p rog e tto Studio Multicentrico Tipologia e frequenza delle varianti dell antigene D nella popolazione italiana
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- Severino Arrigo Carbone
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1 Studio Multicentrico Tipologia e frequenza delle varianti dell antigene D nella popolazione italiana
2 p r o g e t t o Indice Cap. 1 Presentazione e Scopo del Progetto Arcobaleno pag. 2 Cap. 2 Le Parti coinvolte nel Progetto pag. 2 Cap. 3 Tipologia dei Campioni pag. 2 Cap. 4 Flow-chart delle Fasi del Progetto pag. 4 Cap. 5 Indicazioni Generali di Navigazione pag. 4 Cap. 6 Le attività dell UTENTE 6.1 Visualizzare ELENCO ANALISI inserite pag Inserire una nuova ANALISI pag. 8 Cap. 7 Contatti e Riferimenti pag Servizio di Triangolazione pag. 15
3 1 Presentazione e Scopo del Progetto Arcobaleno L antigene D, scoperto nel 1939 da Levine & Stetson successivamente agli antigeni A e B, è il più immunogeno e il più importante nella pratica trasfusionale. Si tratta di un polipeptide di grandi dimensioni (417 aminoacidi), trans-membrana, che presenta un elevato numero di epitopi. Queste sue caratteristiche fanno sì che possa essere espresso sulla membrana eritrocitaria con modalità qualitativamente e quantitativamente variabili, originando, di conseguenza, differenti fenotipi D deboli o parziali. L osservazione sierologica e molecolare dell antigene ha consentito di distinguere un espressione quantitativamente ridotta dell antigene completo (D debole o D weak) rispetto a un espressione qualitativamente carente, in cui l antigene esprime meno epitopi rispetto alla forma completa. Queste varianti qualitative sono note come D variant o D mosaic o D parziali e rivestono una grossa importanza in ambito trasfusionale. Scopo di questo studio è rilevare ed evidenziare la tipologia e la frequenza di queste varianti dell antigene D nella popolazione afferente ai S.I.T. italiani aderenti al progetto, nell ottica di prevenire alloimmunizzazioni in seguito a trasfusione e/o gravidanza. CASO A Campione: + (risultati concordanti) Controllo: - Anticorpi Anti-D (c) Scheda Anamnestica (a) 2 Antisieri monoclonali di classe IgM (b) CASO B Campione: -/weak/+/dubbio Controllo: - Fig. 1 Fasi del Progetto. CASO C Campione: -/weak/+/dubbio Controllo: +/weak/dubbio Test di Coombs diretto (d) 2 Le Parti coinvolte nel Progetto GESTORE: è il coordinatore e amministratore del servizio; fornisce le password di accesso al sito agli utenti; ha una visione generale di tutti gli utenti coinvolti e delle relative analisi inserite; può fungere esso stesso da utente per inserire le analisi dei propri pazienti; può apportare correzioni ad analisi già completate da qualsiasi altro utente. UTENTE: è il centro che inserisce sul sito le analisi dei pazienti afferenti alla sua struttura. No Analisi Completata = Rh D+ Sì Ricerca D weak (e) Campione: -/weak/+/dubbio Controllo Pos: weak /+/dubbio Controllo Neg: - Campione: - Campione: weak/+/dubbio Escludere campione dallo studio 3 Il Progetto D Parziale è ospitato sul portale Tipologia dei Campioni Campioni negativi con antisieri monoclonali Anti-D IgM e/o blend e positivi con antisieri policlonali anti-d IgG dopo TCI; Campioni D positivi con alloac anti-d; Campioni con comportamento sierologico discrepante e/o debole reattività con diversi antisieri. Tutte le analisi devono essere condotte su campioni di sangue intero, raccolto in EDTA e conservato a +4 C per non oltre 7 giorni dal prelievo. Ulteriore tipizzazione in fase liquida: (f) almeno 1 altro clone IgM un Anti-D policlonale un Anti-D blended Tutti i campioni Tipizzazione sierologica avanzata (g) Tipizzazione genomica (h) (PCR-SSP) 2 3
4 4 5 I campioni che devono essere sottoposti a test di biologia molecolare, se non utilizzati entro 7 giorni, devono essere conservati a -30 C (come sangue intero). I campioni che devono essere inviati presso altri laboratori per approfondimenti devono essere raccolti in un volume pari ad almeno due provette di sangue intero in EDTA, per un totale di circa 10 ml. Flow-chart delle Fasi del Progetto (Fig. 1) Per controllo si intende il test negativo e/o positivo che viene eseguito intratest per verificare l accettabilità del risultato finale. Se un controllo positivo ha un risultato diverso da weak/+/dubbio è sempre invalido e l inserimento deve essere bloccato. Se un controllo negativo ha un risultato diverso da negativo è sempre invalido e l inserimento deve essere bloccato (tranne che nel percorso CASO C). Indicazioni Generali di Navigazione Ordinare gli elementi di un elenco: è possibile scegliere l ordine (crescente /decrescente ) degli elementi che compongono un elenco, sulla base delle classi presentate. Ad es. in ELENCO ANALISI, gli Utenti possono elencare in ordine crescente o decrescente le proprie analisi secondo il Codice paziente, l Età del paziente, la Diagnosi o le analisi completate (Ins. Comp.) e così via. Funzione Filtro: è possibile selezionare da un elenco solo gli elementi con una o più caratteristiche comuni; compilando o selezionando i campi di interesse nell area a sfondo grigio e cliccando poi Filtro (Fig. 2), verranno estrapolati solo gli elementi con le caratteristiche richieste. Ad es. in ELENCO ANALISI, selezionando Sesso F e Trasfusioni Sì, si estrapoleranno dall elenco solo le analisi dei pazienti con quelle caratteristiche. Sistema di paginazione: per elenchi molto lunghi gli elementi vengono suddivisi in più pagine. Per navigare tra le pagine selezionare >>successivo o <<precedente, posizionati in basso a destra dell elenco. Tasto Salva e Salva e Prosegui: il tasto Salva, presente solo nella scheda anamnestica, permette di salvare i dati appena immessi di un nuovo paziente e di interrompere temporaneamente l inserimento. Questa opzione è molto utile se si desidera proseguire con l inserimento dei risultati in un secondo momento (ad es. quando i risultati delle analisi saranno disponibili). Il tasto Salva e Prosegui, invece, presente in tutte le pagine della scheda raccolta dati, permette di salvare i dati appena inseriti e procedere alla compilazione delle pagine successive (Fig. 3). Tasto Modifica: è possibile modificare i dati relativi a un analisi. Gli Utenti possono modificare autonomamente i dati dei propri pazienti. Questa funzione è molto utile poiché consente di compilare e completare il profilo dei dati sul sito in momenti successivi. Gli Utenti perderanno però questa funzionalità nel momento in cui un analisi risulterà conclusa: ad analisi completata potranno solo richiederne la cancellazione. È estesa esclusivamente al Gestore, invece, non solo la possibilità di modificare il dettaglio dati Analisi, ma anche il dettaglio dati Utenti. Tasto Elimina: solamente il Gestore ha la possibilità di eliminare un Utente dall elenco, solo se questo non ha ancora inserito alcuna analisi, oltre che di eliminare le analisi stesse. La funzione di eliminazione non è mai attiva per gli Utenti. Fig. 2 Attraverso la funzione Filtro è possibile estrapolare dall elenco solo le analisi dei pazienti con le caratteristiche richieste. Fig. 3 Dalla compilazione della scheda anamnestica è possibile procedere all inserimento dei dati selezionando la funzione salva e prosegui. La funzione salva permette di salvare i dati appena immessi e di interrompere temporaneamente l inserimento. 4 5
5 6 Tasto Stampa: è sempre possibile stampare un elenco. Si consiglia di visualizzare l Anteprima di stampa per accertarsi che tutti gli elementi siano compresi (Barra Menu: File\Anteprima di stampa). Logout: per uscire dal sito cliccare Logout in alto a destra della pagina web e premere conferma alla richiesta. 6 Le attività dell UTENTE I centri italiani aderenti al progetto ricevono dal Gestore le password per accedere all area web dedicata al Progetto D Parziale. L Utente deve quindi accedere al sito inserire username e password ed effettuare il login (Fig. 4). Selezionando una delle due sezioni dal Menu (nella home page a sinistra) l Utente può effettuare le seguenti attività: Visualizzare ELENCO ANALISI inserite In questa sezione l Utente visualizza tutte le proprie analisi con i relativi dettagli riportati nella scheda anamnestica (età, sesso, diagnosi, terapia, etc). Inoltre, l Utente ha la possibilità di inserire una nuova analisi cliccando Aggiungi e procedendo alla compilazione della scheda raccolta dati (Cap. 6.2). L informazione di analisi completata è rilevabile dal colore dell analisi stessa (completa in nero, incompleta in rosso) oppure dall indicazione riportata nella colonna Ins. Comp. (= Inserimento Completato) che il sistema definisce automaticamente sulla base dei dati inseriti. L ultima colonna a destra (Rich. Canc. = richiesta di cancellazione) riporta la scelta di cancellazione di quella specifica analisi da parte dell Utente (Fig. 5). Fig. 6 Per ogni analisi inserita è possibile visualizzare i dati immessi (percorso A), modificare o aggiungere dati oppure richiedere la cancellazione dell analisi stessa (percorso B). Fig. 4 Per accedere al sito effettuare il login inserendo username e password. Fig. 5 Nell elenco delle analisi inserite compariranno in nero quelle complete e in rosso quelle incomplete. L area evidenziata sulla destra indica lo stato delle analisi. 6 7
6 Cliccando sulla freccia ( ) relativa a ogni analisi, l Utente può visualizzare il DETTAGLIO DATI ANALISI, con la possibilità di: prendere visione dei dati già inseriti, cliccando Altri Dati Analisi e successivamente Prosegui per scorrere tra le pagine (Fig. 6 percorso A); richiedere la cancellazione di un analisi, cliccando Modifica e selezionando nell area di gestione la casella relativa, specificandone il motivo nelle Note sottostanti (Fig. 6 percorso B); modificare/aggiungere i dati, selezionando Modifica e correggendo i campi interessati (Fig. 6 percorso B). Se i dati da modificare riguardano esclusivamente la scheda anamnestica, dopo aver apportato la correzione cliccare Salva; se, diversamente, i dati da modificare appartengono a schede successive, scorrere, cliccando Salva e Prosegui, fino alla pagina da modificare. Variando i dati delle analisi di un paziente, varia anche il suo percorso di analisi richieste dal protocollo e quindi di pagine da compilare. Fino a che l analisi non risulta completata sarà possibile sempre modificarne i dati. Una volta che le analisi risultano completate, le pagine precedentemente compilate e non più valide, verranno automaticamente eliminate dal sistema. Tuttavia, sarà ancora possibile correggere i dati per analisi concluse comunicandoli direttamente al Gestore (Cap.7). La mancata compilazione dei campi obbligatori, contrassegnati dal simbolo *, non permette di passare allo step successivo (procedendo nella compilazione appare una finestra con segnalazione di ERRORE). Di seguito gli step della compilazione: il Centro comparirà di default ed è associato univocamente alla password di accesso; il Codice Paziente è un campo obbligatorio ma libero (è possibile immettere lettere e/o numeri). Si consiglia di non utilizzare l anagrafica del paziente. a - SCHEDA ANAMNESTICA (Fig. 7) L Età e il Sesso del paziente; la Diagnosi/Condizione Clinica, ad es. anemia aplastica, ulcera sanguinante, etc; la Terapia farmacologica eventuale; le Condizioni del campione sul quale si sono condotte le analisi, ad es. normale, lipemico, itterico, emolizzato, etc. Precedenti Trasfusioni e Gravidanze/aborti: se note selezionare Sì/No altrimenti lasciare campo bianco; Una o due precedenti Determinazioni fenotipo Rh: indicare fenotipo antigeni CcEe, Rh D Pos/Neg/ D u -D weak; Presenza di anticorpi anti-d (Sì/No). Fig Inserire una nuova ANALISI (INSERIMENTO ANALISI) In questa sezione l Utente ha accesso direttamente alla compilazione della scheda anamnestica di un nuovo paziente. (Una possibilità alternativa è dall ELENCO ANALISI riportata al Cap. 6.1). Accedendo all area Inserimento Analisi si visualizza la scheda anamnestica. Codice paziente, data e ora del prelievo sono campi obbligatori. Informazioni relative al campione (campi obbligatori): Data e Ora del prelievo. Indicare la data nella forma gg/mm/aaaa e l ora nella forma hh:mm. Il sistema segnala con un messaggio di ERRORE se i campi non sono compilati in maniera congrua (ad es. ora non valida, gravidanza associata a paziente maschio, etc.). Dopo aver inserito queste informazioni, cliccare Salva se si desidera continuare l inserimento in un momento successivo, cliccare invece Salva e Prosegui se si desidera continuare immediatamente la compilazione delle pagine successive (b). b - RISULTATI AGGLUTINAZIONE DIRETTA - step 1 (Fig. 8) I campi di questa sezione, ad eccezione del produttore del siero, sono obbligatori e se non debitamente compilati non permettono l accesso alle pagine successive (messaggio di ERRORE). Selezionare la Tecnologia utilizzata per questa analisi: provetta, microcolonna, fase solida, micropiastra, agglutinoscopio o E.M. Tech. Diagast. Riportare i risultati di tipizzazione sierologica del campione avendo utilizzato due sieri Anti-D monoclonali IgM, come segue: 1 e 2 Anti-D IgM: selezionare dalla tendina il risultato ottenuto tra le diverse proposte (NEG, weak, POS, 1+, 2+, 3+, 4+, dubbio); 8 9
7 Produttore Anti-D 1 e 2: selezionare dalla tendina il produttore del siero utilizzato a scelta tra Biotest, Dasit, Diagast, Diamed, Formedic, Immucor, Menarini, Ortho-Clinical D., Pieco; Rh-Control (siero di controllo NEG): selezionare tra NEG, weak, POS, 1+, 2+, 3+, 4+, dubbio. Eventualmente completare il campo Note e proseguire. Le reazioni di agglutinazione diretta prodotte da Galileo hanno l aspetto di normali reazioni di agglutinazione in micropiastra. Proprio per le caratteristiche dell antigene, ci si può attendere che alcune espressioni dell antigene D mostrino agglutinati di aspetto differente con l utilizzo di diversi cloni di Anti-D. I possibili risultati sono: CASO A: se i campioni sono risultati positivi concordanti e con controllo negativo, si procede alla ricerca di anticorpi Anti-D nel campione (c); CASO B: se i campioni sono risultati negativi/weak/positivi/dubbi e con controllo negativo, si procede con la metodica D weak (e); CASO C: se i campioni sono negativi/weak/positivi/dubbi, ma con controllo positivo/weak/dubbio, si passa al test di Coombs diretto (d). c - PRESENZA DI ANTICORPI ANTI-D NEL CAMPIONE Rispondendo No, si conclude l inserimento (= analisi completata, che corrisponde a refertazione Rh D Positivo). Rispondendo Sì, si procede con la metodica D weak (e). d - TEST DI COOMBS DIRETTO (DAT) (Fig. 9) Sui campioni che hanno riportato un test di controllo weak/positivo/dubbio allo step 1 (b) è necessario eseguire un test diretto all antiglobulina (DAT). Se il risultato del test sul campione si conferma weak/positivo/dubbio, bisogna escludere il campione dal progetto e approfondire il caso clinico. Il campione permarrà comunque nell elenco analisi, pertanto si consiglia di richiederne la sua cancellazione per motivi di sicurezza (vedi come richiedere la cancellazione di un analisi, Cap.6.1). Se il risultato del test sul campione è negativo, si procede con la metodica D weak (e). e - RISULTATI RICERCA D u (D WEAK) (Fig. 10) Compilare i campi della pagina inserendo il Produttore, la Tecnologia utilizzata, il risultato del Campione (unico campo obbligatorio), del Controllo Positivo e del Controllo Negativo. Completare eventualmente il campo Note e proseguire. Fig. 9 Inserire il risultato del test di Coombs diretto. Fig. 8 Fig. 10 É necessario inserire i risultati del test di agglutinazione diretta (1 e 2 Anti-D IgM e relativo controllo). Inserire il risultato della ricerca del test D weak eseguito sul campione e sui controlli
8 Le reazioni interpretate come negative nel test Capture devono avere l aspetto di un bottone di emazie compatto sul fondo del pozzetto. Le reazioni positive, invece, sono evidenziate con un area di adesione delle emazie su parte o su tutto il fondo del pozzetto (Fig. 11). Qualsiasi sia il risultato di questo test si può procedere con un ulteriore tipizzazione sierologica (f). f - ULTERIORI INDAGINI SIEROLOGICHE (Fig. 12) In questo test è necessario specificare almeno 2 tipizzazioni sierologiche aggiuntive utilizzando almeno un clone anti-d IgM (diverso dai precedenti) e una determinazione con Anti-D IgM+IgG (blended) o una determinazione Anti-D policlonale. Ad esempio: I Anti-D IgM: produttore (a scelta tra Biotest, Dasit, Diagast, Diamed, Formedic, Immucor, Menarini, Ortho-Clinical D., Pieco); I Anti-D IgM: metodica (provetta, microcolonna, fase solida, micropiastra, agglutinoscopio o E.M. Tech. Diagast); I Anti-D IgM: risultato (NEG, weak, POS, 1+, 2+, 3+, 4+, dubbio); I Anti-D blended: produttore; I Anti-D blended: metodica; I Anti-D blended: risultato 37 ; I Anti-D blended: risultato TAI. Per tutti questi campioni è possibile, nella scheda successiva, inserire il risultato di un eventuale ricerca di anticorpi anti-d (approfondimenti: presenza di anticorpi anti-d nel campione). Si procede poi con la tipizzazione degli epitopi utilizzando kit in sierologia (g) e in biologia molecolare (h), a conferma del risultato sierologico. Fig. 13 Inserire i risultati delle prime sei tipizzazioni eseguite sul campione. Fig. 11 Reazioni del test Capture, Provetta, Microcolonna: A. Positivo forte: 4+ B. Positivo debole: 2+/3+ C. Negativo Fig. 12 Inserire almeno due tipizzazioni sierologiche aggiuntive
9 Fig. 14 Inserire il produttore, l interpretazione e le eventuali note del test PCR-SSP, a conferma del test sierologico. g IDENTIFICAZIONE EPITOPI DELL ANTIGENE D (Fig. 13) Specificare il Produttore e la Tecnologia impiegata, nonché i risultati almeno delle prime 6 tipizzazioni (Serum1-6). È possibile inserire anche i risultati di altri 6 sieri tipizzati (Serum 7-12), di un ulteriore test di Coombs diretto (DAT), di un Autocontrollo e di due ulteriori tipizzazioni eseguite con Immuclone Anti-D duo, Novaclone IgG+IgM. I risultati negativi appariranno in rosso quando visualizzati. Proseguire con test PCR-SSP di conferma. h TIPIZZAZIONE GENOMICA (PCR-SSP) (Fig. 14) Selezionare il Produttore tra le proposte (Bag-Formedic, Spectra Biologicals- Pieco, S-Medical) e completare il campo Interpretazione e Note. Proseguendo si può dare conferma di analisi completata. 7 - Contatti e Riferimenti Per qualsiasi chiarimento e/o modifica a un analisi conclusa si prega di rivolgersi al Gestore: IMMUCOR ITALIA spa Via E. Bugatti, Milano Tel fax Dr.ssa Silvia Ferrari Product Manager e Coordinatore dello Studio sferrari@immucor.com Dr.ssa Erika Braghieri Marketing and Project Assistant ebraghieri@immucor.com Dr.ssa Antonella Matteocci Responsabile Scientifico e Coordinatore dello Studio antonella.matteocci@virgilio.it Per chiarimenti circa l utlizzo del sito contattare: Dr.ssa Alessandra Favalli Realizzatore nominale dello Studio alessandra.favalli@multimedia.it Servizio di Triangolazione Gli Utenti hanno la possibilità di inviare i campioni presso laboratori specialistici, attraverso il SERVIZIO DI TRIANGOLAZIONE. Questo servizio consiste nel ritiro dei campioni presso un centro partecipante e nella consegna degli stessi presso il laboratorio che effettuerà le analisi, tramite l utilizzo un corriere specializzato (TNT Traco). Per richiedere il servizio l Utente dovrà chiamare direttamente il Gestore (Immucor) comunicandogli dettagliatamente le seguenti informazioni: indirizzo completo presso cui effettuare il ritiro (utente); nomi dei referenti al momento del ritiro; indirizzo completo presso cui effettuare la consegna (laboratorio); nomi dei referenti al momento della consegna; numero di colli da trasportare; 14 15
10 peso totale dei colli; orario e giorno nel quale effettuare il ritiro. L Utente, a questo punto, nel caso ne fosse sprovvisto, riceverà dal Gestore un box di trasporto nel quale inserire i campioni che dovrà consegnare al corriere. Il servizio è totalmente gratuito. L Utente dovrà, inoltre, presentare al corriere al momento del ritiro, una dichiarazione su carta intestata del proprio Ente che riporti esattamente il numero di provette da trasportare e la dicitura Campioni biologici per ulteriori indagini sierologiche. Per usufruire del Servizio di Triangolazione l Utente deve avanzare la richiesta al Gestore una settimana prima della data del ritiro
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Direttore Dr.ssa Tiziana Riscaldati. SIMT-POS 029 Criteri di Refertazione
1 1 2 1 SCOPO.Scopo della Presente Procedura è quello di indicare i criteri utilizzati presso il laboratorio di Immunoematologia del SIMT di Viterbo 2 CAMPO D APPLICAZIONE La presente procedura si applica
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