Chimica Biologica A.A Cinetica Enzimatica. Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

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1 Chimica Biologica A.A Cinetica Enzimatica Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Macromolecole Biologiche Cinetica Chimica Termodinamica: fornisce informazioni sulla spontaneità e sulle condizioni di equilibrio di una reazione (che dipendono dalle caratteristiche di reagenti e prodotti) Cinetica chimica: fornisce informazioni sulla velocità con cui una reazione avviene (questa dipende dalle modalità con cui una reazione avviene, ovvero dal meccanismo di reazione)

3 Macromolecole Biologiche Cinetica Chimica Cinetica chimica reazione con stechiometria totale: A P A reagenti P prodotti A I 1 I 2 P I intermedi di reazione - una qualsiasi reazione, per quanto complessa, può essere scomposta in una serie di reazioni elementari - l insieme di questi passaggi rappresenta il meccanismo di quella reazione - per una reazione elementare la velocità dipende in maniera semplice dalla concentrazione dei reagenti (legge di velocità): aa + bb + zz P v = k[a] a [B] b [Z] z

4 Macromolecole Biologiche Cinetica Chimica Cinetica chimica aa + bb + zz P v = k[a] a [B] b [Z] z v: velocità istantanea di comparsa del prodotto e scomparsa del reagente k: costante di velocità - Ordine di una reazione : grado algebrico della legge di velocità - Molecolarità: numero di molecole che devono collidere per dar luogo alla reazione - per una reazione elementare l ordine corrisponde con la molecolarità

5 Cinetica Chimica Cinetica chimica - reazione del primo ordine: A P velocità della reazione v = d[p]/dt = -d[a]/dt = k[a] T = cost - v (Ms -1 ) k = costante di velocità (primo ordine) (s -1 )

6 Cinetica Chimica Cinetica chimica - reazione del secondo ordine: 2A P velocità della reazione v = d[p]/dt = -d[a]/dt = k[a] 2 T = cost - v (Ms -1 ) k = costante di velocità (secondo ordine) (M -1 s -1 ) - reazione del secondo ordine: A + B P v = d[p]/dt = -d[a]/dt = -d[b]/dt = k[a][b] T = cost - reazione del secondo ordine totale, del primo ordine per [A] e per [B] - le reazioni trimolecolari sono rare

7 Cinetica Chimica Cinetica chimica Equazione di velocità - descrive il progredire di una reazione nel tempo - reazione del primo ordine: v = -d[a]/dt = k[a] [A] t d[a]/[a] = - k dt d ln[a] = -k dt d ln[a] = -k dt [A 0 ] ln[a] - ln[a 0 ] = -kt eq. lineare [A] = [A 0 ] exp (-kt) 0

8 Cinetica Chimica Cinetica chimica - reazione del secondo ordine: v = -d[a]/dt = k[a] 2 [A] -d[a]/[a] 2 = k dt - d [A]/[A] 2 = k dt [A 0 ] 1/[A] = 1/[A 0 ] + kt equazione lineare - costruendo i grafici di ln [A] e di 1/[A] in funzione di t si distinguono le reazioni del primo e secondo ordine (quale delle 2 è lineare) e si determina la costante di velocità - reazione del secondo ordine: A + B P se [B]>>[A] pseudo-reazione del primo ordine rispetto ad A ([B] cost. durante la reazione) analogamente per B t 0

9 Cinetica Chimica Cinetica chimica t 1/2 (emivita o tempo di dimezzamento) tempo necessario affinché metà del reagente si sia trasformato in prodotto - reazione del primo ordine: t 1/2 costante, indipendente da [A 0 ] ln[a] - ln[a 0 ] = -kt ln (1/2) = -k t t 1/2 1/2 = (ln 2)/k = 0.693/k - le sostanze instabili (nuclei radioattivi) si decompongono con reazioni del primo ordine - reazione del secondo ordine: t 1/2 dipende da [A 0 ] 1/[A] = 1/[A 0 ] + kt t 1/2 = 1/k [A 0 ]

10 Reazione catalizzata da enzimi: (reazioni ad 1 substrato) curva di saturazione del substrato Cinetica enzimatica -[S] bassa v proporzionale ad [S] - [S] aumenta v non aumenta proporzionalmente ad [S] - [S] alta v indipendente da [S] effetto di saturazione ogni molecola di enzima ha il sito di legame del substrato occupato da S reazione del primo ordine non catalizzata

11 quindi quando [S] è elevata la v diventa inipendente da [S], cioè è di ordine zero rispetto al substrato la reazione può essere pensata divisa in 2 reazioni elementari: k i = costanti di velocità per le reazioni k 1 k 2 E + S ES E + P Assunzione 1) - l enzima E ed il substrato S si associano reversibilmente a formare il complesso enzima-substrato ES ( complesso di Michaelis ) k -1 - il prodotto P si forma in un secondo momento, quando ES si rompe a dare E + P - se [S] è elevata, tutto l enzima è nella forma ES la seconda tappa limita la velocità di reazione, che sarà insensibile ad aumenti di [S] k -2

12 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 Assunzione 2): la seconda reazione sia irreversibile misure di velocità iniziale v 0 -v 0 si ha fintanto che <10% del substrato è stato trasformato in prodotto (cioè prima che P si accumuli, visto che la velocità inversa è prop. a [P]) si minimizzano gli effetti delle reazioni reversibili (inibizione da parte del prodotto e progressiva inattivazione)

13 Teoria di Michaelis-Menten k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 Cinetica Enzimatica - Equazione di Michaelis-Menten velocità di reazione: v = d[p]/dt = k 2 [ES] velocità di formazione del prodotto [ES] = conc. intermedio precedente k 2 = costante di velocità d[es]/dt = k 1 [E][S] k -1 [ES] k 2 [ES] velocità complessiva di produzione di ES Per integrarla occorre fare alcune assunzioni

14 Assunzione dello stato stazionario: se [S]>>[E] (quasi sempre vero in condizioni fisiologiche) d[es]/dt = 0 (la velocità di sintesi e di consumo di ES sono uguali) dopo pochi ms

15 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 (stato stazionario) d[es]/dt = k 1 [E][S] k -1 [ES] k 2 [ES] = 0 k 1 [E][S] = [ES] (k -1 + k 2 ) K M = costante di Michaelis (k -1 + k 2 ) [E][S] K M = = = [ES] k 1 [E T ] - [ES] [ES] [S] dove [E T ] = [E]+[ES] [ES] = [E] T [S] K M + [S]

16 [ES] = [E] T [S] K M + [S] [E T ] facilmente misurabile, [E] ed [ES] non direttamente misurabili v 0 = d[p]/dt t=0 = k 2 [ES] v 0 = k [E] 2 T [S] KM + [S] V MAX = k 2 [E] T velocità massima di una reazione (quando l enzima è totalmente nella forma ES ed [S] è elevata) Eq. di Michaelis-Menten v 0 = V MAX [S] K M + [S] iperbole rettangolare

17 v 0 = V MAX [S] K M + [S] -v 0, in qualsiasi istante, è determinata dal rapporto fra 2 costanti (K M e V MAX ) e la concentrazione del substrato [S] in quell istante - se [S] = K M v 0 = V MAX /2 definizione operativa di K M K M è la conc. del substrato per cui la velocità della reazione è metà di quella massima

18 dalla curva di saturazione del substrato si possono ricavare V MAX e K M ma solo in modo approssimato necessarie [S] troppo elevate (v = 0.99 V MAX se [S] = 99 K M ) [S] >> K M v = V MAX (indipendente da [S] cinetica di ordine 0) [S] < K M v = k [S] con k = V MAX /K M cinetica del primo ordine) -K M unico per ciascuna coppia enzima-substrato -K M diverso per diversi substrati che reagiscono con lo stesso enzima -K M dipende da T e ph

19 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k -1 (k -1 + k 2 ) k K M = = + 2 k = K S + 2 k 1 k 1 k 1 k 1 k KS = -1 costante di dissociazione del complesso di Michaelis ES k 1 Se K S diminuisce aumenta la affinità dell enzima per il substrato k 2 k 1 Se KS >> cioè k 2 < k -1 K M è anche una misura di affinità dell enzima per il suo substrato (assunzione dell equilibrio, perché la reazione ES P più lenta di ES E+S, cioè prima che la reazione ES P proceda si è creato un equilibrio fra [ES] e [E][S])

20 Riassumendo: K M e V max, una volta noti, definiscono la velocità della reazione enzimatica ammesso che: 1) la reazione coinvolga un solo substrato (in casi multisubstrato varia solo la conc. di un substrato e gli altri sono tenuti costanti) 2) la reazione ES E+P è irreversibile (o esperimento limitato a quando [P]=0) 3) vale l assunzione dello stato stazionario. Vero se [S 0 ]>[E T ] ed [E T ] costante 4) T, ph, forza ionica ecc che possono influenzare la velocità di reazione sono mantenute costanti - l analisi cinetica dello stato stazionario non è in grado di stabilire in modo certo il meccanismo di reazione. - in particolare non è in grado di definire natura e numero di intermedi, che devono essere determinati in altro modo (es: tecniche spettrofotometriche)

21 Numero di turnover ed efficienza catalitica Si definisce la costante catalitica k cat = V MAX [E] T numero di turnover - numero di molecole di substrato convertite in prodotto (numero di processi di reazione) per molecola di enzima per unità di tempo quando l enzima è saturato con il substrato -k cat ha le dimensioni del reciproco di un tempo (s -1 ) ES Ciclo catalitico dell enzima S E P

22 Numero di turnover ed efficienza catalitica numero di turnover k cat = V MAX [E] T - misura della massima attività catalitica - nel modello di reazione di Michaelis-Menten k cat = k 2 essendo V MAX = k 2 [E] T - per [S] saturanti, nota V MAX ed ammesso sia nota la [E T ] nella miscela di reazione si può calcolare k cat, che è una costante, mentre V MAX dipende dalla concentrazione dell enzima (cresce al crescere di [E T ])

23 Numero di turnover ed efficienza catalitica - in condizioni fisiologiche [S] è raramente saturante (in vivo [S]/K M ~ i siti attivi spesso non sono saturati dal substrato) - si usa il rapporto k cat /K M come indice dell efficienza catalitica per enzimi che rispettano la cinetica di Michaelis-Menten ed operano al di sotto della saturazione -se[s]<<k M si formerà poco complesso ES [E] ~ [E] T Cinetica Enzimatica v 0 ~k [E] 2 T [S] KM + [S] k cat v 0 ~ KM [E] [S] k cat /K M costante di velocità del secondo ordine apparente per la reazione di E ed S a formare il prodotto la velocità della reazione varia direttamente in base a quanto spesso l enzima incontra il substrato

24 Numero di turnover ed efficienza catalitica k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 K M = (k -1 + k 2 ) k 1 k k cat = 1 k 2 (k + k ) -1 2 K M k1 - la decomposizione di ES in E + P non può avvenire più frequentemente di quanto E ed S si incontrino per formare ES l efficienza catalitica di un enzima non può essere superiore alla velocità (controllata dalla diffusione) con cui E ed S si combinano a dare ES - gli enzimi più efficienti hanno k cat /K M intorno a 10 8 M -1 s -1 (catalizzano una reazione quasi ogni volta che l enzima incontra il substrato Perfezione catalitica )

25 Analisi dei dati Cinetici Cinetica Enzimatica v 0 = V MAX [S] K M + [S] dalla curva di saturazione si ha solo una stima approssimata di V MAX e K M a causa dell andamento asintottico della curva (v 0 = 0.91 V MAX se [S] = 10 K M ) sottostima di V MAX

26 Grafico dei doppi reciproci (Lineweaver-Burk) v 0 = V MAX [S] K M + [S] 1 v 0 K M 1 = + [S] V MAX 1 V MAX - migliori misurazioni ottenute fra 0.5 K M < [S] < 5 K M - importante rappresentazione visiva dati cinetici Es: non-linearità se cinetica Michaelis-Menten (enzimi allosterici) - problemi: per [S] piccoli, piccoli errori in v o risultano in grossi errori in 1/v o punti sper. concentrati (affollamento per [S] grandi)

27 Reazioni a 2 substrati - di solito gli enzimi catalizzano reazioni in cui sono coinvolti 2 o più substrati e portano alla formazione di prodotti multipli - reazioni a 2 substrati (e 2 prodotti): (~60% delle reazioni enzimatiche conosciute) la maggior parte: - reazioni di trasferimento di un gruppo funzionale - reazioni di ossido-riduzione (trasferimento equivalenti riducenti tra i 2 substrati) E A + B P + Q E P-X + B P + B-X - 2 possibili reazioni: (a) Reazioni sequenziali (o a sostituzione singola ) (b) Reazioni a ping-pong (o a doppia sostituzione ) - Reazioni multisubstrato: si scompone la reazione in una serie di stadi ciascuno dei quali obbedisce a meccanismi a singola o doppia sostituzione

28 Reazioni sequenziali - tutti i substrati si devono combinare con l enzima prima che possa avvenire la reazione e che vengano rilasciati i prodotti E + A + B AEB PEQ E + P + Q - sostituzione singola perché il gruppo X verrebbe trasferito direttamente da A (P-X) a B formando P e Q (B-X) - 2 possibili meccanismi: (a) Meccanismo ordinato (b) Meccanismo casuale

29 Reazioni sequenziali (a) Meccanismo ordinato nomenclatura di Cleland addizione rilascio enzima - ordine obbligato di addizione dei substrati all enzima (esiste un substrato primario il cui legame può favorire il legame per il secondo substrato) Esempio: molte deidrogenasi NAD + o NADP + dipendenti usano il coenzima come substrato primario

30 (b) Meccanismo casuale Reazioni sequenziali - entrambi i siti di legame per i substrati sono presenti nell enzima libero e non c e un substrato primario che si deve legare prima Esempio: molte chinasi operano con un meccanismo a 2 substrati casuale (un substrato è l ATP)

31 Reazioni a ping-pong -il substrato A reagisce con l enzima dando il prodotto P ed una forma modificata F dell enzima E -il substrato B interagisce con F dando il prodotto Q rigenerando E E + A AE FP F FB E + Q P B A e B non si incontrano mai sull enzima - doppia sostituzione perché il gruppo X verrebbe trasferito da A (P-X) prima ad E (F = E-X) e poi a B formando Q (B-X) Esempio: la tripsina usa un meccanismo a ping-pong con F = acil-enzima