Adattamento dei microrganismi alle differenti condizioni ambientali

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1 Adattamento dei microrganismi alle differenti condizioni ambientali Adattamento fisiologico Variazione dell espressione genica in risposta a segnali ambientali (temperatura, ph, disponibilità di nutrienti, osmolarità, ecc). Coinvolge tutte o quasi tutte le cellule di una popolazione microbica Adattamento genetico Risposta a variazioni ambientali drastiche al punto da rallentare o impedire la crescita di una popolazione microbica. Variazione del genoma a causa di eventi rari e spontanei (mutazione o acquisizione di DNA esogeno) che producono tipi cellulari varianti (mutanti o ricombinanti). Coinvolge una o poche cellule della popolazione

2 Adattamento fisiologico: regolazione dell espressione genica Gene espresso Attività Traduzione enzimatica Trascrizione

3 REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Regolazione negativa: la sintesi dell mrna è inibita da uno specifico repressore che è a sua volta controllato da un induttore (INDUZIONE) o da un corepressore (REPRESSIONE) Sistemi catabolici (es: operone lac) Sistemi anabolici (es: operone arg) Regolazione positiva: la sintesi dell mrna è attivata da uno specifico attivatore (ATTIVAZIONE) che è a sua volta controllato da un induttore o effettore (es: operone mal)

4 REGOLAZIONE NEGATIVA DELLA TRASCRIZIONE: Operone argcbh: un sistema reprimibile traduzione arg (arg)

5 REGOLAZIONE NEGATIVA DELLA TRASCRIZIONE: Operone laczya: un sistema inducibile (allolattosio)

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7 REGOLAZIONE POSITIVA DELLA TRASCRIZIONE: Operone malefg (maltosio)

8 Adattamento fisiologico: REPRESSIONE DA CATABOLITA (un sistema di controllo globale) Un meccanismo di regolazione dell espressione genica che impedisce l espressione di geni preposti alla sintesi di enzimi catabolici in presenza di fonti di carbonio velocemente metabolizzabili Permette alla cellula batterica di coordinare e ottimizzare l utilizzo di diverse fonti di carbonio quando queste sono contemporaneamente disponibili nell ambiente circostante

9 CRESCITA DIAUXICA

10 REPRESSIONE DA CATABOLITA In Escherichia coli (Gram -) Sistema di regolazione positiva mediata dalla proteina allosterica CAP, Catabolite Activator Protein (o CRP, Cyclic AMP Receptor Protein) -Glucosio >camp >complesso CAP-cAMP Trascrizione attivata + glucosio < camp < complesso CAP-cAMP Trascrizione non attivata camp CAP CAP camp camp CAP CAP Gene catabolico Trascrizione attivata camp camp x Trascrizione non attivata (REPRESSIONE DA CATABOLITA) Gene catabolico

11 AMP ciclico

12 TRASPORTO ATTIVO: TRASLOCAZIONE DI GRUPPO Energia fornita dal gruppo fosfato

13 Attivazione di proteine con funzione di regolatori globali: Gram-negativi CAP (catabolite gene activator protein) (- glucosio) (+ glucosio) IIA glc IIA glc Adenilato ciclasi (inattiva) (attiva) PEP Piruvato I, HPr Adenilato ciclasi IIA glc Zucchero-P IIBC Zucchero P Adenilato ciclasi (inattiva) Adenilato ciclasi (inattiva) PEP Piruvato I, HPr IIA glc Zucchero-P IIBC Zucchero P ATP AMPc CAP ATP AMPc CAP AMPc AMPc CAP CAP Gene catabolico Trascrizione attivata AMPc AMPc x Trascrizione non attivata (REPRESSIONE DA CATABOLITA) Gene catabolico

14 Regolazione della trascrizione dell operone lattosio di E. coli Sito operatore

15 QUORUM SENSING Sistema di regolazione presente nei batteri in grado di rispondere alla densità di popolazione

16 Le molecole del quorum-sensing Gram-positivi: piccoli peptidi modificati Small Antimicrobial Peptides (AMPs): lantibiotici batteriocine Gram-negativi: derivati degli acidi grassi Omoserina lattone acetilato (AHL)

17 La bioluminescenza in Vibrio fisheri Euprymna scolopes

18 Il sistema lux in Vibrio fisheri: il paradigma del sistema di regolazione basato sull N-acyl homoserine lactone R I C D A B E G LuxR 150 bp luxr: attivatore trascrizionale della luminescenza luxi: sintesi di N-acyl homoserine lactones luxa e luxb: subunità a e b della luciferasi luxc, luxd e luxe: complesso multienzimatico coinvolto nella sintesi dell aldeide, substrato della luciferasi luxg: FMN reduttasi

19 La regolazione della bioluminescenza in V. fisheri OHHL= N-(3-oxohexanoyl)- L-homoserine lactone Acyl-ACP=acyl carrier protein SAM=S-adenosylmethionine

20 Meccanismo di attivazione trascrizionale mediato da LuxR: La proteina interagisce con l acyl-hsl L interazione con l acyl-hsl induce una variazione conformazionale che permette alla proteina LuxR di dimerizzare Il dimero interagisce con la sequenza target del DNA (Lux-box) L interazione di LuxR con la subunità actd (a-subunit C-terminal Domain) della RNA polimerasi guida il posizionamento di tale enzima sul promotore

21 Processi fisiologici regolati dal quorum sensing nei batteri Gram-negativi Espressione di fattori di virulenza (Pseudomonas aeruginosa) Produzione di antibiotici (phenazine in Pseudomonas aureofaciens; carbapenem in Erwinia carotovora) Produzione di un fattore di virulenza esopolisaccaridico (Erwinia stewarti, responsabile dell appassimento del mais dolce) Produzione di un lipopeptide ciclico, biosurfattante coinvolto nello swarming di Serratia liquefaciens MG1) Coniugazione in Agrobacterium tumefaciens, per il trasferimento del plasmide Ti Formazione di biofilm

22 Le molecole del quorum sensing Gram-positivi: piccoli peptidi modificati Small Antimicrobial Peptides (AMPs): lantibiotici batteriocine Gram-negativi: derivati degli acidi grassi Omoserina lattone acetilato (AHL)

23 Peptidi Anti Microbici (AMPs) Lantibiotici o AMPs di classe I - peptidi contenenti modificazioni post-traduzionali - heat-stable - attività antimicrobica e di molecole segnale Batteriocine o AMPs di classe II - piccoli peptidi (40-70 aa) NON contenenti modificazioni post-trasduzionali - sintetizzati come precursori contenenti una porzione all estremità N-terminale che viene rimossa durante la secrezione - contengono due residui di glicina (Gly-Gly motif) che precedono il sito di taglio - attività antimicrobica e di molecole segnale - oggetto di studio per la produzione di conservanti alimentari

24 La produzione di AMPs è regolata dalla desità cellulare: significato biologico 1. Garantisce livelli di AMPs nell ambiente sufficienti ad uccidere i microrganismi competitori 2. Il rapido incremento di AMPs previene lo sviluppo di meccanismi di difesa o resistenza nelle cellule bersaglio 3. Evita una inutile produzione di AMPs quando le condizioni di crescita sarebbero tali da favorire una rapida dispersione nell ambiente dei feromoni stessi

25 Two-component regulatory systems

26 Quorum sensing e Two-component regulatory systems nei batteri Gram-positivi

27 Processi regolati dal quorum sensing nei batteri Gram-positivi Sviluppo della competenza genetica in Bacillus subtilis e Streptococcus pneumonie Espressione della virulenza in Streptococcus aureus Produzione di peptidi antimicrobici (AMPs) da parte di diverse specie di batteri Gram-positivi

28 La risposta adattativa agli stress ambientali Cosa è: la capacità della cellula batterica di rispondere velocemente al verificarsi di una condizione di stress che potrebbe essere letale Come si esplica: Attraverso l espressione coordinata di un insieme di geni i cui prodotti determinano un aumento della tolleranza della cellula batterica allo stress Impatto sull uomo: Resistenza al sistema di difesa dell ospite durante un infezione; Riduzione dell efficienza dell effetto letale di trattamenti chimici e fisici; Possibilità di miglioramento di ceppi per applicazioni industriali e ambientali.

29 La risposta allo shock termico Quando una cellula batterica è esposta ad un innalzamento della temperatura, si attiva l espressione transiente delle proteine Hsp (heat shock proteins) Struttura primaria molto conservata lungo tutta la scala evolutiva; Appartengono principalmente a due classi di proteine: - shaperon molecolari (chaperonine) - proteasi ATP-dipendenti

30 Proprietà dei geni espressi dopo un insulto termico Sono poco espressi durante la crescita ad una temperatura ottimale; Sono indotti in maniera transiente all insorgere dello shock termico; La loro induzione è a livello dell inizio della trascrizione; Sono generalmente organizzati in diversi reguloni (diversi operoni controllati dallo stesso regolatore) il cui insieme rappresenta lo stimulone (reguloni controllati da uno stesso stimolo)

31 La risposta allo shock termico nei batteri Gram-negativi Il regulone s 32 (RpoH) Il fattore s 32 : è codificato dal gene rpoh; alla normale temperatura di crescita subisce un turnover rapido; l RNA messaggero corrispondente alla normale temperatura di crescita è tradotto a bassa frequenza a causa della formazione di strutture a stelo ed ansa;

32 Adattamento dei microrganismi Adattamento fisiologico Variazione dell espressione genica in risposta a segnali ambientali (temperatura, ph, disponibilità di nutrienti, osmolarità, ecc). Coinvolge tutte o quasi tutte le cellule di una popolazione microbica Adattamento genetico Risposta a variazioni ambientali drastiche al punto da rallentare o impedire la crescita di una popolazione microbica. Variazione del genoma a causa di eventi rari e spontanei (mutazioni o ricombinazione) che producono tipi cellulari varianti (mutanti o ricombinanti). Coinvolge una o poche cellule della popolazione.

33 Le mutazioni sono eventi rari La maggior parte delle mutazioni sono peggiorative e dannose per un efficiente metabolismo microbico e una gran parte risultano letali; Es.: per Escherichia coli K12 Tasso di mutazione per mutazioni dannose = 2-8 x 10-4 per genoma per evento replicativo Tasso di mutazione per mutazioni migliorative = 2-8 x 10-9 per genoma per evento replicativo I microrganismi hanno evoluto meccanismi che assicurano un tasso di mutazione molto basso; tuttavia Ceppi mutatori: - ceppi batterici con un alto tasso di mutazione; - trovati in popolazioni naturali di diversi batteri (Escherichia coli, Sthaphilococcus aureus, Helicobacter pilori, Pseudomonas aeruginosa ); - contengono mutazioni nei geni che codificano enzimi coinvolti nei meccanismi di riparo del DNA e proteine che assicurano la fedeltà di replicazione

34 In condizioni ambientali avverse l aumento della variabilità genetica in una popolazione assicura una maggiore probabilità di comparsa di fenotipi migliorativi e quindi di sopravvivenza Test di sensibilità all antibiotico fosfomicina (FOS) mediante diffusione in agar Ceppo non mutatore: classico alone di inibizione Ceppo mutatore: presenza di colonie resistenti all antibiotico all interno della zona di inibizione