Spettroscopia UV-Visibile. Prof. Nicola Borbone - Corso di Fondamenti di Spettroscopia Molecolare - Spettroscopia UV-Visibile

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1 Spettroscopia UV-Visibile

2 Principi di base della spettroscopia Quando una radiazione elettromagnetica interagisce con un molecola si può avere: (a) Assorbimento (b) Emissione spontanea (c) Emissione stimolata In ogni caso la differenza di energia ΔE tra S 1 (stato eccitato) e S 0 (stato fondamentale) deve essere esattamente: ΔE = hν

3 Principi di base della spettroscopia L intensità della radiazione elettromagnetica dipende dal numero di fotoni che attraversa in 1 sec una superficie di aria unitaria perpendicolare al flusso di fotoni. In condizioni di equilibrio l intensità della radiazione assorbita e\o emessa dalla materia dipende dalla differenza di popolazione fra i due livelli energetici coinvolti nella transizione. Il numero di molecole o atomi che ad una determinata temperatura popola i diversi livelli energetici disponibili segue la distribuzione di Boltzmann: N e \N 0 = e -ΔE\kT dove k è la costante di Boltzmann pari a 8, ev/k (1, J/K). Questa relazione consente di calcolare il rapporto percentuale tra le particelle che si trovano in un determinato stato eccitato N e e quelle nello stato fondamentale N o noti T e ΔE.

4 Principi di base della spettroscopia Quali sono le condizioni necessarie affinchè possa verificarsi una transizione energetica? DEVONO ESSERE RISPETTATE LE REGOLE DI SELEZIONE Le regole di selezione, previste dalla meccanica quantistica, indicano quali sono le transizioni permesse ovvero le transizioni più probabili. Regola di selezione generale in corrispondenza di una transizione energetica è necessario che il sistema possa comportarsi come un dipolo elettrico oscillante. Ciò si spiega ammettendo che: Il campo elettrico oscillante della radiazione elettromagnetica possa scambiare energia con la materia solo se quest ultima si comporta come un dipolo oscillante. L interazione della radiazione con la materia possa avvenire solo se la transizione energetica indotta dalla radiazione porta ad una distribuzione asimmetrica delle cariche elettriche anche nello stato eccitato.

5 Spettroscopia UV-Visibile Si basa sull assorbimento selettivo da parte delle molecole della radiazione avente lunghezza d onda compresa tra 10 nm e 780 nm. UV lontano ( nm) UV vicino ( nm) Assorbimento dell ossigeno atmosferico: limite nell assorbimento al di sotto di 200 nm. Visibile ( nm)

6 Trasmittanza ed Assorbanza La spettroscopia UV-VISIBILE è una tecnica ottica che si basa sull assorbimento selettivo della radiazione elettromagnetica da parte delle molecole del campione. Lo spettrometro misura la differenza di intensità tra la luce che colpisce il campione (I 0 incidente) e la luce che fuoriesce dal campione (I emergente) per ogni lunghezza d onda compresa negli intervalli nm (UV) e nm (VISIBILE). TRASMITTANZA T = I /I 0, 0 < T < 1 ASSORBANZA A = Log I 0 /I, 0 < A < A = Log T

7 Trasmittanza ed Assorbanza TRASMITTANZA T = I /I 0, 0 < T < 1 ASSORBANZA A = Log I 0 /I, 0 < A < A = Log T L ASSORBANZA, ma non la trasmittanza, è proporzionale alla concentrazione del campione secondo la seguente relazione nota come Legge di Lambert-Beer A = ε b c ε = coefficiente di estinzione molare (cm -1 M -1 ) b = cammino ottico in cm c = concentrazione molare del campione

8 Trasmittanza ed Assorbanza Il coefficiente ε è una proprietà intrinseca della molecola in esame, e rappresenta l assorbanza ad una certa lunghezza d onda di una soluzione 1 M del composto in una cella di 1 cm di cammino ottico. ε varia in funzione della lunghezza d onda e del solvente impiegato. Misurando l assorbanza ed impiegando la legge di Lambert- Beer è possibile: Calcolare il numero di moli di un campione noto di cui si conosca il coefficiente ε Determinare ε di composti ignoti per ricavarne informazioni strutturali

9 Trasmittanza ed Assorbanza Nel preparare la soluzione del campione da analizzare è necessario scegliere concentrazioni tali da limitare l assorbanza (A) a valori inferiori a 2 in quanto oltre tale limite A non segue più la legge di L & B. La scelta del solvente va fatta in funzione della regione dello spettro che si vuole osservare. I solventi migliori sono l acqua e l acetonitrile.

10 Lo Spettro UV-Visibile Lo spettro UV-VISIBILE è un grafico a due dimensioni nel quale in ascissa sono riportate le lunghezze d onda ed in ordinata le assorbanze relative a ciascuna lunghezza d onda.

11 Lo Spettro UV-Visibile Gli spettri presentano bande di assorbimento non risolte a causa della contemporanea eccitazione dei livelli energetici vibrazionali e rotazionali.

12 Lo Spettrometro UV-Visibile

13 Lo Spettrometro UV-Visibile SORGENTE: fornisce un flusso costante di radiazione elettromagnetica. MONOCROMATORE: Il monocromatore serve a selezionare la radiazione elettromagnetica di una particolare lunghezza d'onda tra tutte quelle prodotte dalla sorgente. RIVELATORE: rivelatore è un dispositivo capace di generare un segnale elettrico quando è colpito da una radiazione elettromagnetica. ELABORATORE del SEGNALE: Il segnale in uscita dal rivelatore può essere utilizzato direttamente per tracciare uno spettro usando un registratore.

14 Lo Spettrometro UV-Visibile Spettrometro a singolo raggio Vantaggi strumentali: minori costi per l acquisto e la manutenzione. Spettrometro a doppio raggio Vantaggi strumentali: si eliminano le interferenze dovute al solvente. Inoltre le misure vengono effettuate contemporaneamente nelle stesse condizioni sperimentali.

15 Lo Spettrometro UV-Visibile Sorgenti impiegate Regione dell UV Lampade a scarica di deuterio cioè lampade ad arco in cui il bulbo di quarzo è riempito di deuterio che eccitato da cariche elettriche emette uno spettro continuo di radiazioni al di sotto di 400 nm. Lampade a vapori di mercurio o di cadmio che emettono spettri di righe particolarmente intense. Regione del visibile Lampade a filamento di tungsteno. L energia emessa dipende dalla tensione di alimentazione e quindi la lampada richiede stabilizzatori molto efficienti. La temperatura di lavoro è di circa 3000 k. Emettono nella regione nm. Lampade quarzo-iodio che forniscono energie più elevate. Hanno una vita media maggiore ed emettono nella regione nm.

16 Lo Spettrometro UV-Visibile Sorgenti impiegate Spettri di emissione della lampada a deuterio e a tungsteno.

17 Lo Spettrometro UV-Visibile Monocromatore Scompone la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche La qualità di un monocromatore è definita da due parametri: L ampiezza della banda passante e il potere risolvente. L ampiezza della banda passante è l intervallo di lunghezze d onda del fascio che emerge dalla fenditura con un energia superiore al 50% dell energia della radiazione nominale. Il potere risolvente esprime la capacità del monocromatore di separare tra loro due lunghezze d onda molto vicine.

18 Lo Spettrometro UV-Visibile I monocromatori si distinguono in: 1) FILTRI: assorbono una parte della componente spettrale della radiazione incidente e ne trasmettono una quota più o meno ampia. Sono costituiti da materiale dielettrico trasparente (fluoruro di calcio o di magnesio) filtri di assorbimento filtri a interferenza filtri a diffusione 2) PRISMI: diffrangono la luce policromatica separandola nelle diverse componenti monocromatiche sono in grado di scomporre la luce bianca nelle sue componenti colorate (ogni colore corrisponde a una certa lunghezza d'onda). Se poniamo una fessura all'uscita del prisma, solo la luce di un colore (ossia di una specifica lunghezza d'onda) può attraversarla. Funzionano perchè il vetro ha un indice di rifrazione diverso per luci di colore diverso.

19 Lo Spettrometro UV-Visibile I monocromatori si distinguono in: 3) RETICOLI: diffrangono la luce policromatica nelle diverse componenti monocromatiche a) reticoli di trasmissione (diffrazione) sottilissime fenditure rivestite di alluminio (da 600 a 2000 fenditure). b) reticoli di riflessione serie di solchi paralleli tracciati su una superficie riflettente,piana o concava. Il reticolo di riflessione è formato da una superficie riflettente su cui sono ricavate tante scanalature parallele e molto vicine tra loro (la cui distanza deve essere dello stesso ordine di grandezza della lunghezza d'onda della radiazione da rendere monocromatica). Un reticolo di questo tipo grazie al fenomeno della diffrazione è in grado di riflettere luci di lunghezze d'onda diverse con angoli diversi, e può quindi essere usato per costruire un monocromatore.

20 Lo Spettrometro UV-Visibile Il campione da analizzare viene versato in contenitori trasparenti alla luce chiamati cuvette. Per la spettroscopia UV si utilizzano cuvette di quarzo Per la spettroscopia nel VISIBILE si impiegano cuvette di vetro o policarbonato

21 Alloggiamento del campione:le celle Possono essere acquistate anche celle a diverso cammino ottico (da 0,1 cm a 10 cm). La qualità dei dati spettroscopici dipende criticamente dal modo in cui le cellette accoppiate sono usate e conservate. Impronte digitali, grasso, o altri depositi sulle pareti alterano marcatamente le caratteristiche di trasmissione di una celletta. Si deve anche porre attenzione ad evitare la presenza di bolle d aria (centri di dispersione delle radiazioni). Le cellette calibrate non devono essere mai asciugate per riscaldamento in un forno o su una fiamma perché questo potrebbe causare un danno fisico o un cambiamento nella lunghezza del cammino ottico.

22 RIVELATORI : trasformano l energia radiante in un segnale elettrico, che viene trasferito ad un segnale analogico o digitale Celle fotovoltaiche Il semiconduttore è inserito in un circuito di misura molto sensibile. Lavorano in un intervallo spettrale abbastanza ristretto ( nm) Fototubi Sono realizzati inserendo due elettrodi opportuni all interno di un ampolla mantenuta sotto vuoto, con una finestra trasparente alle radiazioni: di quarzo per l UV oppure di vetro per il visibile. Sono fotoemissivi nell intervallo nm oppure nm. Fotomoltiplicatori Sono molto più sensibili. Gli elettroni emessi dal catodo vengono accelerati da un campo elettrico e quindi acquistano energia; di conseguenza colpiscono un altra superficie elettronicamente attiva e così via in un sistema a cascata di elettroni Fotodiodi Sono costituiti da microscopici diodi di silicio o germanio su cui i fotoni provocano la comparsa di un eccesso di elettroni o di lacune elettroniche che fanno variare la differenza di potenziale del sistema generando una corrente proporzionale alla luce incidente.

23 Spettroscopia UV La spettroscopia di assorbimento nell UV/visibile si basa sull interazione delle molecole con radiazioni elettromagnetiche di lunghezza d onda compresa tra 200 e 380 nm (UV), e tra 380 e 780 nm (regione del visibile). La luce ultravioletta e la luce visibile possiedono energia sufficiente ad indurre una transizione elettronica degli elettroni di legame, ovvero la promozione di un elettrone da un orbitale ad un altro a più alta energia.

24 Spettroscopia UV Se consideriamo gli elettroni di legame, nello stato fondamentale, essi occupano gli orbitali di più bassa energia disponibili rispettando il principio di esclusione di Pauli (2 elettroni per orbitale). Quindi gli orbitali di legame di tipo σ e di tipo π (per molecole insature) saranno completamente occupati, così come quelli di non legame (n) per molecole con eteroatomi come N e O; gli orbitali di antilegame σ* e π* saranno invece vuoti. In generale, poiché i legami σ sono i più forti, gli orbitali σ sono quelli ad energia più bassa, ed i relativi orbitali σ* quelli ad energia più alta; gli orbitali di non legame, non coinvolti in legami, hanno energia intermedia tra gli orbitali di legame e di antilegame. Quindi, a grandi linee, l'energia degli orbitali disponibili in una molecola organica può essere così descritta:

25 Spettroscopia UV Quando una molecola assorbe una radiazione di opportuna lunghezza d onda, passa ad uno stato eccitato. Le transizioni elettroniche consistono nello spostamento di un elettrone da un orbitale ad un altro a più alta energia. Le transizioni elettroniche possono essere classificate sulla base delle caratteristiche degli orbitali coinvolti in: σ* π n π σ σ σ* : sono transizioni intense che avvengono tra orbitali con energia molto diversa e quindi possono essere indotte da radiazioni ad energia molto elevata. Le transizioni σ-σ cadono in una zona di frequenze non accessibile ai normali spettrometri. π π* : sono transizioni molto intense osservabili nella zona dell UV. Molecole contenenti due o più doppi legami coniugati mostrano assorbimenti sopra i 200 nm fino a raggiungere, per sistemi insaturi molto estesi, la zona del visibile. n-σ* : sono transizioni abbastanza intense associate agli elettroni di non legame che perciò possono essere osservate soltanto per molecole con eteroatomi: CH 3 OH assorbe a 185 nm n-π* :sono transizioni molto deboli ma facilmente osservabili perché cadono a lunghezza d onda più alta di qualsiasi altra transizione e in zone dello spettro abbastanza sgombre.

26 Spettroscopia UV - Definizioni Cromoforo: la parte della molecola responsabile dell'assorbimento UV (per esempio, un carbonile α, β insaturo) Gruppo auxocromo: un gruppo che non è di per sé un cromoforo, ma può modificare l'intensità e la lunghezza d'onda dell'assorbimento di un cromoforo Shift batocromico: spostamento di un assorbimento UV verso lunghezze d'onda maggiori (anche: spostamento verso il rosso) Shift ipsocromico: spostamento di un assorbimento UV verso lunghezze d'onda minori (anche: spostamento verso il blu) Effetto ipercromico: aumento dell'ε dovuto ad un sostituente del cromoforo. Effetto ipocromico: diminuzione dell'ε dovutoad un sostituentedelcromoforo.

27 Relazioni generali tra la struttura chimica e l assorbimento UV-Visibile I composti saturi non danno assorbimento UV σ π n π σ Gruppi funzionali contenenti legami π possono dare assorbimento nella regione nm. Tali gruppi funzionali insaturi sono detti cromofori Le transizioni n π sono quelle che richiedono meno energia, ma sono proibite e le corrispondenti bande sono caratterizzate da basso coefficiente di estinzione molare (ε<100). Caratteristica di tali transizioni è il fatto che si osserva uno shift ipsocromico con l aumento della polarità del solvente La spettroscopia UV è utile soprattutto per molecole insature (transizioni π-π* e n-π*) e particolarmente per quelle con doppi legami coniugati

28 I cromofori I cromofori sono, nella maggior parte dei casi, gruppi covalenti insaturi: essi sono gruppi funzionali che possono assorbire anche nella regione del vicino ultravioletto o del visibile quando contengono, per esempio, doppi legami coniugati. In generale, le molecole contenenti due o più cromofori mostrano un assorbimento uguale alla somma dei contributi di tutti i cromofori presenti, purché siano separati tra loro da due o più legami singoli. Se due cromofori sono coniugati essi producono un assorbimento molto più intenso, accompagnato da un aumento sia di λ max che di ε; quando i cromofori coniugati sono tre, l'aumento di λ max e di ε è ancora maggiore. Questi spostamenti batocromici sono attribuiti alla formazione di un nuovo cromoforo da parte del sistema coniugato; gli elettroni π di ciascun cromoforo possono muoversi più liberamente nella nuova configurazione elettronica del sistema coniugato.

29 I cromofori Quanto più la coniugazione è estesa, tanto più aumenta la lunghezza d onda massima di assorbimento Carotene: λmax = 452 nm (esano), ε = Licopene: λmax = 474 nm (esano), ε =

30 Transizioni π π * Danno luogo alle cosidette bande K Hanno coefficienti di estinzione molare alti ( ~10 4 ) In alcheni isolati si osserva nel lontano UV (<180nm) La λ max dipende da: 1. numero di doppi legami coniugati 2. sostituenti sul sistema coniugato 3. presenza di cicli

31 Transizioni π π * (n di doppi legami coniugati) La differenza di energia tra l ultimo orbitale occupato (HOMO) ed il primo orbitale libero (LUMO) si riduce con l aumento di n. Quindi si osserva uno shift batocromico con l aumento di n.

32 Transizioni π π * (n di doppi legami coniugati) Valori di λ max e di ε per l etilene e alcuni dieni coniugati λ max (nm) ε (M -1 cm -1 )

33 Transizioni π π * Un diene può esistere in due conformazioni: s-trans s-cis In un diene ciclico i due doppi legami possono essere omoannulari o eteroannulari Per ragioni non chiare un diene omoannulare assorbe a λ max molto più lunghe di un diene eteroannulare. La ε è molto maggiore però per i dieni eteroannulari (>10000) che per quelli omoannulari (<10000).

34 Transizioni π π* La lunghezza d onda alla quale si registra il massimo assorbimento di un cromoforo (λ max ) può essere prevista considerando additivi gli effetti dei vari sostituenti. Regole di Woodword-Fieser dieni eteroannulari dieni omooannulari Sostituenti Ulteriore C=C Gruppo alchilico C=C esociclico OAc OAlchile SAlchile Cl o Br N(Alchile) 2 Valore di base: 214 nm 253 nm Incrementi: 30 nm 5 nm 5 nm 0 nm 6 nm 30 nm 5 nm 60 nm Esempio

35 Composti carbonilici Sono presenti due transizioni: π π* nel lontano UV a ~ 150 nm n π* (BANDA R) nm con ε molto bassi (<100) Composti carbonilici α,β-insaturi Esistono regole di additività del tutto simili a quelle dei dieni:

36 Composti aromatici Sono possibili varie transizioni π π*. In particolare, il benzene presenta 3 bande di assorbimento: λ max 184 (ε = ), λ max 204 (7900) λ max 254 (200) Banda E1 BandaE2 Banda B Banda a struttura fine di solito usata a scopi di indagine strutturale

37 Analisi UV di fenoli ed aniline

38 Un semplice esercizio Calcolare il coefficiente di estinzione molare MW = λ max ~ 255 nm A ~ 1.1 n.mol = g/154.6gmol -1 = mol c = mol/0.010 L = M A = ε b c ε = A/b c ε = 1.1/1cm moll -1 = molcml -1

39 Applicazioni della spettroscopia UV/VIS Saggi sulla attività enzimatica Misura quantitativa degli acidi Nucleici A 260 Misura quantitativa delle proteine A 280 Lo spettro UV/Vis può essere utile per monitorare cambi nella struttura delle molecole (ossidazioni, riduzioni, scissioni di legame etc). Ciò è possibile se c è un cambiamento nella struttura del cromoforo Misure UV-VIS per quantizzare la concentrazione di moltissime sostanze.

40 Applicazioni della spettroscopia UV/VIS Identificazione di sistemi aromatici (identificazionedi sostituenti e coniugazioniin tali sistemi) Determinazione di costanti di equilibrio Studio del decorso cinetico di una reazione Identificazione e caratterizzazione di intermedi di reazione labili o non isolabili

41 Determinazione quantitativa di acidi nucleici La spettroscopia UV è la tecnica più utilizzata per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici (oligonucleotidi a singolo filamento, duplex, triplex, quadruplex, ecc). Il metodo consente di determinare in maniera approssimata la quantità di acido nucleico presente nel campione. L assorbanza letta dallo strumento viene espressa in numero di OD (Optical Density), il cui valore viene calcolato mediante la seguente equazione: A = Assorbanza a 260 nm V = Volume OD = A V fd b = cammino ottico (in cm) b fd = fattore di diluizione La relazione esistente tra il numero di OD e la massa del campione dipende dalla lunghezza dell oligo e dalla composizione in basi. Orientativamente 1 OD di campione sciolto in 1 ml misurato in una cella di 1 cm corrisponde a circa 33 µg per un oligo 20 mer.

42 Determinazione quantitativa di acidi nucleici Si parte dal campione secco di oligo. Questo viene sciolto in un volume noto di solvente (di solito 1 ml). Un aliquota nota di questa soluzione viene prelevata e versata nella cuvetta per UV. Si aggiunge quindi solvente fino ad arrivare ad 1 ml. Il fattore di diluizione si determina quindi calcolando il rapporto tra il volume di soluzione presente nella cellaed il volume dell aliquotadi oligoprelevata. Ad esempio prelevando 10 µl di campione, il fattore di diluizione sarà pari a: A = Assorbanza a 260 nm V = Volume (1 ml) b = cammino ottico (in cm) fd = fattore di diluizione

43 Determinazione quantitativa di acidi nucleici Una volta determinato il numero di OD del campione questo deve essere convertito in massa (numero di mg di campione). L assorbanza misurata dallo spettrofotometro UV, e quindi il numero di OD di campione presente, dipende dalla quantità di cromofori presenti in soluzione, quindi dal numero di anelli aromatici ed in ultima analisi dal numero di basi puriniche e pirimidiniche presenti nel campione oggetto dell analisi. Poiché l assorbanza specifica delle 4 basi è diversa, l assorbanza specifica dell oligonucleotide dipende dalla sequenza e va quindi determinata di volta in volta. OD = A V b fd A = Assorbanza a 260 nm V = Volume (1 ml) b = cammino ottico (in cm) fd = fattore di diluizione

44 Determinazione quantitativa di acidi nucleici Per fortuna su internet sono disponibili delle apposite applets che permettono di conoscere l assorbanza specifica di ogni sequenza e di determinare quindi la massa di campione corrispondente ad un determinato numero di OD OD = A V b fd A = Assorbanza a 260 nm V = Volume (1 ml) b = cammino ottico (in cm) fd = fattore di diluizione

45 Determinazione quantitativa di acidi nucleici

46 Determinazione quantitativa di acidi nucleici Naturalmente poiché lo stato di aggregazione dell oligonucleotide influenza il numero di OD calcolati (e quindi la determinazione quantitativa), il calcolo degli OD va eseguito in condizioni tali da garantirechetutto l oligosia presentecome single strand. In pratica l analisi viene eseguita ad una temperatura superiore alla temperatura di fusione dell oligo oggetto dell analisi. OD = A V b fd A = Assorbanza a 260 nm V = Volume (1 ml) b = cammino ottico (in cm) fd = fattore di diluizione

47 Additività dei coefficienti di estinzione molare T: ε= 7200 A: ε= 8000 ε ODN (260nm) = ε T + ε A = fatt. corr.

48 Effetto della strutturazione sul coefficiente ε Quale effetto ha la strutturazione in doppia elica (DNA duplex) sull ε? ε duplex < ε ss1 + ε ss2 La strutturazione in duplex ed il conseguente impilamento delle basi causano interazione tra gli elettroni π di basi diverse con conseguente riduzione del coefficiente di estinzione molare complessivo.

49 Determinazione della temperatura di fusione T m Poiché la formazione di strutture ordinate (duplex, triplex, quadruplex, etc) determina variazioni nell ε di sequenze oligonucleotidiche, la spettroscopia UV è utile per determinare le temperature di transizione tra le varie strutture. Ad esempio possiamo determinare la temperatura di melting (T m ) di uno specifico tratto di DNA duplex, ossia la temperatura alla quale il campione è presente al 50% sotto forma di duplex ed al 50% come filamento singolo. Tale misurazione è basata sull effetto ipercromico che si realizza nel momento in cui la doppia elica si disgrega dividendosi nei singoli filamenti che la costituiscono.

50 Determinazione della temperatura di fusione T m Poiché la formazione di strutture ordinate (duplex, triplex, quadruplex, etc) determina variazioni nell ε di sequenze oligonucleotidiche, la spettroscopia UV è utile per determinare le temperature di transizione tra le varie strutture. Ad esempio possiamo determinare la temperatura di melting (T m ) di uno specifico tratto di DNA duplex, ossia la temperatura alla quale il campione è presente al 50% sotto forma di duplex ed al 50% come filamento singolo. Tale misurazione è basata sull effetto ipercromico che si realizza nel momento in cui la doppia elica si disgrega dividendosi nei singoli filamenti che la costituiscono. Sperimentalmente si procede registrando l assorbanza a 260 nm a temperatura via via crescente. La T m è la temperatura del punto di flesso della curva A 260 /T

51 Determinazione della temperatura di fusione T m Poiché la formazione di strutture ordinate (duplex, triplex, quadruplex, etc) determina variazioni nell ε di sequenze oligonucleotidiche, la spettroscopia UV è utile per determinare le temperature di transizione tra le varie strutture. Sperimentalmente si procede registrando l assorbanza a 260 nm a temperatura via via crescente. La T m è la temperatura del punto di flesso della curva A 260 /T

52 Determinazione della temperatura di fusione T m Fusione di strutture di DNA a quadrupla elica (DNA quadruplex)

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