RNA interference e sue applicazioni

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1 RNA interference e sue applicazioni Cosa è l RNA interference Come funziona Funzione biologica nei diversi organismi Come può essere utilizzata per fini applicativi e di genetica funzionale

2 Che cosa è l RNA interference? L RNA interference (RNAi o shrna) è un fenomeno di silenziamento post-trascrizionale dell espressione genica (PTGS) -> Knockdown dell mrna E basato sull attivazione del processo di degradazione dell RNA citoplasmatico sequenza- specifico Meccanismo di silenziamento genico presente ed applicabile in protozoi, nematodi, Drosophila, piante, funghi e mammiferi I ruoli biologici dell RNAi sono molteplici: difesa da virus patogeni ad RNA, da elementi genetici mobili come trasposoni, regolazione dell espressione genica endogena, modulatore dei processi di sviluppo embrionale, azione sul patrimonio genico

3 Annullamento della funzione di un gene Knock out Knock down Eliminazione del gene Mediante inattivazione genica specifica (ad es. iniezione del gene interrotto nell oocita fecondato o nelle ES) Eliminazione dell mrna del gene Mediante RNA antisenso, oligodeossinucleotidi, ribozimi, o RNAi

4 Precedentemente si era osservato nelle piante Richard Jorgensen, nel 1990, nel tentativo di up-regolare la pigmentazione di petunie transgeniche, ha introdotto il transgene della calcone sintasi (chsa), enzima implicato nella produzione delle antocianine cosoppressione? La perdita di chsa mrna citosolico non era associata ad una ridotta trascrizione ma l espressione del transgene portava alla formazione di dsrna a causa di sequenze ripetute

5 poi in altri organismi sono in grado di rispondere all infezione da RNA virali portando il genoma virale alla degradazione meccanismo di difesa Meccanismi analoghi si ritrovano anche in Neurospora, nei metazoi come Drosophila, C.elegans e nei mammiferi Piante C. elegans Cellule HeLa Drosophila

6 Quelling in Neurospora crassa In Neurospora crassa l introduzione del transgene causa il silenziamento del gene omologo endogeno albino-1 (al-1) codificante una proteina del pathway biosintetico dei carotenoidi Romano e Macino (1992) Cogoni et al., (1996) wt al-1 mutante wt + transgene al-1 Il transgene causa la soppressione sia del gene endogeno che esogeno

7 Modelli di studio dell RNAi - studi genetici in C. elegans e in piante - studi biochimici in estratti di Drosophila L RNAi avviene in tutti gli organismi con meccanismi di base comuni che poi si specializzano a seconda del tipo di funzione biologica

8 Evidenze in Drosophila in vitro e in vivo -Estratti embrionali di Drosophila (cellule S2) - Iniezione di dsrna in cellule S2 a + mrna luciferasi AAAA AAAA AAAA luciferasi b AAAA AAAA + AAAA + dsrna > 500 nucleotidi

9 Prima fase: processamento del dsrna in frammenti di nt dsrna (>500 nucleotidi) incubato con lisati di embrioni di Drosophila viene processato a specie di nucleotidi Il processo richiede ATP dsrna diretto contro sequenze introniche sono inefficienti per il silenziamento sirna CHI PROCESSA dsrna? Zamore et al., (2001)

10 Gli sirna hanno una struttura definita 19 nt duplex Filamento senso P- Filamento antisenso -P -OH 2 nt 3 overhangs OHsiRNA hanno la stessa struttura dei prodotti di digestione della RNA-asi III di E.coli

11 Fase I: processamento del dsrna in frammenti di Isolato in estratti di embrioni di Drosophila short-interfering RNA Dicer - Interferenza con la funzione di Dicer riduce la capacita di silenziamento genico - Il mutante DCR-1in C.elegans produce un omologo di Dicer ed e incapace di effettuare il silenziamento genico

12 Dicer contiene 4 distinti domini DCR-1 (C. elegans) CAF/SIN-1(Arabidopsis thaliana) Dicer e Drosha in mammals and Drosophila Organismi mutanti per Dicer hanno difetti nello sviluppo - RNA elicasi N-t ATP dipendente - 2 domini RNA-asi III - dsrna binding domain c-t - dominio PAZ (Piwi,Argo,Zwille/Pinhead che condivide con proteine RDE1/QDE2/Argonaute, associate al processo di inteference) - Funziona come enzima dimerico

13 Fase II: il complesso RISC Taglio endonucleolitico nella regione di omologia tra RNAi e mrna, nel mezzo della regione duplex Il prodotto di Dicer RNAi viene rilasciato ed incorporato nel complesso RISC, complesso RNA nucleasico-proteico che degrada l mrna target

14 Riepilogo del meccanismo (21-23 nt) Solo uno dei 2 filamenti di RNA viene caricato su RISC Viene scelto il filamento termodinamicamente meno stabile al 5 RISC contiene - contiene una elicasi che srotola il dsrna -endoribonucleasi responsabile del taglio sull mrna

15 Fase II: il complesso RISC complesso nucleasico-proteico contiene una elicasi ed una endoribonucleasi si associa all RNAi taglia l mrna nucleotidi a valle dal 5 dell RNAi l mrna viene successivamente degradato molto probabilmente da una esonucleasi in alcuni organismi i frammenti di mrna possono essere convertite in dsrna da una RNA polimerasi RNA dipendente (RdRP) AMPLIFICAZIONE

16 Amplificazione dell RNAi Meccanismo noto in C.elegans, N.crassa, Dictyostelium discoideum, piante ma non nei mammiferi

17 RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) poche molecole di sirna sono sufficienti per portare alla continua degradazione dell mrna (in piante e C.elegans) in estratti embrionali di Drosophila si sono isolati dsrna completi generati da sirna marcati sia dsrna che ssrnasono utili per funzionare da templato per la RdRP la RdRP richiede sirna che abbiano P-5 e OH-3 per l amplificazione nelle piante e nei nematodi l effetto di silenziamento si diffonde anche nelle cellule circostanti, e viene ereditato anche dalla progenie in C.elegans la proteina di membrana SID-1 permette il trasporto di dsrna da cellula a cellula

18 P P E in cellule di mammifero? Attivazione della proteinchinasi RNA dipendente P PKR EIF2α Produzione di interferone 2-5 oligoadenilato sintasi dsrna Morte cellulare Blocco della sintesi proteica RNA-seL apoptosi

19 E in cellule di mammifero? Kumar M, Carmichael GG. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev (1998) 62:

20 E in cellule di mammifero? Tuschl e colleghi hanno dimostrato che l introduzione diretta di dsrna di 20 nucleotidi, che simulano i prodotti di degradazione di Dicer, e efficiente nel silenziamento e non scatena la risposta dell interferone gli sirna vengono direttamente incorporati da RISC gli sirna non sono riconosciuti da PKR nei mammiferi l effetto dell RNAi e transiente poiche non c e amplificazione

21 Funzioni biologiche dell RNAi Negli animali e nelle piante sono presenti piccoli RNAs di nucleotidi, che regolano post-trascrizionalmemte l espressione di alcuni geni. Il meccanismo con cui agiscono comprende 2 diversi pathway: sirna e strna sirna (small interfering RNA) quando questi RNA degradano l mrna tramite appaiamento sequenza specifica strna (small temporal RNA) quando bloccano la traduzione dell mrna tramite appaiamento non perfettamente sequenza-specifico

22 abbondanti in tutti i tipi cellulari anche in cellule di mammifero molecole di RNA a singolo filamento ma che si conformano in strutture ad hairpin a causa di zone di complementarieta variano da poche centinaia per cellula a molecole per cellula Vengono codificati dal genoma Regolano l espressione di geni distinti attraverso appaiamento di basi, inibendo la traduzione in proteine mirna regolano geni diversi (circa 100 geni/mirna)

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24 sirna microrna Degradazione dell mrna Blocco della traduzione

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26 Il grado di inibizione della traduzione da parte di mirna dipende da quante molecole di mirna sono legate all mrna target Diversi mirna possono avere un unico mrna nella regione al 3 non tradotta come target non codificano proteine COSA FANNO I MicroRNA? -Nei nematodi e nelle piante regolano lo sviluppo - In Drosophila regolano la divisione cellulare e la morte cellulare - Nelle cellule umane regolano l espressione genica e il differenziamento cellulare A seconda del grado di appaiamento con l mrna target i mirna possono anche portare alla degradazione - mir-375 (nell uomo) e naturalmente espresso nel pancreas- > la sua espressione sopprime la secrezione di insulina

27 strna o microrna e sirna

28 strna in C.elegans Nei nematodi le fasi di sviluppo sono regolate dai geni eterocronici lin-4 e let-7, che espressi in momenti diversi, controllano il susseguirsi dello sviluppo larvale Early Late Adult Lin-14 Lin-4 Lin-41 Let-7 Espressione proteica dei geni eterocronici

29 Proteina e RNA di lin-14 e lin-4 Studio dei mutanti Lin14gain of function e Lin4 loss of function:non diventano adulti Proteina Alti livelli di RNA non si traducono in alti livelli di proteina: regolazione dell mrna RNA 10x Lin-4 ha una sequenza complementare a lin-14 Nel mutante gain of function ci sono mutazioni nella regione di formazione del duplex Lin-4 blocca la traduzione di lin-14

30 7 siti di complementarieta tra lin-4 e lin-14

31 MicroRNA che inibiscono la traduzione

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34 Tra i fenomeni di silenziamento post-trascrizionale (impiego di ODN e ribozimi) l RNAi e il piu efficace nel bloccare l espressione di un gene - Silenziamento prossimo al 100% - Occorrono basse concentrazioni di interferente

35 Applicazioni di RNAi Ricerca biologica Definire funzioni geniche (alternativa al difficile e laborioso knockout) C. elegans genome RNAi projects Definire pathways biochimici microarray screening di RNAi knockdown su p53 Trattamenti terapeutici cancro Infezioni virali Infezioni da parassiti Malattie neurodegenerative Malattie geniche dominanti

36 Modalita di somministrazione sirna sintetici: facile, si possono provare molti target contemporaneamente ma costoso, effetto non duraturo (la durata dipende dal tipo cellulare) - Sintesi chimica di nucleotidi ad RNA - Trascrizione in vitro di corti RNA - Trascrizione in vitro di lunghi RNA seguito da taglio con RNA-asiIII Vettori a DNA: duraturi, problema dell integrazione random - Plasmidi - Vettori virali

37 Geni RAS frequentemente mutati nel cancro (soprattutto nel cancro del pancreas 85% e del colon 40%) Le proteine codificate dai geni RAS (K-RAS, H-RAS e N-RAS) regolano proliferazione, differenziamento e sopravvivenza cellulare trasduzione del segnale Mutazioni puntiformi bloccano la proteina oncogenica RAS mutata in una forma legante GTP persistentemente attivata La proteina wild-type e essenziale per lo sviluppo dell organismo topi nullizigoti per K-Ras muoiono nella fase embrionale

38 Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Cancer Cell 2002 Sep;2(3):243-7 L RNAi K-RAS V12 e specifico per l allele mutato! Come eliminare la funzione dell allele mutato endogeno K-Ras V12? Carcinoma del pancreas

39 Come rendere le cellule che portano l allele mutato stabilmente trasfettate con l interferente per K-Ras V12? Vettore retrovirale

40 Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Cancer Cell 2002 Sep;2(3):243-7 Trasfettate con H-Ras oncogene Topi nude iniettati con CAPAN-1 Le cellule wt non crescono su soft agar

41 Grande passo avanti per la terapia genica Specificita del target Riduce lo sforzo di lavorare sul vettore per conferire il tropismo per cellule target Le cellule normali non vengono danneggiate Approccio utile non solo per geni con mutazioni puntiformi ma anche per traslocazioni cromosomiche