Università degli Studi di Roma Tre. Corso di Laurea in Scienze Biologiche NOR. Dispense delle lezioni di Laboratorio di Chimica Organica

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1 Università degli Studi di Roma Tre Corso di Laurea in Scienze iologiche NOR Dispense delle lezioni di Laboratorio di Chimica Organica I anno II semestre Prof. Giovanna Iucci.. 27/28 1

2 Tecniche di separazione e purificazione dei composti organici I composti organici, sia di origine naturale che prodotti in laboratorio mediante sintesi chimica, si trovano spesso miscelati ad altre sostanze dalle quali devono essere separati. Nel caso, ad esempio, di una sostanza naturale presente in una data matrice biologica, per ottenere il composto allo stato puro, è necessario estrarlo dalla matrice, separarlo e purificarlo dagli altri composti eventualmente presenti. Nel caso di un prodotto ottenuto tramite sintesi chimica, può essere necessario rimuovere il solvente, gli eventuali reagenti in eccesso, il catalizzatore e/o i possibili prodotti collaterali della reazione. I chimici hanno quindi messo a punto una serie di tecniche che consentono di separare un composto (solido o liquido) contenuto in una miscela dagli altri componenti; queste tecniche sfruttano le differenti proprietà chimico-fisiche dei componenti della miscela per separarli. La tabella seguente elenca le più comuni tecniche di separazione e purificazione dei composti organici in funzione dello stato di aggregazione delle sostanze da purificare e della proprietà chimico-fisica utilizzata per separarle dagli altri componenti della miscela. Tabella 1 Tecnica Stato di aggregazione proprietà chimico-fisica Distillazione Liquido Punto di ebollizione Sublimazione Solido Punto di fusione Cristallizzazione Solido Solubilità Estrazione con solventi Liquido/Solido Ripartizione tra fasi Cromatografia Liquido/Solido Ripartizione tra fasi Nelle prossime pagine analizzeremo in dettaglio le diverse tecniche di separazione e purificazione dei composti organici, il loro principio di funzionamento e le loro applicazioni. 2

3 Distillazione La distillazione è una tecnica che permette di separare i diversi componenti di una miscela liquida sfruttando il loro diverso punto di ebollizione; viene utilizzata, ad esempio, nella produzione di bevande alcoliche e nella separazione del petrolio greggio nei suoi componenti. Possono essere separati per distillazione composti liquidi aventi punto di ebollizione diverso. Per la legge di Raoult, il vapore in equilibrio con una miscela di liquidi è più ricco nel componente più volatile (avente punto di ebollizione più basso) rispetto alla miscela di partenza. Consideriamo una miscela liquida di due composti e, aventi diverso punto di ebollizione. La tensione di vapore dei due componenti nella miscela sarà: P = x P P = x P Dove: P, P = tensione di vapore di e nella miscela P, P = tensione di vapore di e allo stato puro x, x = frazione di e nella miscela La tensione di vapore totale della miscela (P) sarà: P = P + P = x P + x P P P =x P P=P +P P =x P P Se definiamo y, y = frazione molare di e nel vapore abbiamo che: P =P. y P =P. y risulta quindi: y y P = P x = x P P x x x =1 x = La composizione della fase vapore risulterà diversa da quella della fase liquida: il vapore sarà più ricco nel componente più volatile, avente cioè allo stato puro punto di ebollizione più basso e tensione di vapore più elevata; nel caso mostrato in figura, il componente. x = x =1 In un tipico apparato per la distillazione, la miscela liquida viene portata all ebollizione in un recipiente; la temperatura del distillato viene controllata tramite un termometro. I vapori, più ricchi nel componente più volatile, vengono condensati in un refrigerante e convogliati in un pallone di raccolta. Non sempre è possibile separare i componenti di una miscela mediante una singola distillazione semplice ma può essere necessario effettuare più distillazioni. 3

4 Sublimazione La sublimazione è il passaggio dallo stato solido direttamente a quello gassoso; questa transizione di fase ha luogo al di sotto di una data pressione, corrispondente al punto triplo del diagramma di fase. ostriamo a titolo di esempio il diagramma di fase della CO 2. La sublimazione può essere usata come metodo per separare un composto solido dalle impurità in esso contenute purché meno volatili del composto da purificare. La figura mostra un apparato per la sublimazione; esso consiste sostanzialmente in un tubo, all interno del quale viene posto il solido da purificare, munito di un refrigerante e collegato ad una sistema di pompaggio che permette di ridurre la pressione (pompa da vuoto). Il solido, riscaldato in condizioni di pressione ridotta, sublima; i suoi vapori, venendo a contatto con il refrigerante, si raffreddano e solidificano nuovamente sul refrigerante. In questo modo è possibile solido dalle impurità in esso contenute che risultino meno volatili. 4

5 Cristallizzazione La cristallizzazione è una metodica utilizzata per purificare ed isolare composti chimici, consistente in una solubilizzazione seguita da una precipitazione. E possibile purificare un composto per cristallizzazione, ad esempio, sciogliendolo a caldo in un solvente, facendolo successivamente precipitare per raffreddamento e filtrandolo. Per effettuare una cristallizzazione è necessario quindi individuare un solvente, detto solvente di cristallizzazione, nel quale il composto da purificare sia solubile a caldo e insolubile a freddo. In questo modo si può separare il composto puro dalle impurezze insolubili nel solvente a caldo e/o da quelle solubili a freddo. Se non è possibile trovare un unico solvente di cristallizzazione, si scioglie il composto da purificare in un solvente (1) in cui esso è solubile e successivamente si aggiunge un solvente (2) in cui è insolubile, ottenendo così la precipitazione; i due solventi (1) e (2) devono ovviamente essere miscibili tra loro. Durante la cristallizzazione, i composti disciolti in un solvente solidificano disponendosi secondo strutture cristalline ordinate, secondo un processo che implica una diminuzione di entropia. La formazione di una singola particella solida, detta il germe di cristallizzazione, costituisce il punto d'inizio del processo di cristallizzazione: tale singola entità funge da agglomerante catalizzando la formazione del solido per accrescimento successivo. pparato per la filtrazione 5

6 Estrazione mediante solventi L estrazione liquido-liquido è una metodica di laboratorio che utilizza il passaggio di un soluto da un solvente ad un altro solvente allo scopo di ottenere composti puri da fonti animali o vegetali o semplicemente per purificare sostanze impure. I due solventi utilizzati non devono essere miscibili fra di loro; generalmente uno dei due solventi è l acqua e l altro è un solvente organico, meno polare. Possono essere utilizzati sia solventi più densi e pesanti dell acqua (es. CH 2 Cl 2, CHCl 3, CCl 4 ) che solventi meno densi e quindi più leggeri dell acqua (etere di petrolio, acetato di etile, il benzene e l etere etilico). L apparecchio più semplice utilizzato per effettuare le estrazioni liquido-liquido è l imbuto separatore, mostrato in figura. Introduciamo nell imbuto separatore i due liquidi non miscibili, che costituiscono quindi due fasi distinte; supponiamo che la fase 1 contenga la sostanza da purificare (soluto) e fase 2 sia il solvente puro con il quale vogliamo estrarla. Se il soluto è solubile nella fase 2, alcune molecole di soluto passeranno spontaneamente dalla fase 1 alla fase 2, e la quantità totale di soluto tenderà a dividersi tra i due solventi (ripartizione tra fasi). gitiamo manualmente l imbuto per aumentare la superficie di contatto e quindi lo scambio di soluto tra le due fasi e raggiungere più velocemente un equilibrio tra la concentrazione del soluto () nella fase 1 nella fase Per questo equilibrio possiamo scrivere la costante termodinamica, detta coefficiente di ripartizione K, data dal rapporto tra le concentrazioni (moli/l) del soluto nei due solventi; più il coefficiente di ripartizione è elevato maggiore sarà l'accuratezza dell'estrazione. [] [] 2 K = = C 1 = concentrazione all equilibrio della sostanza nella fase 1 C 2 = concentrazione all equilibrio della sostanza nella fase 2 In questo modo è possibile separare la sostanza da purificare da altre sostanze presenti in soluzione e aventi una minor affinità per la fase 2, ovvero un valore inferiore di K. llo scopo di estrarre una maggior quantità di soluto può essere opportuno ripetere più volte l operazione; si può dimostrare matematicamente che si estrae più soluto dalla fase 1 alla fase 2 effettuando più estrazioni consecutive con piccole quantità di solvente (fase 2), piuttosto che con una sola estrazione utilizzando una maggior quantità di solvente. 1 C C 1 2 6

7 Cromatografia La cromatografia è un metodo per la separazione dei componenti di una miscela basato sulla ripartizione tra fasi. In una separazione cromatografia i composti contenuti in una miscela vengono separati in funzione della loro differente affinità per due fasi: - una fase fissa, o fase stazionaria, che può essere un solido o un liquido supportato su solido; - una fase mobile, liquida o gassosa, che viene fatta fluire in continuo sulla fase stazionaria. Dobbiamo l invenzione di questa tecnica al botanico russo Tswett che la usò per separare la clorofilla contenuta negli estratti vegetali. Pose la miscela da separare in cima ad una colonna riempita di una polvere di carbonato di calcio, attraverso la quale fece percolare etere di petrolio. ano a mano che l etere di petrolio scorreva lungo la colonna, Tswett osservò la formazione di bande colorate che si muovevano lungo la colonna con velocità diversa (la parola cromatografia deriva dal greco croma =colore), bande dovute ai diversi pigmenti contenuti negli estratti vegetali. Oggi la cromatografia può essere utilizzata, come vedremo, per separare sostanze sia colorate che incolori. In un tipico apparato per la cromatografia, mostrato in figura, la fase stazionaria (consistente in una polvere finemente suddivisa, per aumentare lo sviluppo superficiale) è contenuta all interno di un tubo sottile detto colonna cromatografica. La miscela da separare viene posta in cima alla colonna cromatografica e la fase mobile, detta anche eluente, viene fatta fluire in continuo attraverso la colonna, muovendosi attraverso gli interstizi della fase mobile e riempiendoli. La figura mostra la separazione di una miscela contenente tre diverse sostanze (bianca, nera, grigia) aventi diversa affinità per la fase stazionaria e per la fase mobile. miscela da separare fase stazionaria Flusso del solvente Fig.1 Fig. 2 tempo Le molecole dei vari componenti della miscela tenderanno a ripartirsi fra le due fasi (stazionaria S e mobile ) in funzione del loro diverso coefficiente di ripartizione K: S [] [] S K = = [C, C S = concentrazione di della fase mobile (), stazionaria (S)] Quando le molecole del componente si trovano nella fase mobile esse si muovono seguendo il flusso dell eluente; quando si trovano nella fase stazionaria rimangono ferme. Di conseguenza, tra i componenti della miscela da separare le sostanze che hanno una maggiore affinità per la fase mobile vengono eluite (trasportate dall eluente attraverso la colonna cromatografica) più rapidamente di quelle che hanno maggiore affinità per la fase stazionaria. C C S 7

8 Immaginiamo di porre all uscita della colonna un rivelatore che registra il passaggio di una sostanza eluita ed elabora i dati su di un cromatogramma. Un cromatogramma è un grafico che ha in ascissa il tempo (t) trascorso dall inizio della cromatografia ovvero il volume di eluente (V) corrispondente (supponendo un flusso costante, tempo trascorso e volume di eluente sono tra loro proporzionali) ed in ordinata il segnale del rivelatore, proporzionale alla concentrazione di soluto nella soluzione che fuoriesce dalla colonna. Ogni volta che una sostanza viene rivelata, il cromatogramma registra un picco più o meno alto a seconda della sua concentrazione (vedi figura). cromatogramma Si definisce tempo di ritenzione (t R ) il tempo necessario alla sostanza analizzata per essere eluita dall inizio all uscita della colonna. Il corrispondente volume di ritenzione (V R ) è volume di fase mobile necessario ad eluire l analita. Viene detto tempo morto (t ) il tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto dalla fase stazionaria e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile; è pari quindi al tempo che la fase mobile impiega per attraversare tutta la colonna. Il volume morto (V ) è il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto e corrisponde al volume di fase mobile contenuto all interno della colonna. Il tempo di ritenzione è dato dalla somma del tempo trascorso dalla sostanza analizzata nella fase stazionaria (t S ) e nella fase mobile (t ); poiché quando la sostanza si trova nella fase mobile si muove con alla stessa velocità della fase mobile, il tempo trascorso dalla sostanza analizzata nella fase mobile è pari al tempo morto (t ). Di conseguenza: t R =t +t S Si definisce infine rapporto di ritenzione R di una sostanza eluita il rapporto tra tempo morto ed il suo tempo di ritenzione: t t 1 R = = = t t R t + ts S 1+ t Se una sostanza ha, ad esempio rapporto di ritenzione R=,2, questo significa che essa, attraversano la colonna trascorre il 2% del suo tempo nella fase mobile e il restante 8% nella fase stazionaria. Il tempo trascorso dalla sostanza analizzata in ciascuna delle due fasi è proporzionale numero di moli di sostanza (n) che durante la cromatografia si trovano in quella fase, che possono essere calcolate facendo il prodotto fra la concentrazione della sostanza nella fase ed il volume della fase stessa (n=cv). Ne deriva quindi: ts csvs V 1 S = = K R = t cv V V S 1+ K V V, V S = volume della fase mobile (), stazionaria (S) 8

9 Il rapporto di ritenzione R risulta quindi tanto minore e il tempo di ritenzione t R tanto maggiore quanto più grande è il coefficiente di ripartizione K. Perché la cromatografia possa essere utilizzata efficacemente per separare due sostanze contenute in una miscela (risoluzione) bisogna che esse abbiano coefficiente di ripartizione e quindi rapporto di ritenzione abbastanza diverso da produrre nel cromatogramma due picchi aventi t R molto differente (selettività), che risultino perciò separati tra loro. Per ottenere una buona selettività è necessario soprattutto scegliere opportunamente la fase mobile e la fase stazionaria in modo da ottenere valori di t R molto diversi per le sostanze da separare. vere una buona selettività non è però sufficiente perché, anche se i picchi sono ben distanziati, possono essere tanto larghi da sovrapporsi; è necessario quindi che la separazione cromatografica presenti anche una buona efficienza, ovvero che i picchi nel cromatogramma risultino stretti. Risoluzione scarsa uona risoluzione dovuta a buona selettività uona risoluzione dovuta a buona efficienza L allargamento dei picchi cromato grafici dipende dal fatto che le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna tutte con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. I fattori che possono influenzare l efficienza di una colonna cromatografica sono molteplici. Uno dei fattori che maggiormente contribuisce all allargamento dei picchi è la possibile esistenza di percorsi multipli per le molecole che si muovono attraverso la fase stazionaria, come mostrato in figura. Per ovviare a questo inconveniente è necessario procedere ad un impaccamento della colonna cromatografica, facendo in modo che la fase stazionaria si disponga nel modo più compatto e omogeneo possibile. Un altro fattore che contribuisce all allargamento dei picchi cromatografici è la diffusione longitudinale (in direzione perpendicolare al flusso del solvente) della sostanza da analizzare. 9

10 La cromatografia può essere usata sia a scopo preparativo, per separare e purificare i componenti di una miscela, che come tecnica analitica, per determinare la composizione di un campione; la cromatografia analitica consente di effettuare un analisi sia qualitativa che quantitativa di una miscela. Esistono vari tipi di tecniche cromatografiche, generalmente classificate in funzione della natura delle fasi stazionaria e mobile e del meccanismo di distribuzione. La seguente tabella ne riassume alcune. Tecnica fase meccanismo stazionaria mobile di distribuzione Liquida solido liquido adsorbimento liquido liquido ripartizione HPLC solido liquido adsorbimento (high performance liquido liquido ripartizione liquid chromatography) Gascromatografia solido gas adsorbimento liquido gas ripartizione TLC (Strato sottile) solido liquido adsorbimento Carta liquido liquido ripartizione Scambio Ionico solido liquido scambio ionico GPC (gel permeation solido liquido esclusione chromatography) dimensionale Le varie tecniche possono essere classificate in base alla natura della fase mobile (liquida o gassosa) e della fase stazionaria (solida o liquida); la cromatografia liquida si suddivide in cromatografia liquida classica (utilizzata a scopo preparativo) e cromatografia liquida ad alta pressione o HPLC, che può essere sia preparativa che, soprattutto, analitica. Un altro parametro importante è il tipo di supporto usato per contenere la fase stazionaria: colonna o strato sottile (TLC, cromatografia su carta). Infine vi è un'ulteriore suddivisione basata sul meccanismo di separazione: si distinguono infatti la cromatografia di adsorbimento, di ripartizione, di scambio ionico, e di esclusione dimensionale (vedi pagina seguente). 1

11 dsorbimento: la fase stazionaria è un solido. Le sostanze vengono separate in base alla loro differente tendenza ad adsorbirsi sulla fase stazionaria (solida) o a rimanere disciolte nella fase mobile (generalmente liquida o gassosa). Ripartizione: la fase stazionaria è un liquido. Le sostanze vengono separate in base alla tendenza a ripartirsi tra le due fasi. Scambio ionico: la fase stazionaria è una resina scambiatrice di ioni. Questa tecnica serve per separare molecole cariche. Esclusione dimensionale: la fase stazionaria è un gel poroso. Le sostanze vengono separate in base alle loro dimensioni. E una tecnica usata per separare polimeri o macromolecole biologiche. ndiamo ora ad analizzare le varie tecniche cromatografiche. 11

12 Cromatografia su colonna Si tratta di una tecnica impiegata a scopo esclusivamente preparativo. Si riempie una colonna di vetro con il materiale che funge da fase stazionaria, generalmente un solido (cromatografia di adsorbimento) o, più raramente, un liquido supportato su solido (cromatografia di ripartizione). Per realizzare un buon impiccamento della colonna, il riempimento viene effettuato disperdendo la fase stazionaria nella fase mobile, creando una sospensione che viene inserita nella colonna e lasciando stratificare lentamente la fase stazionaria. Si pone la miscela da separare in cima alla colonna e si fa fluire lungo la colonna la fase mobile (eluente) che, sotto l influenza della gravità, scende trasportando con sé i componenti della miscela. I vari componenti si separano gli uni dagli altri muovendosi a velocità diverse lungo la colonna in funzione della loro differente affinità per la fase stazionaria e la fase mobile. Nel corso dell intero processo di separazione cromatografia, l eluente in uscita viene raccolto in diverse frazioni ed ogni frazione viene analizzata alla ricerca di componenti disciolte mediante, ad esempio, cromatografia analitica (vedi in seguito) oppure analisi spettroscopica. miscela da separare fase stazionaria fase mobile fase stazionaria frazioni Le fasi stazionarie più frequentemente utilizzate nella cromatografia su colonna sono fasi solide polari quali il gel di silice (SiO 2 ) o l allumina (l 2 O 3 ). La fase stazionaria deve essere una polvere finemente suddivisa o un gel, per avere un elevato sviluppo superficiale, poiché il processo di adsorbimento ha luogo sulla superficie del materiale. La fase mobile è un solvente o una miscela di solventi; le fasi mobili vengono classificate in funzione della loro polarità (serie eluotropica). p o l a r i t à idrocarburi alifatici olefine idrocarburi aromatici alogenuri solfuri eteri nitrocomposti esteri, aldeidi e chetoni ammine solfoni solfossidi ammidi ac. carbossilici acqua Influenza della fase mobile: I solventi possono essere distinti a seconda della loro polarità (serie eluotropica). Le sostanze polari avranno maggiore affinità per i solventi più polari, le apolari per i non polari. 12

13 HPLC La cromatografia liquida ad alta prestazione, in inglese High Performance Liquid Cromatography o HPLC, costituisce un evoluzione della classica cromatografia su colonna che permette di ottenere un notevole miglioramento della risoluzione della separazione cromatografica. L HPLC può essere utilizzata come tecnica sia preparativa che analitica per effettuare analisi sia qualitative che quantitative. L aumento dell efficienza della separazione cromatografica è dovuto alle dimensioni estremamente ridotte delle particelle che costituiscono la fase stazionaria (diametro da 3 a 1 µm), permettendo così un migliore impiccamento, ed al diametro sottile della colonna cromatografica, in modo da ridurre la diffusione longitudinale. Per mantenere una ragionevole velocità di flusso dell eluente attraverso la colonna, e quindi un tempo di analisi ragionevole, è necessario applicare elevate pressioni, dell'ordine delle centinaia di atmosfere. cromatografia su colonna HPLC La figura che segue mostra lo schema di un cromatografo HPLC manometro campione serbatoio solvente dati pompa filtro iniettore colonna rivelatore elaboratore flusso dell'eluente L eluente, contenuto in un serbatoio, viene prelevato tramite la pompa, filtrato e sospinto ad alta pressione attraverso la colonna; la pressione viene misurata da un manometro. Il campione da analizzare viene miscelato con l eluente prima di entrare nella colonna tramite un dispositivo detto iniettore. lla fine della colonna è applicato un rivelatore (indice di rifrazione, UV-VIS) che analizza in continuo l eluente che fuoriesce uscita della colonna ed un elaboratore che, elaborando il segnale ricevuto dal rivelatore, traccia il cromatogramma che consente di identificare e quantificare le sostanze iniettate. NH 2 NO 2 NH 2 NO 2 NH 2 Il cromatogramma si presenta come una sequenza di picchi di varia ampiezza ed altezza distribuiti lungo l'asse del tempo. Dal tempo di ritenzione di ogni picco (a parità di condizioni di analisi) è possibile dedurre l'identità del composto eluito; dall'area dei picchi è possibile dedurre la concentrazione delle sostanze eluite. NO 2 t R 13

14 Cromatografia a scambio ionico Nella cromatografia a scambio ionico la fase stazionaria è costituita da una resina scambiatrice, ovvero un materiale polimerico, insolubile in acqua e nei comuni solventi organici, che presenta gruppi funzionali carichi, in grado di interagire con gli ioni presenti nella soluzione. Le resine scambiatrici possono essere divise in due categorie: - resine scambiatrici anioniche, che possiedono gruppi carichi positivamente e sono quindi in grado di interagire con gli ioni negativi. R + Y - + X - R + X - + Y - - resine scambiatrici cationiche, che possiedono gruppi carichi negativamente e sono quindi in grado di interagire con gli ioni positivi. R - Y + + X + R - X + + Y + La cromatografia a scambio ionico trova applicazione nella separazione delle miscele ioniche ed, in particolare, dei composti organici e biologici aventi gruppi acidi o basici, quali, ad esempio, gli aminoacidi. La carica netta di questi composti dipende dal loro pka e dal ph della soluzione in cui sono disciolti; operando in opportune condizioni di ph è possibile separare tra loro gli aminoacidi aventi diverso pka, e quindi diversa carica netta. 14

15 GPC La cromatografia di permeazione sul gel (Gel Permeation Chromatography, GPC), detta anche cromatografia di esclusione dimensionale, è una tecnica cromatografica nella quale le molecole del campione analizzato vengono separate in base alle loro differenti dimensioni o, in termini tecnici, al loro volume idrodinamico. Questa tecnica viene solitamente applicata alle macromolecole, quali i polimeri biologici (ad es. proteine) o sintetici. Nella GPC la fase stazionaria è costituita da un gel di polimero poroso, avente pori di dimensioni diverse. Quando l eluente fluisce attraverso la colonna, le molecole più piccole possono enetrare in tutti nei pori della fase stazionaria, mentre quelle più grandi ne sono escluse. Più grande è la molecola, minore è il numero di pori in cui essa può entrare e quindi minore il percorso che compie attraverso la colonna e più rapida la sua eluizione. Più una molecola è piccola, maggiore il numero di pori in cui entra, più lungo il percorso che compie e maggiore il suo tempo di eluizione. 15

16 Cromatografia su strato sottile (TLC) e su carta La cromatografia su strato sottile (Thin Layer Chromatography TLC) è una tecnica cromatografica di semplice e rapido impiego, utilizzata principalmente come metodologia analitica, per effettuare rapidi test di laboratorio, controllando ad. es. lo svolgimento di una reazione o l efficacia di una separazione. In questa tecnica, la fase stazionaria (gel di silice, allumina, cellulosa) è depositata su una lastrina di vetro sotto forma di strato sottile (circa 1 mm). Nel caso della cromatografia su carta, la fase stazionaria è l acqua adsorbita sulla carta. La TLC è quindi una cromatografia di adsorbimento (solido/liquido) mentre quella su carta è una cromatografia di ripartizione (liquido/liquido). La miscela da separare viene depositata alla base della lastrina, sufficientemente lontano dal bordo, e la lastrina viene successivamente inserita verticalmente in un recipiente che contiene uno strato di eluente alto circa 1 cm; il recipiente viene quindi chiuso per mantenere l'ambiente saturo di vapori di solvente (vedi figura). L eluente tende a salire lungo la lastrina per capillarità, trasportando con sé i vari componenti della miscela e separandoli tra loro in funzione della loro diversa affinità per la fase mobile e la fase stazionaria; prima che il recipiente raggiunga la sommità della lastrina, si pone fine alla separazione estraendo la lastrina del recipiente e lasciando evaporare l eluente. Se le sostanze contenute nel campione sono colorate, a separazione avvenuta è possibile osservarle sulla lastrina come macchie presenti a distanza diversa dalla base. Per l analisi di sostanze incolori, si ricorre all'osservazione sotto luce ultravioletta; in questo caso, la separazione viene effettuata su lastre impregnate di una sostanza fluorescente. Quando la lastrina viene esposta alla radiazione UV, qualsiasi sostanza presente attenuerà la fluorescenza e sarà evidenziata da aloni più scuri. In alternativa si può ricorrere alla reazione con reagenti che sviluppano composti colorati, quali lo iodio e la ninidrina, usata per rivelare gli amminoacidi, evidenziandoli con colori diversi. Per riconoscere con certezza le diverse componenti, a fianco della miscela da separare si possono depositare sulla lastra sostanze note di cui si sospetta l esistenza nella miscela e che servono da riferimento. 16

17 Gascromatografia La gascromatografia (gas-cromatography, GC) è una tecnica usata esclusivamente a scopo analitico che utilizza come fase mobile un gas e può quindi essere utilizzata per analizzare sostanze gassose, ma anche liquide o solide, purché volatili nell intervallo -5 C. Nella GC non vi sono interazioni significative tra le molecole della miscela da analizzare e la fase mobile, essendo questa un gas; i componenti della miscela vengono separati soprattutto in funzione della loro differente volatilità (più un componente è volatile minore sarà il suo tempo di ritenzione) ed, in secondo luogo, in funzione della loro differente affinità per la fase stazionaria (più un componente è affine alla fase stazionaria maggiore sarà il suo tempo di ritenzione). La GC può essere utilizzata per analizzare sostanze gassose, ma anche liquide o solide, purché volatili nell intervallo -5 C. La fase stazionaria utilizzata può essere un solido (cromatografia di adsorbimento) e in tal caso si parla di GSC (gas-solid chromatography) oppure un liquido supportato su di un solido (cromatografia di ripartizione) e in tal caso si parla di GLC (gas-liquid chromatography); può riempire tutto l interno della colonna (colonna impaccata) oppure può essere distribuita come film sottile (circa 1 µm) sulle pareti interne di una colonna estremamente lunga (1 m o più) ed avente un diametro interno inferiore al millimetro (colonna capillare). La fase mobile è un gas inerte (N 2, He, r), detto gas vettore o carrier. In un tipico apparato per la gascromatografia il campione viene immesso tramite l iniettore in testa alla colonna e trasportato attraverso la colonna dal gas vettore. La colonna è inserita in un termostato detto forno che permette di scegliere la temperatura più idonea per una data analisi cromatografica. La scelta della temperatura è molto importante perché al variare della temperatura varia la volatilità dei composti analizzati e quindi variano i loro tempi di ritenzione. Una separazione cromatografica può essere effettuata tenendo la temperatura costante (isoterma) o variandola secondo il gradiente più opportuno. In fondo alla colonna è posto un rivelatore, per monitorare l uscita dalla colonna delle sostanze eluite; il segnale prodotto dal rivelatore viene inviato ad un elaboratore che registra il cromatogramma. 17