UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE XX CICLO DEL DOTTORATO DI RICERCA IN PATOLOGIA SPERIMENTALE E CLINICA EFFETTO ANTIAPOPTOTICO DELL IL-1ra NEI MIOCARDIOCITI ISCHEMICI & L ENDOTELIO LINFATICO NELLA RICIRCOLAZIONE LEUCOCITARIA Settore scientifico-disciplinare: PATOLOGIA GENERALE ( MED04 ) DOTTORANDO DOTT. EDOARDO GUSTINI COORDINATORE DEL COLLEGIO DEI DOCENTI CHIAR.MO PROF. PIETRO DRI UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE RELATORE CHIAR.MO PROF. ALDO DOBRINA UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE CORRELATORE DOTT.SSA ELENA VECILE UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE 2

2 Durante il periodo di dottorato ho seguito vari progetti di ricerca. In questa tesi sono riportati i dati ottenuti dagli studi svolti sull Effetto antiapoptotico dell IL-1ra nei miocardiociti ischemici e quelli relativi allo studio de L endotelio linfatico nella ricircolazione leucocitaria. Considerata la diversa natura degli argomenti sopracitati ho preferito svilupparne separatamente la trattazione. 3

3 EFFETTO ANTIAPOPTOTICO DELL IL-1ra NEI MIOCARDIOCITI ISCHEMICI 4

4 Riassunto EFFETTO ANTIAPOPTOTICO DELL IL-1ra NEI MIOCARDIOCITI ISCHEMICI La morte di cellule cardiache per apoptosi è una fenomeno rilevante nelle cardiomiopatie ischemiche. Questo fenomeno è stato descritto nelle regioni peri-infartuali del miocardio nelle patologie coronariche e nel rimodellamento cardiaco dovuto a patologie ischemiche. L attivazione, per via mitocondriale, della caspasi-9 gioca un ruolo fondamentale nell apoptosi indotta da ischemia. Con questo lavoro si vuole dimostrare che: - l antagonista recettoriale dell interleuchina-1 (IL-1ra), che è catalogata come una citochina infiammatoria, è presente nei sieri di pazienti con una sindrome coronarica acuta a concentrazioni elevate. - l IL-1ra è attivamente prodotta dalle cellule cardiache ischemiche. - l IL-1ra inibisce, in vitro, l attività della caspasi-9. - l IL-1ra è una molecola che, in vivo, fa preservare i miocardiociti ischemici dalla morte per apoptosi. La scoperta di questa nuova funzione endogena dell IL-1ra evidenzia l importanza di questa proteina nel rimodellamento cardiaco, promuovendo la sopravvivenza dei miocardiociti nelle regioni ischemiche. Queste osservazioni pongono le basi razionali per iniziare a studiare possibili interventi terapeutici in specifiche patologie dove, con il controllo dell apoptosi attivata per via mitocondriale, si potrebbero ottenere dei vantaggi sul piano clinico. 5

5 INDICE INDICE...6 INTRODUZIONE ANTAGONISTA RECETTORIALE DELL INTERLEUCHINA Interleuchina 1 e interleuchina Effetti dell IL Regolazione dell IL IL-1 nel miocardio ischemico Recettore dell interleuchina Scoperta dell IL-1ra Gene dell IL-1ra Polimorfismi del gene e malattie associate: Isoforme dell IL-1ra: Funzioni biologiche dell IL-1ra sil-1ra icil-1ra IL-1ra nel cuore Forma commerciale dell IL-1ra Anakinra MIOCARDIO ISCHEMICO Rimodellamento cardiaco Stress meccanico Stress biochimico Ostruzione delle arterie coronariche: APOPTOSI Le caspasi Via Estrinseca (o recettore-mediata) Via Intrinseca (o mitocondriale) Meccanismi di apoptosi nel cuore: SCOPO DELLA RICERCA MATERIALI E METODI OTTENIMENTO DEI CAMPIONI ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA TESSUTO Analisi spettrofotometrica Elettroforesi TRASCRIZIONE INVERSA AMPLIFICAZIONE E QUANTIFICAZIONE DEL cdna IMMUNOISTOCHIMICA COIMMUNOPRECIPITAZIONE WESTERN BLOT SAGGI DI ATTIVITÀ DELLE CASPASI IN VITRO LEGATURA DELLA CORONARIA (MURINA) MODELLO MURINO KO per IL-1ra E GENOTIPIZZAZIONE COLTURE CELLULARI HL RISULTATI L IL-1ra È SINTETIZZATA DAI MIOCARDIOCITI UMANI Immunofluorescenza per IL-1ra e PECAM-1 su cuori umani IL-1ra e caspasi 3 attiva non colocalizzano nel miocardio In situ RT /PCR per IL-1ra su cuori umani espiantati Real Time PCR per le varie isoforme dell IL-1ra AUMENTO DELLA SINTESI DELL IL-1ra NEI MIOCARDIOCITI ISCHEMICI Colture cellulari, in condizioni ipossiche, di cardiomiociti murini produconoil-1ra Real time PCR per l isoforma solubile dell IL-1ra murina su cardiomiociti ischemici Real time PCR per l isoforma intracitoplasmatica dell IL-1ra murina su cardiomiociti ischemici Espressione dell IL-1ra nei miocardiociti murini in coltura in presenza di stimoli infiammatori Espressione dell IL-1ra in topi con un infarto indotto sperimentalmente L IL-1ra PROTEGGE I MIOCARDIOCITI ISCHEMICI DALLA MORTE PER APOPTOSI

6 3.1. Cuori murini ipossici esprimono tutte e due le isoforme per l IL-1ra Cuori murini (IL-1ra +/+ ) ipossici presentano una bassa percentuale di cardiomiociti TUNEL positivi Cuori murini (IL-1ra -/- ) ipossici presentano una alta percentuale di cardiomiociti TUNEL positivi L IL-1ra INIBISCE IN VITRO LA CASPASI Capacità dell IL-1ra di inibire in vitro l attività delle caspasi 3,6,7 e L IL-1ra co-immuno-precipita con la caspasi-9 attiva L IL-1ra non è inibita da Smac/DIABLO DISCUSSIONE BIBLIOGRAFIA

7 INTRODUZIONE 1. ANTAGONISTA RECETTORIALE DELL INTERLEUCHINA 1 L antagonista recettoriale dell interleuchina-1 (IL-1ra) è una citochina della famiglia dell interleuchina- 1 (IL-1). Essa è capace di legare entrambi i tipi I e II del recettore di membrana per l IL-1 (IL-1R), ma non induce alcuna risposta intracellulare ed è pertanto considerata un antagonista recettoriale dell IL-1. L IL-1ra svolge quindi funzioni antiinfiammatorie. La competizione tra l IL-1 e l IL-1ra per l IL-1R provoca l inibizione degli effetti di entrambe l IL-1 e l IL-1 [Dinarello et al., 1996] Interleuchina 1 e interleuchina 1 Le citochine sono molecole proteiche prodotte da vari tipi di cellule e secrete nel mezzo circostante di solito in risposta ad uno stimolo, ed in grado di modificare il comportamento di altre cellule inducendo nuove attività come crescita, differenziamento e morte. La loro azione di solito è locale, ma talvolta hanno un effetto su tutto l'organismo. Le citochine possono quindi avere un effetto autocrino o paracrino. Alcune citochine possono invece agire in modo endocrino, modificando cioè il comportamento di cellule molto distanti dalla sede della loro produzione. Hanno normalmente una vita media di pochi minuti. Queste proteine possono essere distinte (basandosi sulla loro struttura) in varie famiglie: La famiglia delle ematopoietine, che include diversi fattori di crescita, tra cui l'eritropoietina, la famiglia dei TNF, la famiglia delle chemochine, la famiglia degli interferoni (che inducono le cellule a resistere a infezioni virali) e infine la famiglia delle linfochine o interleuchine che sono citochine prodotte prevalentemente dalle cellule del sistema immunitario. Queste piccole proteine agiscono legandosi a specifici recettori localizzati sulle membrane cellulari delle cellule bersaglio e ognuno di questi trasduce uno specifico segnale che alla fine porterà a modifiche in quelle stesse cellule. I recettori che interagiscono con le citochine sono definiti recettori per le citochine o recettori accoppiati a chinasi perchè il meccanismo di trasduzione del segnale prevede la mediazione di Chinasi [Dinarello et al., 2007]. 8

8 L interleuchina 1 (IL-1) è una citochina secreta da vari tipi di cellule del sistema immunitario tra cui macrofagi, monociti e cellule dendritiche, ma anche da fibroblasti e cellule endoteliali. Questa proteina viene prodotta tra l'altro in risposta a infezioni batteriche (la sua produzione viene stimolata soprattutto dall'lps, una endotossina dei batteri Gram negativi), alla presenza di TNF e dall'interazione delle cellule produttrici con linfociti T - CD4 positivi [Dinarello. 1996]. L IL-1 ha molteplici effetti a livello sia locale che generale nell'organismo, tra cui quello di favorire processi infiammatori in risposta ad infezioni batteriche quali vasodilatazione, crampi e febbre. Inoltre stimola la produzione di prostaglandine da parte di vari tipi di cellule (muscolari, epiteliali, ecc), la produzione di altre citochine quali IL-2 e l'attivazione e il reclutamento di altre cellule del sistema immunitario [Dinarello. 1996]. Queste attività sono caratteristiche di questa molecola che ha un ruolo fondamentale nella fase di attivazione della risposta infiammatoria acuta: infatti stimolando la vasodilatazione dei vasi sanguigni (per mezzo delle prostaglandine), favorisce la migrazione di cellule immunitarie quali macrofagi e linfociti verso il sito di infezione. Inoltre aumenta l'espressione di molecole di adesione nelle cellule dell'endotelio dei vasi sanguigni, favorendo l'ancoraggio dei leucociti alle pareti dei vasi stessi e la loro migrazione verso i tessuti. Un'altra capacità di questa citochina è quella di contribuire ad attivare linfociti T helper e alla maturazione e all'espansione clonale (moltiplicazione di linfociti B in grado di riconoscere lo stesso antigene) dei linfociti B. In caso di infezione sistemica, l'il-1 agisce in maniera simile al TNF-alfa, stimolando la produzione nel fegato delle cosiddette proteine di fase acuta [Dinarello. 1996]. Oltre a stimolare processi infiammatori, l'il-1 è in grado direttamente e autonomamente di stimolare la febbre anche in assenza di altri stimoli (antigeni batterici), ed è per questo conosciuto come un pirogeno endogeno. Questa citochina si lega a recettori presenti nelle cellule endoteliali dell'ipotalamo e sembra essere in grado di "resettare" il suo centro termoregolatore facendo aumentare la temperatura del corpo provocando febbre. In queste condizioni la replicazione batterica e virale diminuisce mentre la risposta immune diviene più efficiente. Esistono due forme biologiche ( e ) dell IL-1; sebbene tra le loro strutture proteiche l omologia di sequenza sia scarsa (solo 26%) e siano prodotte da geni distinti, mantengono una regione minima di omologia [Arend et al., 1990] che viene riconosciuta dal recettore per l IL-1. Entrambe le isoforme, infatti, possono svolgere gli stessi ruoli biologici e sono sintetizzate a partire da precursori (33 kda) che in seguito a processamento originano le forme attive (circa 17 kda). Si pensa che l isoforma venga prevalentemente destinata al legame sulla membrana plasmatica, mediando così gli effetti autocrini e paracrini dell IL-1. Si ritiene invece che l IL-1 sia secreta, e che potendo entrare in circolo, sia la causa degli effetti sistemici della citochina [Dinarello. 1996]. 9

9 Effetti dell IL-1 Il legame dell IL-1 con le cellule che esprimono il recettore è capace di indurre la sintesi di altre citochine, come l interleuchina-6, gli interferoni o le chemochine. A seconda del tipo di cellula bersaglio, avremo effetti diversi, ma tutti concorrenti ad attivare l infiammazione. Grazie all IL-1 vengono prodotte sostanze che stimolano le cellule immunocompetenti a proliferare e differenziarsi. Inoltre a livello vascolare l IL-1 provoca vasodilatazione e aumento dell adesività dell endotelio ai leucociti, e allo stesso tempo dà il via a meccanismi di riparazione e crescita cellulare (di cellule muscolari lisce e fibroblasti) [Arend et al., 1990]. A livello sistemico l IL-1 provoca febbre, sintesi di proteine della fase acuta, neutrofilia e linfopenia, aumento dell adesività dei leucociti alle pareti dei vasi. In conclusione, l IL-1 segnala all organismo l insorgenza di malattie, e quest ultimo mette in atto delle misure difensive a livello cellulare e sistemico con lo scopo ultimo di eliminare la malattia Regolazione dell IL-1 La sensibilità delle cellule alla stimolazione da parte dell IL-1 è molto alta: se una cellula presenta sulla sua superficie cinque recettori per questa citochina, si riesce a ottenere una risposta biologica completa anche con soltanto tre di questi recettori occupati dall agonista [Arend et al., 1990]. Ne consegue che la modulazione dell attività biologica dell IL-1 è di fondamentale importanza per regolarne gli effetti pro-infiammatori e di riparazione tissutale. Il nostro organismo ha messo in atto vari meccanismi per regolare il pathway dell IL-1: -Down-regolazione del recettore da parte della stessa IL-1; -Esistenza di un decoy receptor; -Possibilità di secernere il recettore in forma solubile; -Sintesi endogena di un antagonista recettoriale dell IL-1. Se questa stretta regolazione venisse a mancare si avrebbe un iperproduzione dell IL-1, che si tradurrebbe infine in disturbi tipici delle malattie infiammatorie croniche [Arend. 2000]. 10

10 IL-1 nel miocardio ischemico L esatto meccanismo con cui si esplica il rimodellamento cardiaco non è chiaro, ma è stato proposto che un ruolo importante sia svolto dalle citochine, in particolare TNF e IL-1. Queste molecole pro-infiammatorie non sono espresse costitutivamente nel miocardio, ma la loro espressione può essere indotta rapidamente e consistentemente in risposta a vari tipi di insulto [Kapadia et al., 1995] in tutti i tipi cellulari del cuore, inclusi i cardiomiociti stessi. Un espressione a breve termine dell IL-1 ha effetti benefici: l IL-1β induce NF-κB, il quale attiva la trascrizione di geni protettivi per il cardiomiocita, come MnSOD, Bcl2, c-iap1 [Kapadia et al., 1997]. Al contrario, le evidenze sperimentali hanno dimostrato che un espressione continuativa di IL-1 determina una diminuzione della contrattilità miocardica in vitro nonché un calo del cronotropismo in cardiomiociti isolati di ratti [Wakatsuki et al., 2004]. Inoltre si è osservato che l IL-1 induce la trascrizione di geni per la sintesi di proteine della matrice extracellulare (ECM) nei fibroblasti e per il rimaneggiamento della ECM neoformata (come le metalloproteinasi e le gelatinasi); si rende quindi responsabile della formazione di una cicatrice in un infarto. Inoltre si è osservato che l IL-1 induce l ipertrofia dei cardiomiociti in vivo, l IL-1 è quindi capace di mediare tutte le trasformazioni tissutali che avvengono nel rimodellamento cardiaco. Infine, è stato dimostrato che l iperproduzione di citochine infiammatorie nel miocardio è capace di attivare l apoptosi delle cellule [Wakatsuki et al., 2004] Recettore dell interleuchina-1 I recettori per l IL-1 (IL-1R) appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline e contengono tre domini Ig-like nella loro porzione extracellulare [Whisenand et al., 1995]. Ne esistono due tipi: l IL- 1RI, capace di trasmettere un segnale all interno della cellula bersaglio e un decoy receptor, IL-1RII, che non genera risposte intracellulari. In un secondo tempo è stata scoperta la proteina accessoria del recettore dell IL-1 (IL-1R AcP). Anch essa appartiene alla superfamiglia delle Ig e rappresenta la seconda subunità del complesso recettoriale [Greenfeder et al., 1995]. Quando l Il-1 lega la subunità principale del recettore di tipo I, vi provoca un cambiamento conformazionale che permette l interazione con la subunità accessoria; entrambi i domini citoplasmatici delle due subunità del complesso recettoriale sono indispensabili per 11

11 la trasduzione intracellulare del segnale, come dimostrato dall assenza di risposta all IL-1 in cellule che non esprimono IL-1R AcP [Arend et al., 1998]. Il pathway attivato dal legame dell IL-1 sul recettore consiste nell attivazione di una cascata di chinasi che porta alla fosforilazione e conseguente inattivazione di IB; avviene quindi la traslocazione nel nucleo del fattore di trascrizione (TF) NF-B. Questo è un tipico TF per geni della risposta immunitaria [Arend. et al., 1998]. La porzione extracellulare del recettore può essere processata proteoliticamente e liberata nell ambiente extracellulare (IL-1sRI e IL-1sRII). Queste forme solubili del recettore si trovano anche a livello sistemico. Tra i due, il recettore che lega più avidamente IL-1 è quello di tipo II [Arend et al., 2000]. Esso sequestra l IL-1 presente nel plasma e negli interstizi, per cui è un regolatore negativo in vivo dell attività proinfiammatoria dell IL Scoperta dell IL-1ra Già negli anni 1983/1984, prima del clonaggio dell IL-1, si sospettava l esistenza di un potenziale inibitore dell IL-1. Infatti, mentre si cercava di isolare grandi quantità di IL-1 usando il saggio biologico della stimolazione di collagenasi e prostaglandina nelle cellule della sinovia, l attenzione si rivolse anche a patologie associate alla presenza di grandi quantità di monociti - cioè alla leucemia monocitaria o a malattie associate a temperatura elevata o a patologie croniche debilitanti quali l AR e l artrite reumatoide giovanile. Con sorpresa non si rilevava attività biologica dell IL-1 nel siero o nell urina di pazienti gravemente affetti delle citate patologie. Si consideri che la ricerca dell IL-1 poteva avvalersi solo di un saggio biologico, poiché a quel tempo non si disponeva di saggi immunologici Questo indusse a ipotizzare che la presenza di IL-1 potesse essere mascherata da molecole inibitorie. La purificazione chimica condusse all isolamento di un fattore di circa 17 kda dall urina di pazienti con leucemia monocitaria. Questo fattore bloccava specificamente le attività biologiche dell IL-1, senza influire su quelle del TNF. Si trattava della prima identificazione dell antagonista endogeno del recettore dell IL-1. Nel 1985 W. Arend rilevò la presenza di un inibitore della risposta di condrociti e timociti all IL-1 in colture di monociti umani; il meccanismo d azione dell inibitore, tuttavia, non era noto. Nel 1987 si identificò attraverso esperimenti di legame recettoriale, il meccanismo d azione che giustificava la denominazione antagonista del recettore (IL- 1ra): IL-1ra naturale purificato interferiva con il legame di IL-1 ai linfociti. Lo stesso anno si fece la prima osservazione clinica della variazione dei livelli di IL-1ra in varie patologie: in pazienti con artrite reumatoide giovanile, elevati livelli di IL-1ra erano associati alla fase a febbrile e bassi livelli 12

12 alla fase febbrile della malattia. In seguito all osservazione che l IL-1ra naturale bloccava il legame di IL-1 alle cellule, l IL-1ra fu clonato presso Synergen nel 1990 [Dayer et al., 2004] Gene dell IL-1ra Il gene dell IL-1ra (IL1RN) mappa all interno del braccio lungo del cromosoma 2, tra le bande 14 e 21. È interessante notare che questo gene è situato a poche kb dai geni per le due isoforme di IL-1, nonché nello stesso braccio del cromosoma dove si trovano i geni per IL-1R [Arend et al., 1998] Polimorfismi del gene e malattie associate: Nel secondo introne di IL1RN è presente un polimorfismo dovuto a un diverso numero di ripetizioni possibili di una sequenza di 86 bp che genera cinque alleli. L allele A1 (IL1RN*1) con 4 ripetizioni in tandem di questa sequenza è il più comune ed è presente nel 73% della popolazione. L allele A2 (IL1RN*2)con due ripetizioni in tandem di questa sequenza è presente nella popolazione per il 21% ed è stato associato con una serie di malattie umane, tra le quali psoriasi e LES [Arend et al., 1998], disturbi tipicamente dovuti a disordini dell infiammazione e di origine epiteliale. Non si può escludere tuttavia che l associazione tra IL1RN e la malattia sia dovuto a linkage col locus malattia Isoforme dell IL-1ra Inizialmente fu identificata un isoforma secreta della proteina (sil-1ra) da 17 kda, che veniva prodotta con diversi gradi di glicosilazione (22-25 kda) per lo più da monociti, macrofagi, neutrofili, epatociti, cellule della microglia [Arend et al., 1991]. Successivamente fu descritta una seconda isoforma, non secreta bensì intracellulare (icil-1ra1) da 18 kda, generata per splicing alternativo su un sito accettore di splicing interno al primo esone, localizzato vicino al 3 della sequenza codificante per il peptide segnale della sil-1ra.[arend et al., 1993]. Poiché la forma intracellulare manca di questa sequenza di indirizzamento al RE, essa rimane nel citoplasma delle cellule e non viene glicosilata. Questa isoforma è stata individuata prevalentemente in cheratinociti e altre cellule epiteliali, e in misura minore in monociti e macrofagi. 13

13 Recentemente sono state caratterizzate altre due isoforme intracellulari da 25 e 16 kda [Arend, 2000]. Della prima (icil-1ra2) si è potuto finora analizzare soltanto la proteina ricombinante clonata a partire da cdna ottenuto da neutrofili, infatti la proteina non è tuttora stata rinvenuta in alcun tipo di cellule in vivo. Il cdna di quest isoforma presenta una sequenza da 63 bp inserita tra il primo e secondo esone di icil-1ra1. L isoforma da 16kDa (icil-1ra3) è una variante di splicing dell isoforma intracitoplasmatica 2 (icil- 1ra2). È stata rinvenuta prevalentemente in epatociti e neutrofili. Per quanto riguarda le caratteristiche di legame al recettore, le varie isoforme ricombinanti sono state poste in soluzione con IL-1R. Da questi esperimenti si evince che la prima isoforma intracellulare e quella solubile hanno pari affinità per il recettore, laddove icil-1ra3 lega cinque volte meno avidamente [Arend et al., 2000]. L esistenza di vari tipi di IL-1Ra suggerisce che questa citochina interpreti un ruolo piuttosto importante nella fisiologia dell organismo Funzioni biologiche dell IL-1ra IL-1ra è un inibitore naturale del recettore della IL-1 o più precisamente un antagonista, prodotto principalmente da leucociti sia costituzionalmente sia in corso di attivazione flogistica. Il gene che codifica per il IL-1ra viene prima trascritto in una singola catena di pre-mrna, che successivamente, può essere riarrangiata in più forme. Tali forme possono essere tradotte con o senza un peptide di secrezione (leader peptide). La forma di IL-1ra priva del leader peptide, rimane all interno della cellula e viene indicata come IL-1ra intracellulare. Al contrario, la forma associata al leader peptide rappresenta la forma di IL-1ra extracellulare. Comunque, tutte e due le forme di IL-1ra (intra ed extracellulare), rappresentano inibitori funzionali della IL-1, infatti pur legandone il recettore (IL-1RI), non determinano la trasduzione del segnale che normalmente avviene quando l IL-1 si lega al recettore di membrana (IL-1RI) sil-1ra La produzione di IL-1ra può essere indotta in vitro previa stimolazione delle cellule con varie sostanze implicate nel processo di flogosi: altre citochine (IL-4, IL-10), IgG aderenti, componenti batteriche (LPS) o virali; ciò indica che l IL-1ra potrebbe essere prontamente espressa in vivo in numerose malattie infiammatorie croniche nonché in malattie infettive. 14

14 Studi clinici hanno rilevato alti livelli di IL-1ra in sangue periferico di pazienti con sepsi, malattie reumatiche croniche e post-operati [Arend et al., 2000]. Studi su topi knock-out per il gene IL1RN hanno rivelato un fenotipo normale (a parte per le minori dimensioni degli animali mutati). Iniezioni intraperitoneali di LPS risultano però più letali nei topi mutati che nei wilde type; ciò dimostra che IL-1ra ha un effetto benefico nello shock settico in modelli animali. Inoltre, si è visto che i knock-out sviluppano infiammazione cronica della parete delle arterie. Infine, modelli animali di malattie infiammatorie croniche sono stati trattati con Ab neutralizzanti l IL-1ra; questi studi hanno dimostrato che la produzione endogena di IL-1ra è importante nel controbilanciare l infiammazione e il danno tissutale dovuti a un eccesso nella produzione di IL-1 [Arend et al., 2000]. Pertanto, i numerosi studi effettuati sull isoforma secreta dell IL-1ra indicano che la sua principale funzione è la regolazione negativa degli effetti proinfiammatori dell IL-1. Infatti, la forma secreta dell IL-1ra lega IL-1RI, ma inibisce la sua associazione con IL-1R AcP, bloccando in vivo l azione dell IL-1. È questo il motivo per cui IL-1ra è considerata una citochina antiinfiammatoria. L isoforma secreta può inoltre interagire con la forma solubile del recettore per l IL-1, la quale svolge un ruolo antiinfiammatorio. L IL-1sR di tipo II ha maggiore affinità per IL-1 piuttosto che per sil-1ra [Arend et al., 1998], per cui il recettore solubile sequestra l IL-1 e mantiene le sue proprietà antiinfiammatorie. Al contrario, l IL-1sRI ha maggiore affinità per l IL-1ra. Ciò implica che l IL-1 circolante non sarà captata dal recettore solubile e potrà trasmettere alla cellula bersaglio il suo segnale proinfiammatorio. Al contempo, sil-1ra sarà sequestrato da IL- 1sRI, e ne sarà così neutralizzata l azione antiinfiammatoria icil-1ra Gli studi sugli effetti biologici delle isoforme intracellulari sono poco approfonditi. Le isoforme intracellulari 1 e 2 legano IL-1RI con un affinità paragonabile a sil-1ra. Inoltre, studi su cheratinociti hanno dimostrato che queste cellule sono in grado di rilasciare nell ambiente esterno piccole quantità di icil-1ra1 [Clay et al., 1994]. Sarebbe lecito sostenere che le isoforme intracellulari esistano al solo scopo di svolgere la medesima funzione dell isoforma secreta, dal momento che quando una cellula muore il suo contenuto viene rilasciato nell ambiente extracellulare. L evoluzione ha però conservato ben tre forme diverse dell icil-1ra, tra le quali una l isoforma 3 lega con scarsa affinità l IL-1RI; 15

15 questo ci induce a pensare che esplichino il loro ruolo principale nel citoplasma delle cellule in cui sono prodotte [Arend et al., 2000]. Difatti è stato riscontrato che l icil-1ra1 riesce a bloccare l espressione di geni indotta dall IL- 1 direttamente dall interno della cellula. Attualmente non sono stati chiariti i meccanismi con cui l icil-1ra1 inibisce l azione dell IL-1, ma si pensa che essa possa influenzare la stabilità o la degradazione degli mrna indotti; recentemente è stato proposto da Arend et al. un modello secondo cui l icil-1ra1 inibisce la fosforilazione di alcune proteine intracellulari coinvolte nella trasmissione del segnale dato dall IL-1. Comunque è opinione diffusa che almeno le isoforme intracellulari 2 e 3 dell IL-1ra svolgano compiti aggiuntivi all interno delle cellule [Arend et al., 2000] IL-1ra nel cuore L IL-1 media l infiammazione acuta nel cuore in seguito a un danno da ischemia-riperfusione (I/R). Questo processo flogistico porta alla morte dei cardiomiociti per necrosi o apoptosi. Suzuki et al. trasfettarono dei cuori di ratto con vettori d espressione contenenti il gene IL-1RN; crearono così dei modelli animali in cui era iperespresso l IL-1ra. In questi ratti fu poi simulato un infarto mediante occlusione temporanea (30 minuti) di un arteria coronarica e successiva riperfusione di 24 ore. Il gruppo di Suzuki trovò che la zona dell infarto era sensibilmente ridimensionata nei cuori trasfettati rispetto ai cuori wilde type di controllo; con l iperespressione dell IL-1ra diminuiva inoltre l infiltrato infiammatorio nella zona ischemica; infine, l apoptosi dei cardiomiociti nei cuori trasfettati era ridotta rispetto al controllo [Suzuki et al., 2001]. IL-1ra quindi potrebbe proteggere il tessuto cardiaco agendo in due modi distinti. Primo attenuando la risposta flogistica in vivo competendo con l IL-1 e per il legame con l IL-1RI secondo inibendo l apoptosi dei cardiomiociti (meccanismo non noto) Forma commerciale dell IL-1ra Anakinra L IL-1ra ricombinante è stata immessa sul mercato con il nome commerciale Kineret (Anakinra), ed è stata sviluppata dalla ditta Amgen (Thousand Oaks, CA); è prodotta in E. Coli ed è analoga all isoforma secreta dell IL-1ra, ad eccezione dell'aggiunta di un solo residuo di metionina in posizione ammino-terminale, ma non è glicosilata. 16

16 Kineret (anakinra) viene ben assorbito in seguito a iniezione sottocutanea. La biodisponibilità assoluta del farmaco, in seguito all'iniezione sottocutanea di 70 mg in bolo in soggetti sani è pari al 95%. L'emivita varia da 4 a 6 ore. Kineret (anakinra) è indicato per il trattamento dei segni e dei sintomi dell'ar (Artrite Reumatoide)in associazione con metotrexato (MTX), nei pazienti con risposta inadeguata al solo MTX. Il trattamento con anakinra e metotrexato in associazione dimostra una riduzione statisticamente e clinicamente significativa dei segni e dei sintomi dell'ar in pazienti che hanno mostrato una risposta inadeguata al solo MTX. Inoltre, dopo 24 settimane di trattamento con Kineret (anakinra) in queste popolazioni di pazienti, sono stati osservati significativi miglioramenti del numero di articolazioni dolenti, dei livelli di mediatori della fase acuta e dei componenti di valutazione globale. 17

17 2. MIOCARDIO ISCHEMICO Il cuore è capace di adattare la capacità contrattile (essenzialmente cronotropismo e inotropismo) in funzione di variazioni nelle richieste metaboliche dell organismo. Se l aumento delle richieste è temporaneo, il cuore mette in atto una serie di meccanismi transienti come la legge di Frank-Starling o la stimolazione del ritmo cardiaco mediante rilascio di catecolamine. Se invece l aumento delle richieste è ripetitivo o cronico, il cuore va incontro ad una serie di modifiche che si definiscono complessivamente con il termine rimodellamento cardiaco [Wakatsuki et al., 2004] Rimodellamento cardiaco Il rimodellamento può essere provocato da svariate condizioni: negli adulti le cause più comuni derivano da cardiopatie ischemiche, dovute all ostruzione delle arterie coronariche (in genere a causa della malattia aterosclerotica). Fra le cause non ischemiche, le più frequenti sono l'affaticamento del cuore dovuto a ipertensione arteriosa sistemica o polmonare, aritmie, cardiopatie congenite, cardiomiopatie dilatative, valvulopatie (insufficienza o stenosi valvolare), miocarditi, uso di farmaci, stimoli sociali (abuso di alcol o droghe) [Swedberg K et al., 2005]. L organismo tenta di sopperire all insufficiente portata cardiaca mettendo in atto vari processi di adattamento. L'evento centrale del rimodellamento è l'ipertrofia dei cardiomiociti: il cuore è capace di implementare il numero di sarcomeri per cellula, aumentando così la massa miocardica contrattile [Braunwald et al., 2000] Stress meccanico L'ipertrofia miocardica nel rimodellamento è data dallo stress meccanico: il sovraccarico emodinamico (pressorio e volumetrico) del cuore provoca lo stiramento delle cellule e induce il loro accrescimento, la massa muscolare cardiaca incrementa, e di pari passo aumenta anche la forza esercitata dal cuore [Sadoshima et al., 1997] Stress biochimico Viene inoltre avviata una serie di attività neuroendocrine che comportano [Hammond et al., 1984]: 18

18 - l aumento della secrezione di catecolamine (adrenalina e noradrenalina) che svolgono una diretta stimolazione cronotropo- e inotropo-positiva sulle cellule del cuore, tentando così di aumentarne la contrattilità e quindi l'efficienza; - lo stiramento delle cellule dovuto al sovraccarico pressorio promuove la sintesi di angiotensina II da parte dei cardiomiociti stessi [Kajstura et al., 2001]; - produzione di endotelina; - la produzione di fattori di crescita (GH/STH) per i cardiomiociti; - sintesi di ossido nitrico (NO), che provoca vasodilatazione periferica e quindi diminuzione del pre-carico [Bolli et al.,1997]; - rilascio di istamina, che lega i recettori H1 nel cuore provocando tachicardia; - la produzione locale di citochine infiammatorie come TNF e IL-1 [Kapadia et al., 1995]. Tutti questi mediatori dello stress biochimico tentano di risolvere l insufficiente irrorazione degli organi, ma allo stesso tempo la stimolazione costante con questi mediatori biochimici contribuisce alla progressione dell insufficienza cardiaca. Inoltre, alcuni tra questi mediatori dello stress biochimico stimolano direttamente l ipertrofia dei cardiomiociti, come è stato ampiamente documentato nel caso dell angiotensina II [Wakatsuki et al., 2004] o dell IL-1. Nel contempo, è stato osservato che a lungo andare questi fattori protettivi possono avere effetti tossici e provocare l apoptosi dei cardiomiociti [Wakatsuki et al., 2004]. In ultima analisi, il rimodellamento cardiaco provoca l apoptosi dei cardiomiociti con dei meccanismi non noti indotti dallo stress biochimico. Inoltre, lo stesso aumento delle richieste metaboliche fa sì che i cardiomiociti subiscano un maggiore stress ossidativo, il quale può portare a danno mitocondriale e innesco della via intrinseca dell apoptosi. La morte programmata dei cardiomiociti non comporta perdita di funzione del tessuto poiché non interviene la fibrosi, ma è un processo comunque dannoso per il miocardio, in quanto può indurre assottigliamento della parete ventricolare e dilatazione delle camere. Queste modificazioni anatomiche provocano una sempre maggiore riduzione della forza di contrazione sviluppata dal cuore [Codd et al., 1989]. A lungo andare, il volume telediastolico cardiaco del ventricolo sinistro raggiunge valori elevati, cui il rimodellamento non è in grado di far fronte; inoltre, l apoptosi dei cardiomiociti contribuisce alla progressiva perdita di funzione del cuore. A questo punto sopraggiungono episodi acuti di insufficienza cardiaca, in cui il cuore non è capace di pompare sangue in misura sufficiente a soddisfare le esigenze dell organismo e di destinare agli organi vitali il giusto apporto di ossigeno [Searle et al., 1982]. 19

19 2.2.Ostruzione delle arterie coronariche: L occlusione di una coronarica blocca l afflusso di sangue all area di miocardio irrorata dal vaso ostruito. Una parte del muscolo cardiaco, quindi, non riceve l'adeguato apporto di ossigeno e ne risulta danneggiata. Se la mancata perfusione del tessuto è soltanto parziale, si instaura una situazione in cui il miocardio è sottoposto ad un ischemia cronica, e il cuore dispone il rimodellamento, che porterà in ultima analisi all apoptosi. Se invece l ischemia è completa ed è protratta per qualche decina di minuti, essa comporta la morte massiccia dei cardiomiociti e quindi la formazione di un infarto, un ampia zona necrotica all interno del tessuto ischemico. La presenza di detriti necrotici nel miocardio scatena una reazione infiammatoria con richiamo di macrofagi, attivazione dei fibroblasti e infine sostituzione del tessuto necrotico con una cicatrice: il tessuto infartuato non è più funzionale. L organo si trova in difficoltà sempre maggiori: la porzione di cuore che sopravvive deve sobbarcarsi anche il carico di lavoro della parte di miocardio persa durante l infarto. Ciò può causare scompenso cardiaco al momento dell infarto, ma anche un progressivo deterioramento e quindi scompenso del cuore a distanza di mesi o anni dall'evento ischemico. Bardales et al. hanno dimostrato che immediatamente dopo un evento ischemico ben l 80% dei cardiomiociti nella zona infartuata ha attivato il processo di morte cellulare programmata, mentre soltanto il 20% sta morendo per necrosi [Bardales et al., 1996]. Se l insulto ischemico si protrae nel tempo, la stragrande maggioranza delle cellule non possiede l energia necessaria per portare a termine l apoptosi; soltanto a questo punto subentra la necrosi. Trovare un metodo per inibire l apoptosi dei cardiomiociti nelle cardiopatie ischemiche o nella fasi precoci dell infarto potrebbe rivelarsi utile nella cura di queste patologie. 20

20 3. APOPTOSI La morte cellulare può verificarsi secondo due distinti processi: uno passivo e incontrollato la necrosi ed uno attivo e altamente regolato l apoptòsi. La morte cellulare programmata interviene sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Nel primo caso, la morte delle cellule è necessaria allo sviluppo embrionale di un organismo o al mantenimento dell omeostasi nell organismo adulto (controllo del numero di cellule e della misura degli organi/tessuti). In alcuni stati patologici, l apoptosi interviene come adattamento cellulare estremo: una cellula avverte di essere vicina alla morte e preferisce il suicidio alla morte passiva. Da questa scelta deriva un vantaggio considerevole; la cellula, infatti, non riversa nell ambiente il contenuto del suo citoplasma, a differenza di quanto avverrebbe nella necrosi, ed evita così l infiammazione del tessuto e il possibile danno che potrebbe interessare le cellule vicine. L apoptosi è caratterizzata da progressiva contrazione della cellula su se stessa, blebbing della membrana plasmatica, condensazione della cromatina, digestione del DNA in segmenti nucleosomici, e infine formazione dei corpi apoptotici. Questi ultimi verranno rapidamente fagocitati dalle cellule vicine [Bardales et al., 1996] Le caspasi Tutto ciò che succede nella cellula in seguito alla decisione di morte concorre all attivazione di alcuni membri della famiglia delle caspasi; le caspasi effettrici (caspasi 3, 6 e 7). Questi enzimi portano a compimento il pathway apoptotico mediante la digestione di svariate proteine endogene. Le caspasi sono delle cistein-proteasi che tagliano le loro proteine bersaglio dopo un residuo di acido aspartico. Substrati delle caspasi effettrici sono svariate proteine vitali per la cellula, come ad esempio componenti strutturali del citoscheletro (actina e lamine nucleari), inibitori delle deossiribonucleasi, altre proteine pro-apoptotiche nonché le caspasi stesse. La proteolisi di queste molecole genera i cambiamenti biochimici e morfologici tipici delle cellule apoptotiche che sono già stati trattati nel paragrafo precedente. Le caspasi vengono sintetizzate nelle cellule sotto forma di zimogeni, e vengono rese attive mediante processamento proteolitico da parte di altre caspasi (caspasi iniziatrici) solo in risposta a segnali ben precisi. Questi segnali possono essere raggruppati in due tipi, portando alla definizione di due distinte vie di attivazione dell apoptosi. 21