Lavoro di maturità in biologia Anno 2011 / 2012 Katia Pini Prof. Davide Speziga Liceo cantonale Bellinzona

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1 Lavoro di maturità in biologia Anno 2011 / 2012 Katia Pini Prof. Davide Speziga Liceo cantonale Bellinzona

2 Ringraziamenti In questa parte vorrei ringraziare tutti coloro che mi hanno aiutato durante il mio lavoro di ricerca: - Istituto Cantonale di Microbiologia e i suoi collaboratori, dove ho svolto la parte pratica e per la disponibilità dei collaboratori nel fornirmi informazioni importanti; - Dr. Orlando Petrini per la sua disponibilità e per avermi permesso di svolgere il mio lavoro pratico; - Dr. Paola Decristophoris, la quale si è messa a disposizione per aiutarmi durante e dopo lo svolgimento del lavoro pratico; - Prof. Davide Speziga, per avermi seguito durante tutto l anno nello svolgimento del lavoro e per i consigli utili fornitemi; - Ospedale san Giovanni di Bellinzona, per la disponibilità nel concedermi il permesso di raccolta del campione d acqua analizzato; - Consorzio Depurazione Acque di Giubiasco, per avermi fornito il campione d acqua analizzato nella parte sperimentale del lavoro. 1

3 Sommario 1. Introduzione Parte teorica Batteri Storia Descrizione dei batteri Parete batterica Colonie batteriche Identificazione delle cellule batteriche Antibiotici Storia Descrizione degli antibiotici Come agiscono gli antibiotici Resistenza Storia Descrizione del fenomeno di resistenza batterica Tipi di resistenza Come si sviluppa la resistenza Antibiogrammi o test Kirby-Bauer Interrogativi di ricerca Ipotesi Parte sperimentale Metodologia e Metodi Campionamento delle acque Preparazione piastre selettive Verifica piastre Verifica quantità di acqua e filtrazione dei campioni d acqua Isolamento e congelamento dei batteri isolati Identificazione delle cellule batteriche Tramite analisi proteomica: MALDI-TOF MS Analisi genetica: PCR e sequenza parziale del gene 16S Antibiogrammi Preparazione piastre per MH Test antibiogramma Lettura dell antibiogramma Risultati Elaborazione risultati Discussione Discussione Discussione Grado di resistenza Multiresistenza Discussione Conclusioni Bibliografia Webbliografia

4 1. Introduzione Fin dall inizio della sua esistenza l uomo è stato in costante contatto con i batteri, poiché questi, come dirò in seguito, sono dotati di una capacità di sopravvivenza piuttosto elevata e per questo motivo sono in grado di colonizzare qualunque tipo di ecosistema. Tuttavia questa relazione può da un lato risultare essere nociva per l uomo a causa di alcuni batteri detti patogeni, organismi che possono provocare malattie rilasciando sostanze dannose per l organismo ospite; dall altro può rivelarsi utile ad esso soprattutto quando si sfruttano le capacità metaboliche dei batteri 1 (es. in campo alimentare, come lieviti). Un esempio a riguardo è l impiego dei batteri nell industria medico-farmaceutica 1, la quale grazie a questi organismi poté dare inizio a una nuova era della terapia, scoprendo e utilizzando sostanze antibiotiche prodotte da questi. È proprio in questo ambito che ha origine il problema su cui si sviluppa il mio lavoro. Più precisamente riguarda il fenomeno, in costante aumento, della resistenza batterica agli antibiotici. In sostanza il problema si presenta quando un antibiotico non è più in grado di combattere efficacemente una malattia umana, vegetale o animale che sia, provocata da un determinato batterio patogeno; più preoccupante però, è l aumento dei casi in cui anche l azione di altri antibiotici diventa inefficiente nella cura di una stessa malattia. A questo proposito si sono ipotizzate varie teorie per capire quali potessero essere le cause per una resistenza batterica agli antibiotici. Una di queste prevale in maggior misura sulle altre teorie, riscontrando l origine del problema nell uso improprio ed eccessivo di questi farmaci antibiotici 2 in campo umano zootecnico e nella conservazione di alimenti 3. Partendo quindi dalla tesi odierna per cui i batteri più resistenti agli antibiotici sono quelli che sono esposti a tali sostanze, mi chiedo se il fenomeno della resistenza, in quattro campioni diversi di acqua provenienti da luoghi diversi (rubinetto di casa, fiume Ticino, entrata al depuratore e acque fognarie dell ospedale San Giovanni) sia maggiormente riscontrabile nei luoghi in cui si suppone ci sia un maggior uso di sostanze antibiotiche. A tal fine ho strutturato il mio lavoro di maturità per mezzo di un obiettivo principale e in due obiettivi secondari, favorevoli a convalidare ulteriormente la mia tesi. Mediante la parte pratica svolta in laboratorio si è determinato quale campione di acqua presenta maggiormente il fenomeno di resistenza batterica verificando con le piastre selettive contenenti nutrimento e antibiotico e quelle per le resistenze batteriche di tipo ESBL (germi produttori di beta- lattamasi a spettro esteso), MRSA (Stafilococco aureus meticillino resistente) e VRE (Enterococchi vancomicina resistenti). Successivamente, si è individuato il grado di resistenza dei singoli batteri isolati, determinando se il batterio è resistente a più di un antibiotico; infine si è determinato se due batteri della stessa specie ma isolati da acque differenti abbiano o meno lo stesso grado di resistenza, in modo da verificare se sia o meno la presenza di antibiotici nell ambiente influisce sul fenomeno sopra descritto. 3

5 2. Parte teorica 2.1 Batteri Storia Per parlare seriamente dell origine e dell evoluzione della vita sul nostro pianeta è necessario partire dai cosiddetti microbi, i quali hanno dominato la Terra per circa l 80% della storia della vita, ossia per i primi 2 miliardi di anni 4. Pur non sapendo dove essa abbia avuto inizio, si è in grado di sapere che furono questi microorganismi le prime forme comparse e in seguito proliferate: avendo avuto a disposizione un tempo assai lungo per evolversi e sviluppare funzioni metaboliche di base, hanno potuto colonizzare ambienti tuttora ritenuti invivibili per l uomo (es. Tundra gelida). Benché le testimonianze di fossili microbici siano alquanto scarse, sono ad ogni modo sufficienti a rivelare che questi organismi, oltre ad essersi diversificati, hanno sviluppato ampie varietà di forme, specie e comportamenti. Alcuni microbi sono le sole forme di vita dotate di autosufficienza, in altre parole solo essi possono essere in grado di sopravvivere indefinitamente in assenza di altre forme viventi. Tuttavia fu solo con il progresso tecnologico ed il miglioramento di nuove invenzioni che si poté constatare l esistenza di questi piccoli organismi; ciò avvenne effettivamente alla fine del XVII secolo, quando Anthonie van Leeuwenhoek6 (Delft, 1632 Delft, 1723), riuscendo a perfezionare i microscopi presenti all epoca, poté scoprire l esistenza dei procarioti Descrizione dei batteri I batteri sono microrganismi unicellulari procarioti (dal greco nucleo primitivo ), ovvero cellule molto piccole con una struttura interna più semplice rispetto a quelle eucariote (dal greco nucleo ben fatto ) e caratterizzano uno dei 5 regni animali 5. Ciononostante non tutte le cellule procariote sono classificate come batteri: un esempio sono le alghe. Innanzitutto, le dimensioni di queste cellule sono comprese tra 0.2 e 10 µm, e il volume medio di un batterio è di circa 1µm 3 che equivale a 1/1000 di quello di una cellula umana 1 ; per questo motivo l unità di misura convenzionale è il micrometro (µm). La struttura morfologica della cellula batterica è relativamente complessa. Generalmente è infatti rivestita da una parete cellulare rigida, la cui funzione è il filtraggio delle sostanze nutritive come pure la resistenza osmotica 6 ; essa è esterna alla membrana cellulare e conferisce ai diversi tipi di batteri forme caratteristiche: più comunemente si trovano a bastoncelli, bacilli, a sfera detti cocchi e a spirale ossia gli spirilli. I batteri vengono comunemente classificati secondo la colorazione di Gram, in positivi o negativi, a seconda della costituzione della parete 3. Nello strato successivo si trova una membrana cellulare, nella quale sono presenti la maggior parte degli enzimi che permettono le varie reazioni metaboliche6. Il materiale genetico dei batteri è formato da un unico cromosoma avvolto su se stesso e contenuto in una singola molecola di DNA5. Ciò nonostante il filamento di DNA non è separato dal citoplasma. La morfologia batterica varia anche esternamente: alcuni batteri possono essere ricoperti da numerose protuberanze chiamate pili, costituiti da proteine che permettono al batterio di 4

6 attaccarsi ad altre cellule. I pili possono avere scopi diversi: infatti per alcuni batteri infettivi servono ad attaccarsi alle membrane cellulari dell organismo ospite, facilitando così la trasmissione dell infezione; altri particolari batteri producono speciali pili sessuali, che utilizzano per lo scambio di materiale genetico, quando si riproducono. Infine i batteri possono possedere un flagello, un apparato che permette loro di spostarsi. La piccola dimensione ha attribuito loro una serie di importanti caratteristiche che si ritrovano raramente nelle cellule animali o vegetali 1. Una delle caratteristiche fondamentali di questi organismi è senz altro la grande facilità ad interagire con l ambiente esterno, fortemente accentuata dalla loro velocità di adattamento; questa particolarità risulta essere molto importante, che si può riscontrare anche nelle cellule umane ma non nella stessa misura. Se si considera, infatti, la flessibilità metabolica- fisiologica dei due tipi di cellule, si potrà notare come quella procariote sia decisamente più organizzata ed efficiente di quella eucariota. Un esempio riguarda la dotazione di enzimi: le cellule delle piante superiori e degli animali sono relativamente rigide, il loro cambiamento è determinato dallo sviluppo del singolo individuo ma complessivamente queste sono variazioni minime; nella cellula batterica i meccanismi di regolazione, al contrario, giocano un ruolo notevolmente maggiore, siccome non hanno la possibilità di immagazzinare le sostanze. Sono perciò in grado di produrre molecole proteiche specifiche al momento in cui queste gli sono necessarie. La loro dimensione riveste pure un significato ecologico alquanto rilevante 1, poiché avendo dei valori relativamente piccoli per quanto riguarda il peso essi possono essere trasportati facilmente da correnti d aria in tutto il pianeta 6. A determinare la loro proliferazione in luoghi diversi è l ambiente, che può essere favorevole o meno alle varie specie Parete batterica È importante conoscere la struttura della parete cellulare dei batteri, poiché gli antibiotici agiscono in modi differenti sui costituenti o sui processi di sintesi della parete 7. Di seguito ho descritto i tipi di batteri Gram, in quanto è un metodo di classificazione batterica che si basa sulle differenze della parete cellulare dei batteri. Gram + I Gram positivi possiedono una parete cellulare spessa che protegge la membrana dall elevata pressione interna 4. Essa è composta principalmente da un polimero di zuccheri chiamato peptidoglicano, un polimero complesso sintetizzato inizialmente nel citoplasma e formato da amminoacidi, il cui agglomerato, nella cellula batterica, è detto mureina; questa oltre a proteggere ha la funzione di mantenere la struttura rigida della cellula. Tuttavia questa molecola rappresenta un valido bersaglio per gli antibiotici 7, i quali ne inibiscono la sintesi. In generale la struttura della mureina è uguale per tutte le specie batteriche, ma differisce per alcune caratteristiche chimiche. Essa racchiude l intero organismo in una sacca detta sacculo ed è in base a questa conformazione che si determina l aspetto della cellula: bacillo, spirillo, e cocco 4. 5

7 Figura 1: preparato microscopico dopo il saggio di Gram. Si possono vedere batteri Gram positivi. Tratto da: ( ). Gram Al contrario dei Gram-positivi, i Gram negativi non hanno adottato la soluzione di una spessa parete di mureina. Essi si compongono solo di uno strato sottile di quest ultima circondato però a sua volta da una singolare membrana cellulare doppia, una esterna alla parete cellulare, più sottile e, una all interno. Questa membrana è profondamente diversa nella sua composizione chimica da tutte le altre membrane biologiche e possiede una notevole capacità di resistenza ad una serie di composti chimici dannosi 4. È questa struttura esterna stratificata, tipica delle cellule procariote e composta da lipopolisaccaridi o LPS 4 rigidi collegati tra loro da porine (proteine che attraversano lo spazio periplasmatico compreso tra la membrana esterna e interna), che si attribuisce la loro capacità immunogena, in quanto rende la cellula batterica impermeabile a molte sostanze come antibiotici o disinfettanti 7. Lo strato invece, più interno è composto da fosfolipidi, una sostanza che al contrario della precedente, compone la membrana cellulare sia dei batteri che degli eucarioti. I Gram negativi si riscontrano comunemente nella flora intestinale umana 7. Figura 2: preparato microscopico dopo il saggio dei Gram. Si possono vedere batteri Gram positivi. Tratto da: ( ). 6

8 2.1.4 Colonie batteriche Per compensare al meglio la loro vulnerabilità dovuta alla minuscola grandezza, questi organismi sono soliti ad aggregarsi in un unico tipo, oppure vivono in comunità unitamente a microbi di specie diverse 4 ; questi accumuli di cellule sono spesso visibili a occhio nudo e prendono il nome di colonie. Le colonie si presentano in forme differenti secondo le caratteristiche intrinseche del batterio 6 (es. morfologia, pigmentazione, produzione di biofilm o di materiale extracellulare, ecc.) Identificazione delle cellule batteriche In ogni organismo vivente è presente una molecola contenente il materiale genetico, sul quale è fissato tutta una serie di informazioni necessarie al coordinamento delle varie funzioni metaboliche della cellula. Questa molecola di DNA, o acido desossiribonucleico, è un polimero di nucleotidi che come detto, nelle cellule procarioti non è separato dal citoplasma. Il DNA è formato da due filamenti di nucleotidi avvolti a formare una doppia elica. La lunghezza del cromosoma batterico varia da 6 x 10 5 paia di basi a 10 9, per un totale compreso tra i 500 e i 1000 di geni diversi 6. Per identificare un batterio occorre estrarre da questi filamenti cromosomici una particolare sub unità ribosomale che compone il DNA, ovvero il gene 16S 8. Quest ultimo è presente in tutte le specie batteriche ma in modi differenti. Per questo motivo una volta separato dal DNA si è in grado di leggere la sequenza di nucleotidi la quale permette a sua volta di comparare con quelle conosciute nella banca dati l identificazione del batterio 9. 7

9 2.2 Antibiotici Storia Prima della scoperta degli antibiotici, le patologie infettive causate dai batteri, portavano nella maggior parte dei casi alla morte (ad es. la peste dopo la prima guerra mondiale). Con la scoperta in seguito, dei sulfamidi è iniziata l era degli antibiotici, durante la quale la guarigione da infezioni batteriche è diventata abituale. Il primo antibiotico individuato fu la penicillina nel 1928 da Alexander Fleming, che diete il via, negli anni successivi a una serie di scoperte di nuove molecole antibiotiche 10. Nonostante la scoperta di queste sostanze antimicrobiche sia piuttosto facile, solo poche di esse hanno un interesse medico o commerciale 11 ; alcune sono tossiche per l uomo, altre sono utilizzati come aggiunte ai mangimi per animali. Tuttavia l uso costante e intensivo degli antibiotici, sia nella medicina umana, veterinaria che fitosanitaria, ha portato a un periodo più delicato, in cui ci si è dovuti confrontare con la capacità del mondo microbico di adattarsi a nuove condizioni esterne, compresa la presenza degli antibiotici. Infatti, come approfondirò più avanti, i batteri sono riusciti, soprattutto negli ultimi decenni, a sviluppare nuove strategie di resistenza nei confronti di molte molecole antibiotiche) un esempio riguarda il caso dell espidemia di Escherichia coli avvenuto nel giugno 2011 g ). Di conseguenza, siamo entrati in una fase in cui l utilizzo più razionale e ragionato degli antibiotici è diventato indispensabile Descrizione degli antibiotici Gli antibiotici sono sostanze chimiche definiti come una sostanza antibatterica prodotta da microorganismi 12 e il cui effetto è esercitato su uno o più metabolismi differenti, perturbando il funzionamento metabolico di batteri o funghi. Nonostante sappiamo come agiscano sulle popolazioni batteriche in laboratorio, non si conoscono le sue modalità in natura. Infatti, le concentrazioni di antibiotico nei terreni è inferiore alla dose necessaria a inibire i microbi. Il gruppo degli antibiotici comprende un grande assortimento di molecole organiche differenti, generalmente con massa molecolare compresa in un intervallo che va da 300 a 1000 dalton (unità di massa atomica unificata) 4. Gli antibiotici sono sostanzialmente molecole che possono agire in due modi sui diversi microorganismi. Generalmente gli antibiotici sono definiti batteriostatici, nel senso che agiscono arrestando o inibendo la crescita di un determinato batterio, senza distruggerlo; ma esistono antibiotici battericida, che al contrario, li uccide. Tuttavia vi sono antibiotici che possono agire in entrambi i modi a dipendenza dal tipo di specie batterica si tratti. Oggigiorno la maggior parte degli antibiotici è sintetizzata chimicamente dall uomo, ma sono tutti derivati da certi tipi di organismi13 ; infatti, i primi antibiotici usati nel trattamento clinico contro le infezioni, negli anni Sessanta, erano prodotti da organismi in particolari habitat e condizioni ambientali favorevoli. Il principale gruppo di produttori naturali sono i actinomiceti, batteri che sintetizzano naturalmente l antibiotico actinomicina dotato di un largo spettro batteriostatico e che può essere tossico per gli animali, anche in minime quantità. Benché le principali classi di antibiotico usati in ambito terapeutico sono sintetizzati naturalmente, tre sono di origine antropica: 8

10 sulfamidico, introdotto già nel 1930; chinoline, introdotto nel 1960 e oxazolidinone, approvato nel Si stima che fino al 2000 sono stati prodotti e diffusi circa un milione di tonnellate di antibiotici, incluso l uso nell agricoltura e negli animali, dando una maggiore spinta alla crescita di ceppi resistenti Come agiscono gli antibiotici L abbondanza delle molecole antibiotiche ha reso necessario una loro classificazione basata oggi sulla loro struttura molecolare. La principale funzione dell antibiotico è quella di inibire numerosi processi biologici; i più importanti sono la replicazione del DNA, la trascrizione e la sintesi della parete batterica 15. Nella Tabella 1 sono riassunti le classi e gli antibiotici considerati nel lavoro pratico. Classe Tipi di antibiotici Funzione Azione Beta- lattamici Augmentine; Batteriostatici Inibiscono la sintesi della parete batterica, interferendo nella formazione di peptiglicano. Chinoloni Ciprofloxacina Battericida Inibiscono le funzioni genetiche del DNA, impedendo la sua replicazione legandosi a enzimi topoisomeri. Penicilline Penicillina; Ampicillina; Battericida Interferiscono nella sintesi della parete Oxacillina cellulare batterica durante la sua riproduzione. Cefalosporine Cefazolina; Cefuroxima; Battericida Interferiscono nella sintesi della parete Ceftazidima; Ceftriaxone cellulare batterica durante la sua riproduzione. Carbapenemi Imipenem; Meropenem Battericida Interferiscono nella sintesi della parete cellulare batterica durante la sua riproduzione. Aminoglicosidi Gentamicina Battericida o Interferiscono nella sintesi proteica del batteriostatica microorganismo. Folate pathway Trimethoprim- Batteriostatica a Inibiscono la sintesi di alcuni enzimi. inhibitors sulfamethoxazole volte battericida Glicopeptidici Vancomicina Battericida Agisce sugli organismi in fase di replicazione, inibendo la sintesi di peptiglicano. Lincosamidi Clindamicina Batteriostatica Inibisce la sintesi proteica. Lipopeptidi Polimicina Battericida Si lega alla membrana citoplasmatica, compromettendo la capacità osmotica. Macrolidi Eritromicina Batteriostatica e Inibisce la sintesi del RNA e dunque la sintesi battericida proteica. Tetracicline Tetraciclina Batteriostatica Bloccano la sintesi proteica dei RNA. Tabella 1: sono riassunte le principali classi antibiotiche considerate in questo lavoro e la loro modalità di azione. RNA = acido ribonucleico Batteriostatici = inibiscono la crescita della cellula batterica Battericida = preposti all uccisione del batterio 9

11 2.3 Resistenza Storia La comparsa di resistenze a composti antimicrobici di uso comune è un valido esempio di plasticità del genoma microbico. La resistenza agli antibiotici nasce soprattutto quando l organismo è a contatto con essi 8. Come detto in principio, per parlare della storia della vita sulla terra bisogna partire dai microorganismi, in particolare i batteri, i quali sono presenti sul pianeta da centinaia di milioni di anni. Questo ha comportato un grado di evoluzione dei meccanismi di protezione e di adattamento enorme rispetto agli altri organismi viventi. I dispositivi sviluppati per resistere agli antibiotici sono stati acquisiti dai batteri continuamente minacciati da altri batteri patogeni 8, per adattarsi e sopravvivere. Tuttavia, il problema della resistenza batterica agli antibiotici si è riscontrato davvero solo nell ultimo secolo, quando a partire dagli anni 50, vi fu una rapida disponibilità di nuovi e potenti farmaci 14. Da all ora è stato prodotto solo un numero esiguo di farmaci, questo poiché i microbi avendo avuto, come detto in precedenza, un periodo di evoluzione piuttosto lungo, hanno imparato a sintetizzare gran parte dei composti chimici che assicurano la loro sopravvivenza. I fattori che facilitano questa veloce diffusione della resistenza dipendono dalla caratteristica dei batteri sia di formare delle colonie, sia di proliferare molto in fretta. Inoltre l ampio uso di antibiotici aumenta il rischio di indurre una resistenza multipla o multiresistenza. Sul piano genetico la resistenza batterica agli antibiotici può essere di due tipi: naturale o intrinseca e acquisita. Nella Tabella 2 sono riportati qualche esempio del tempo trascorso dalla scoperta di un antibiotico alla prima osservazione di resistenza batterica ad esso. Antibiotico Anno di scoperta Prima resistenza osservata Sulfamidi Eritromicina Vancomicina Meticillina Ampicillina Tabella 2: alcuni esempi del tempo trascorso dalla scoperta di un antibiotico alla prima osservazione di resistenza batterica. Adattata da: C. Walsh, Antibiotics: action, origins, resistance, ASM Press, Washington, Descrizione del fenomeno di resistenza batterica Naturale La resistenza batterica naturale è una resistenza intrinseca e stabile che hanno tutti gli organismi della stessa specie; è trasmessa alla prole e raramente diffusa tra organismi differenti. Come detto precedentemente la resistenza è data da una serie di geni particolari situati direttamente 10

12 sui loro cromosomi e conferiscono meccanismi biochimici di resistenza diversi. Un primo meccanismo si riscontra spesso nei bacilli Gram-negativi, e riguarda la caratteristica della membrana cellulare esterna alla parete, ricca di lipidi, di evitare la penetrazione di determinati antibiotici. Un secondo meccanismo è legato a Gram-negativi che sono resistenti solo a bassi livelli di antibiotico b : in questo caso la membrana è infatti caratterizzata da una pompa di efflusso 16, la quale è in grado di espellere l antibiotico fuori dall organismo, diminuendo così la concentrazione interna di antibiotico. Acquisita La resistenza acquisita è una caratteristica di certi ceppi o specie, che per motivi vari hanno acquisito; è perciò instabile poiché è trasmessa in modo accentuato tra batteri sia della stessa specie che tra specie differenti. La resistenza acquisita è una modifica dell informazione genetica dell organismo 16, avvenuta mediante mutazione o acquisizione di materiale genetico estraneo; conferisce una tolleranza a concentrazioni di antibiotico maggiori rispetto a quelle necessarie a inibire il ceppo della stessa specie. La resistenza acquisita fu osservata già durante i primi usi degli antibiotici nelle cure ospedaliere, ma all ora la frequenza di questi casi era molto bassa. In seguito l aumento nell uso di antibiotici ha condotto alla selezione di ceppi resistenti, tanto che oggi non si è più in grado di prevedere con sicurezza il comportamento che un determinato ceppo avrà nei confronti degli antibiotici. Anche per la resistenza acquisita vi sono diversi meccanismi ereditari, suddivisi secondo il potenziale genetico dei batteri: da un lato il cromosoma obbligatorio e dall altro uno o più genofori (cromosomi) facoltativi ed extra- cromosomici, i plasmidi. La resistenza extra-cromosomica riguarda i cosiddetti plasmidi, i quali si trovano in numerose specie, concernenti ormai molti antibiotici. Vi sono due fatti che spiegano l importanza della resistenza plasmidica: - In primo luogo è legata alla sintesi di proteine e non a una modifica genetica o strutturale del batterio. Questo significa che il batterio portatore di plasmidi non é né selezionato né indebolito come i batteri resistenti per mutazione In secondo luogo i numerosi plasmidi di resistenza sono coniugativi o trasferibili, mediante trasduzione dei batteriofagi16. Tuttavia questa importante diffusione di geni di resistenza è aggravata sostanzialmente per l esistenza di elementi genetici, quali i trasposoni e integroni. Il plasmide di resistenza può evolvere sia per l acquisizione che per la perdita di fattori di resistenza trasportati tramite trasposoni, i quali permettono la diffusione di geni tra specie di batteri filogeneticamente diversi 16. I trasposoni coniugativi, come nel caso della resistenza cromosomica, non sono necessariamente indotti dall uso di antibiotici, ma in compenso possono contribuire a una multi-resistenza. 11

13 2.3.3 Tipi di resistenza Negli ultimi anni la diffusione di microrganismi patogeni multi resistenti è diventata un fenomeno di notevole importanza, in quanto sempre più in evoluzione. Tra i batteri resistenti agli antibiotici, hanno assunto particolare attenzione negli ultimi anni gli MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), gli VRE (Vancomycin-Resistant Enterococcus) e gli ESBL (Extended Spectrum Beta- lactamases) 7. Tuti e tre i tipi di resistenza, provocando insuccessi nei trattamenti antibiotici sono causa di epidemie soprattutto ospedaliere. ESBL I meccanismi di resistenza agli antibiotici Beta-lattamatici sono di tre tipi: - nel primo caso vi è una diminuzione nell assorbimento di antibiotico dovuto alla mutazione delle proteine situate sulla membrana 7 ; - nel secondo caso vi è la produzione di specifici enzimi in grado di degradare o alterare l antibiotico, le cosiddette beta-lattamasi, le quali rappresentano il meccanismo principale per questo tipo di resistenza7; - nel terzo caso vi è un alterazione del bersaglio dell antibiotico, ovvero il peptiglicano 7. Gli ESBL sono quindi batteri che producono particolari enzimi responsabili della loro resistenza alla classe degli antibiotici beta-lattamici, i quali hanno un elemento in comune nella loro struttura molecolare, ovvero un anello a quattro atomi noto come beta- lattame. Gli ESBL sono stati osservati, in particolare, nei reparti di cure intensi degli ospedali e nelle strutture di cura di lunga degenza 7. MRSA Per definizione gli MRSA sono batteri Staphylococcus aureus resistenti agli antibiotici meticillina e oxacillina. La meticillina resistenza ai Stafilococchi è una resistenza intrinseca a tutti i tipi di beta-lattamici e ai suoi derivati 2, e fu diagnosticata pochissimo tempo dopo l introduzione nella terapia clinica della meticillina. I ceppi MRSA sono i patogeni nosocomiali più diffusi e presentano frequentemente multi resistenze. Sempre più preoccupante è la loro diffusione dagli ambienti ospedalieri verso la comunità umana 16. VRE La resistenza alla vancomicina è data da essa stessa, in altre parole questa resistenza è inducibile dalla vancomicina 17. I batteri che presentano questo tipo di resistenza appartengono al genere Enterococcus. Il problema di questa resistenza è aggravato dalla continua comparsa di ceppi resistenti agli antibiotici glicopeptidici, come ad esempio la vancomicina, e di conseguenza diventano sempre più difficili da eliminare 7. 12

14 2.3.4 Come si sviluppa la resistenza Mutazione A livello cellulare, una mutazione genetica corrisponde alla comparsa di un nuovo individuo che differisce dalla popolazione d origine 6. In questo modo l alto tasso riproduttivo dei batteri favorisce la comparsa di nuove forme dotate di migliori o peggiori capacità di sopravvivenza. A livello molecolare, una mutazione è invece una modifica della sequenza di nucleotidi, quindi del DNA. Tuttavia la mutazione in quanto tale è piuttosto rara, indipendente ed è trasmessa verticalmente alla prole. Il tasso di mutazione dipende dal carattere considerato e dal batterio (circa tra 10-6 a ), ma più la popolazione è importante più alta è la probabilità 8. In una mutazione distribuita in modo casuale, ad esempio nell ambiente, ci potrebbero essere circa un migliaio di geni, uno su tre dei quali potrebbero avere una mutazione. In un infezione sanguigna causata da batteri patogeni, su 1011 cellule presenti nel paziente si stima che ci potrebbero essere un migliaio di mutazioni diverse. Si può concludere dunque che la probabilità di una diffusione della resistenza a un antibiotico è molto alta Proliferazione In condizioni ottimali, ovvero in un ambiente stabile, alcuni batteri sono in grado di dividersi ogni 20 minuti, riproducendo 8 cellule in un ora 4. La moltiplicazione avviene ad un tasso costante: essa è di fatto esponenziale e corrisponde all inverso del tempo di generazione. È possibile calcolare il numero di batteri che si riproducono in un determinato periodo di tempo, partendo da una singola cellula, mediante l equazione: N = 2g dove N rappresenta il numero di batteri e g il numero delle generazioni 4. In poco tempo, se le cose continuassero in questo modo entro due giorni questo singolo batterio potrebbe arrivare a riprodursi per una massa complessiva pari al volume della terra. Ciò significa che in poco tempo potrebbe nascere una nuova specie, differente dalla precedente per caratteristiche migliori o peggiori della precedente. Tuttavia vi sono vari fattori che incidono sul tasso di crescita: come il nutrimento, indispensabile per riparare le sue strutture interne e per compensare l energia usata, la temperatura che deve essere entro certi limiti (37-40 C più favorevole) o il valore ph della soluzione nella quale vivono deve essere piuttosto neutro 8. Per questi motivi difficilmente i batteri in natura possano crescere così velocemente; tutto ciò dipende dalla necessità di sopravvivere per un lungo periodo di tempo. 13

15 Plasmidi I batteri hanno più modi per trasferire tra loro il codice genetico e il plasmide è uno di questi. Esso è una molecola di DNA situato nel citoplasma batterico ed è in grado di spostarsi da una cellula all altra. Questo tipo di molecola è largamente diffusa nei batteri, riscontrata spesso in batteri Gram negativi come pure in alcune specie di Gram positivi. In altre parole molti batteri possono ospitare, al loro interno molecole contenenti elementi extracromosomici di DNA, plasmidi 1 : questi contengono il filamento di un qualunque gene in forma circolare e avvolto più volte su se stesso, le cui dimensioni corrispondono mediamente a 1/10 di quelle di un cromosoma 1. In generale in condizioni normali queste molecole non sono indispensabili alle cellule batteriche 6 ; tuttavia, una volta che il plasmide è entrato nell organismo gli conferisce particolari proprietà, come permettergli di sopravvivere in condizioni sfavorevoli, estendendo così il suo ecosistema naturale. Esso è in grado inoltre di trasportare alcuni geni dell ospite, contribuire allo scambio e alla ricombinazione di caratteri genetici, e soprattutto può duplicarsi autonomamente. Questi coniugativi, oltre a codificare per il trasferimento di materiale genetico, contengono geni addizionali i quali sono molti e diversi fra loro e conferiscono caratteristiche differenti all organismo ospite in cui si introducono: geni strutturali, geni metabolici o catabolici, geni che codificano tossine, geni di resistenza, ecc. Figura 2: il modello rappresenta il momento in cui un plasmide è entrato nella cellula ospite. Tratto da: ( ). Quest ultima è la caratteristica, che negli ultimi anni è diventata più importante ed è responsabile del rapido incremento delle resistenze agli antibiotici nelle popolazioni batteriche, è chiamata plasmide di resistenza (R) o fattori R. Di plasmidi R ve ne sono parecchi, ognuno dei quali contiene un determinato gene in grado di rendere l ospite resistente a un antibiotico preciso o addirittura gli conferisce una resistenza multipla, che può arrivare fino a otto antibiotici diversi 1. Ciononostante i batteri possono attivare i geni solo al momento in cui vengono a contatto con essi; infatti, quando la concentrazione di antibiotico si riduce i geni vengono disattivati 18, poiché la produzione di proteine che conferiscono in vario modo la resistenza a diversi antibiotici rappresenti solo un inutile spreco energetico 11. Solitamente il plasmide R è coniugativo e può essere trasferito in diverse specie differenti di batteri, comportamento che favorisce la loro diffusione ma anche un elevato rischio per l uomo. Con l impiego sempre maggiore di antibiotici nelle cure terapeutiche, in particolare negli ospedali, la diffusione del plasmide R tra i batteri 14

16 patogeni, nonché la selezione e concentrazione dei batteri resistenti agli antibiotici, ne risulta favorita Antibiogrammi o test Kirby-Bauer L antibiogramma è un metodo per diffusione che serve a misurare la resistenza di un batterio a più antibiotici. Su un determinato terreno di coltura, diverso a seconda della classificazione di Gram, è inoculato uniformemente un solo tipo di microorganismo su cui successivamente sono applicati dei dischi di carta impregnati di una quantità conosciuta di antibiotico 7. Durante l incubazione il dischetto rilascia il farmaco, il quale si diffonde formando un area circolare attorno ad esso. La lettura dell antibiogramma è immediata e si basa sulla misurazione del diametro della zona di inibizione formato dal batterio attorno al disco d antibiotico; comparando poi la lunghezza con i dati di classificazione standard, si indica se il batterio risulti sensibile (S) (quindi non potrebbe vivere in presenza di antibiotico), intermedio (I) o resistente (R) ai vari antibiotici. Generalmente più estesa è la zona più il batterio è sensibile all antibiotico. Figura 3: Esempio di piastra usata nel test dell'antibiogramma. Tratto da: mag.htm ( ). 15

17 3. Interrogativi di ricerca Come anticipato nell introduzione l oggetto principale di ricerca sul quale ho costruito il mio lavoro si suddivide in tre interrogativi: Domanda 1: Il fenomeno di resistenza batterica agli antibiotici si presenta in misura più accentuata in un ambiente dove vi è un maggior utilizzo di antibiotico? Domanda 2: Questa resistenza si sviluppa indipendentemente dal tipo di antibiotico al quale il batterio è esposto oppure è la struttura antibiotica stessa che costituisce un fattore di resistenza? Domanda 3: Di conseguenza, due ceppi di batteri appartenenti alla stessa specie ma isolati da ambienti differenti, possono avere lo stesso grado di resistenza ad uno stesso antibiotico? 16

18 4. Ipotesi Prima di passare alla parte pratica del mio lavoro vorrei cercare di anticipare quali potrebbero essere le eventuali risposte agli interrogativi. Ipotesi 1: Suppongo che la resistenza batterica si riscontrerà maggiormente nell acqua fognaria dell ospedale, poiché è qui che vi è un uso maggiore di antibiotici. In primo luogo i batteri sono presenti sulla terra da ormai centinai di milioni di anni, un tempo relativamente lungo che tuttavia ha permesso loro di potersi organizzare ed evolvere in modo sempre più efficiente e veloce particolarità che ha permesso loro di sopravvivere alle nuove condizioni ambientali in continuo mutamento (cap ). In secondo luogo hanno dovuto al contempo sviluppare vari meccanismi difensivi contro questi nuovi fattori ambientali, quale ad esempio gli antibiotici. Infatti, al contrario di quello che si possa pensare gli antibiotici non sono solo sostanze prodotte chimicamente dall uomo ma, come detto in precedenza, essi possono essere sintetizzati naturalmente da certi tipi di batteri, i quali rilasciano questi composti con l obiettivo di uccidere le altre specie (cap ). Ciononostante la quantità di antibiotico negli ecosistemi naturali fino alla loro scoperta da parte dell uomo era pressoché irrisoria, per questo motivo durante i primi anni di utilizzo dei nuovi farmaci nelle terapie mediche, veterinarie o fitologiche si ottenevano risultati sorprendentemente efficienti (cap ). Infine i batteri essendo così sempre più a contatto con queste molecole sono riusciti a sviluppare nuove tecniche di resistenza, sfruttando al contempo le loro capacità intrinseche, come la velocità nella proliferazione grazie alla quale può nascere molto velocemente una nuova specie con caratteristiche migliori o peggiori della precedente (cap ). Quando si analizza il fenomeno della resistenza batterica si deve considerare i plasmidi (cap ) grazie ai quali possono avvenire queste mutazioni, conferendo ai batteri questa particolarità. Ne consegue dunque che più i batteri sono a contatto con gli antibiotici in un ambiente, più elevate sono le probabilità che acquisiscano e sviluppino una resistenza 9. Ipotesi 2: I batteri possono essere resistenti a più antibiotici, ma in particolar modo ad antibiotici che appartengono alla stessa classe. Infatti, i vari antibiotici esistenti sono classificati secondo la loro particolare struttura molecolare che permette loro di agire in un determinato modo sul batterio bersaglio; di conseguenza come è mostrato nella (Tabella 1) all interno di una stessa classe possono esserci più antibiotici. Per di più, i batteri possono contenere al loro interno fino a 10 molecole extracromosomiche di DNA (cap ), in particolare plasmidi R i quali contengono dei geni in grado di conferire alla cellula batterica la resistenza ad uno specifico antibiotico. Di questo fattore R ve ne sono numerosi, ognuno dei quali racchiude un gene di resistenza diverso (cap ). Ciò nonostante se un batterio contiene un determinato plasmide di resistenza a un tipo di antibiotico, probabilmente sarà pure meno sensibile ad antibiotici affini al primo. Di conseguenza ribadisco la 17

19 possibilità che un batterio possa acquisire e sviluppare una resistenza multipla nei confronti di classi di antibiotici diverse. Ipotesi 3: Per sostenere la tesi odierna riguardo la resistenza batterica agli antibiotici, ovvero che dipende dall uso improprio ed eccessivo, quindi per determinare che il fenomeno della resistenza agli antibiotici si sviluppi nel caso l organismo sia a contatto con esso, suppongo che due batteri appartenenti alla stessa specie ma isolati da acque differenti possiedano un grado di resistenza diverso ad uno stesso antibiotico. Ricollegandomi a quanto detto precedentemente, se un batterio non è a contatto con un antibiotico esso non potrà sviluppare una vera e propria resistenza a quest ultimo (Tabella 2). Infatti, anche se un batterio possiede il gene di resistenza, esso può attivarlo solo nel caso in cui venga a trovarsi in un ambiente ricco di quello specifico antibiotico 11. Perciò se nell ambiente da cui è stato isolato un batterio non vi era la presenza di un determinato antibiotico, risulterà esservi maggiormente sensibile, rispetto a un batterio della stessa specie ma isolato da un altro tipo di acqua. 18

20 5. Parte sperimentale Esperimento 1: Per verificare la prima ipotesi (cap. 4) è necessario prima di tutto estrarre tutti batteri presenti nei diversi campioni di acqua prelevati: ciò deve avvenire tramite filtrazione. Questa infatti permette di far depositare i batteri contenuti nel campione su un filtro di carta. Successivamente per selezionare fra questi solo i batteri resistenti, il filtro deve essere posto su un terreno di coltura selettivo, preparato in laboratorio, in modo che possa assorbire sia il nutrimento che l antibiotico in esso contenuto. Di conseguenza, in base al numero di colonie di batteri resistenti cresciuto sulle piastre selettive, potrò determinare quale ambiente presenta maggiormente il fenomeno studiato. Esperimento 2: Al fine di verificare il grado di resistenza dei ceppi selezionati da tutt e quattro i campioni d acqua, è necessario ricorrere al test dell antibiogramma. Un batterio viene inoculato uniformemente su un terreno di coltura, sul quale vengono poi applicati dei dischetti contenenti una certa quantità conosciuta di antibiotico. Dopo il periodo di crescita, di circa 24 ore, attorno a questi dischetti appare un alone di forma circolare. A dipendenza della misura del diametro è possibile determinare se il batterio sia resistente o sensibile (cap ) agli specifici antibiotici testati. Esperimento 3: Infine per convalidare l ipotesi per cui due batteri della stessa specie possono avere resistenze diverse (cap. 4) è essenziale identificare i batteri isolati precedentemente: a tale scopo si possono impiegare due metodi differenti nel caso in cui una delle due banche dati non possieda sufficienti informazioni. Il MALDI, abbreviazione di Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight, è un metodo nato negli anni Ottanta, che serve per l identificazione veloce di proteine mediante la determinazione del peso molecolare di specifici frammenti. Il MALDI è impiegato nell analisi di molecole non volatili come ad esempio il DNA. Il metodo PCR (Polimerasi Chain Reaction) è l insieme di reazioni enzimatiche che consentono l identificazione e l amplificazione di una sequenza di DNA 19. L amplificazione di un frammento del materiale genetico è catalizzata da polimerasi, generalmente la Taq polimerasi. Tuttavia è necessario dapprima isolare il DNA separando la doppia elica ed in seguito localizzare il gene o il frammento che si vuole amplificare mediante ibridazione degli estremi con specifici primer 18, i quali devono essere complementari alle corrispettive sequenze. Una volta identificati, confronterò i risultati ottenuti dal test dell antibiogramma, precedentemente effettuato. 19

21 6. Metodologia e Metodi 6.1 Campionamento delle acque Ho prelevato 4 campioni di acqua con una bottiglia sterile, in 4 luoghi diversi (Tabella 3), dopo aver preso contatto sia con l ospedale San Giovanni di Bellinzona sia con l ente di depurazione per chiedere il permesso di raccolta dei campioni. Date Campione Dove Depuratore Utilizzato il campione fornitoci dal depuratore raccolto sulle 24h Ospedale San Giovanni (OSG) Fiume Ti Prelevato all altezza di Molinazzo sotto il ponte della cantonale, ad Arbedo Rubinetto Prelevato direttamente dal rubinetto di casa a Lumino. Tabella 3: informazioni generali relative alle acque prelevate. Figura 4: prelievo campione dell'acqua fognaria dell'osg. 6.2 Preparazione piastre selettive Prima di dare inizio alla parte pratica del lavoro è stato necessario preparare le piastre utilizzate per la crescita selettiva dei batteri (Tabella 4). Ho utilizzato 9 tipi di piastre differenti (Tabella 4): le piastre preparate in laboratorio contenevano, oltre al terreno di coltura normalmente usato, anche una dose standart di antibiotico (quantità usata in laboratorio per questo genere d analisi) tale da permettere la crescita solo dei batteri resistenti all antibiotico specifico. La piastra PCA (plate count agar), contenente unicamente il terreno di coltura (vedi allegato 1 per gli ingredienti), è stata usata come controllo di crescita. 20

22 2 Tipo piastra Concentrazione antibiotico Origine delle piastre MRSA Fornita già fatta Ref : BioMèriuex SA, France ESBL Fornita già fatta Ref : BioMèriuex SA, France VRE Fornita già fatta Ref : BioMèriuex SA, France 1 PCA - Preparate all ICM PCA + ampicillina 10 µg/ ml Preparate all ICM PCA + ceftriaxone 30 µg/ ml Preparate all ICM PCA + gentamicina 10 µg/ ml Preparate all ICM PCA + ciprofloxacina 5 µg/ ml Preparate all ICM PCA + eritromicina 15 µg/ ml Preparate all ICM Tabella 4: informazioni relative al tipo di piastre utilizzate per la crescita dei microorganismi. PCA = Plate Count Agar 1 Le piastre PCA senza aggiunta di antibiotico servono da controllo per la crescita totale dei batteri. 2 La concentrazione di antibiotico nelle piastre corrisponde a quella utilizzata in laboratorio per la determinazione della resistenza fenotipica con il metodo Kirby-Bauer. Per convalidare i risultati sono state utilizzate, per tutti i campioni d acqua, ogni tipo di piastra in triplicato. Innanzitutto si è dovuto trovare la giusta concentrazione, in massa (su volume), degli antibiotici da aggiungere al terreno di coltura PCA, mediante un semplice calcolo di proporzione, in modo da evitare concentrazioni con valori troppo elevati o rispettivamente bassi. La concentrazione, mostrata nella Tabella 4, era quindi equivalente a quella presente nei dischetti per il controllo standard, usati per testare la resistenza fenotipica dei batteri, secondo il metodo Kirby-Bauern. Tipo di antibiotico Concentrazione in massa (mg) Ampicillina 5 Ceftriaxone 15 Gentamicina 5 Ciprofloxacina 2.5 Eritromicina 7.5 Tabella 5: concentrazioni dei diversi antibiotici nelle piastre preparate all'icm. Ho pesato g di polvere PCA (Plate Count Agar, Ref BC, Dickinson and Co. Francia) che ho sciolto in 500 ml di acqua sterile. Il tutto è stato autoclavato per 15 min. a 121 C al fine di sterilizzare. Nel frattempo sono stati pesati i vari antibiotici in polvere e versati in beute, nelle quali è stato aggiunto 10 ml di acqua sterilizzata in modo da scioglierli uniformemente. Nel caso della ciprofloxacina, oltre all acqua, sono state aggiunte pure alcune gocce di alcool etilico in 21

23 modo da scioglierlo più facilmente, mentre l agar, preparato in precedenza, è stato autoclavato. Dopo aver denominato ogni singola piastra in base all antibiotico che avrebbe contenuto, sono stati rimossi i vari agar dall autoclave e fatti raffreddare leggermente prima di aggiungervi in ogni ½ litro la dose di antibiotico. L antibiotico deve essere mescolato con il nutrimento (PCA), affinché i batteri resistenti possano crescere in modo selettivo, nonostante la presenza dell antibiotico. Grazie ad un apposita apparecchiatura che dosa le quantità è stato immesso in ogni piastra 25 ml di soluzione (PCA + antibiotico); quest operazione deve svolgersi nel minor tempo possibile, in quanto sotto i 40 C, la PCA comincia a solidificare. Le piastre sono poi state poste in una cella frigorifera per conservarle Verifica piastre A questo punto occorre verificare che la concentrazione di antibiotico sia sufficiente ad inibire il batterio sensibile e non quello resistente. Per questo motivo sono stati usati due ceppi di batteri conosciuti per le loro caratteristiche di resistenza e sensibilità agli antibiotici presenti nelle piastre preparate: Escherichia coli K12 (sensibile agli antibiotici testati) ed Escherichia coli (resistente agli antibiotici testati). Il test di controllo è stato eseguito sulle 5 piastre contenente l antibiotico, le quali sono state divise in due parti: sulla prima è stato piastrato il batterio sensibile, mentre sull altra quello resistente. Per questo è stata usata un ansa di ferro sterilizzata con la fiamma e i batteri sono stati inoculati con la tecnica dei tre settori. Le piastre sono state poste nell incubatore a 37 C per 24 ore, in modo di favorire la crescita dei batteri. 6.3 Verifica quantità di acqua e filtrazione dei campioni d acqua Per permettere una maggiore rappresentatività dei risultati, tutti i campioni d acqua sono stati analizzati in triplicato. La filtrazione è stata effettuata attraverso un apposito imbuto dove è stato applicato un filtro con maglia a 0.45 µm (EZ-Pak Membrane Filters, ø 47 mm; Ref. EZHAWG474; Millipore SA) che impedisce ai batteri di passare su una beuta codata alla quale si è attaccato un tubo per l aspirazione. Ho usato acqua peptonata (contenente peptone, una proteina che mantiene un ambiente stabile e favorevole al batterio) per diluire i campioni d acqua. Al fine di determinare la quantità d acqua adeguata che permettesse una conta delle unità formanti colonie (UFC) sulla piastra è stato fatto un test preliminare di verifica sul campione d acqua prelevato alla stazione di depurazione a Giubiasco. È stato deciso di verificare 5 diluizioni diverse, ognuna diluita con 100 ml di acqua: da 10-3 a 10 2 ml. 22

24 Figura 5: procedura di filtrazione. Dopo aver filtrato l acqua, il filtro di carta utilizzato è stato posto direttamente sulla piastra PCA per l analisi microbiologica, in modo da delimitare l area contaminata senza impedire l assorbimento del nutrimento contenuto nell agar. Infine tutte le piastre sono state incubate a 37 C per 24 ore. Trascorso questo tempo, sono state controllate e ho potuto determinare che una concentrazione di acqua pari a 10-5 ml era ottimale per la messa in evidenza dei batteri contenuti nel campione. In modo analogo ho determinato la quantità di acqua necessaria anche per le analisi microbiologiche degli altri campioni (Tabella 6). Tutte le acque sono state quindi filtrate e il rispettivo filtro è stato inoculato in triplicato sui 9tipi diversi si piastre riportati nella tabella 2. Queste sono state messe nell incubatore a 37 C per 24 ore. Campione 10 ml 5mL 100 µl 10 µl 1µL 10-5 µl OSG X Depuratore X Fiume Ti X Rubinetto X Tabella 6: quantità di acqua ottimale utilizzata per l'analisi microbiologica dei vari campioni. 6.4 Isolamento e congelamento dei batteri isolati Trascorso il tempo di incubazione, rispettivamente 24 ore per le piastre contenenti PCA e antibiotico e 48 ore per le piastre selettive MRSA, VRE e ESBL, ho isolato i batteri cresciuti. Tuttavia prima di fare ciò ho potuto contare per ogni piastra il numero UFC (unità formante colonia). I criteri seguiti per decidere quali colonie isolare sono stati sostanzialmente due: prendere in considerazione la piastra del triplicato con il numero intermedio di colonie e di queste scegliere quelle morfologicamente diverse. I batteri così isolati sono stati inoculati nuovamente, con l utilizzo di un ansa di plastica sterile su una piastra PCA, e inserite nel 23