84 Genoma e ed evoluzione

85

86

87

88 Genoma e ed evoluzione Misura del genoma (1kb =1000 bp) bp = base pair(s) = circa 3.4 Å 108 coppie di basi = kb Mb = mega base pairs = 1,000,000 bp Gb = giga base pairs = 1,000,000,000 bp 1) E. Coli circa 5 Mb 2) Uomo 3200 Mb; 3,2 Gb Densità genica Numero di geni Contenuto in una megabase Di DNA genomico 5000 geni/50mb 100 geni per megabase

89 Tendenzialmente all aumentare della complessità di un organismo, decresce la densità genica ed aumentano le sequenze ripetute.

90 1) E. Coli cromosoma Prevalentemente Proteine ed RNA strutturali 2) Sequenze non codificanti regolazione Dei geni

91

92 Genoma e ed evoluzione Grandezza media di un gene umano è di 27kb Grandezza media delle proteine è 1,3kb Solo 5% del materiale genetico codifica per proteine

93 Genoma e ed evoluzione

94 Genoma e ed evoluzione

95 Genoma

96 Genoma

97 Genoma e ed evoluzione

98 Genoma e ed evoluzione Sequenze regolative Regioni intergeniche uniche Pseudogeni Relitti? Non espressi? DNA microsatellite 3% Regioni intergeniche ripetute DNA altamente ripetuto 45%

99

100 Genoma e ed evoluzione

101

102

103

104

105 Genoma e ed evoluzione DNA ripetuto Sequenze semplici molto corte ripetute in tandem microsatellite Sequenze molto grandi (100bp-1kb) ripetuto singole copie o cluster trasposoni

106

107

108

109 proteoma

110

111