I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE POPOLAZIONI CONSORZIO MICROBICO

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1 I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE In natura le cellule vivono in associazione con altre cellule POPOLAZIONI INSIEME DINUMEROSI ORGANISMI DELLA STESSA SPECIE Composte da gruppi di cellule che derivano da divisioni cellulari successive a partire da una singola cellula parentale Si definisce habitat il luogo in cui una popolazione microbica vive CONSORZIO MICROBICO L insieme di più popolazioni che occupano lo stesso habitat e sono metabolicamente correlate

2 COMUNITA MICROBICHE sono costituite da diverse popolazioni microbiche (consorzi) che interagiscono tra di loro in un determinato ambiente. I componenti e il num di cellule che costituiscono una comunità microbica dipendono dalle risorse e dalle condizioni presenti in quel determinato habitat ECOSISTEMA è costituito dagli organismi viventi unitamente ai costituenti chimici e fisici dell ambiente di cui fanno parte Le popolazioni in una comunità microbica interagiscono tra loro in modo benefico e/o dannoso In molti casi vi è cooperazione: per esempio i prodotti di scarto delle attività metaboliche di alcune cellule possono fungere da nutrienti per altre cellule Giovanni Vallini 2006

3 I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE Un ECOSISTEMA è controllato in modo significativo dalle TRASFORMAZIONI MICROBICHE I microorganismi, conducendo i loro processi metabolici, rimuovono nutrienti dall ambiente circostante. Allo stesso tempo, liberano nell ambiente i loro prodotti di scarto Nel tempo, un ECOSISTEMA gradualmente cambia, sia CHIMICAMENTE che FISICAMENTE attraverso le trasformazioni microbiche dei nutrienti ECOLOGIA MICROBICA studio dei microrganismi nei loro habitat naturali

4 METODI per l ANALISI dei MICROORGANISMI e delle COMUNITA MICROBICHE Metodi CULTURE-DEPENDENT convenzionali Metodi CULTURE-INDEPENDENT molecolari Permettono l ISOLAMENTO dei microrganismi mediante l impiego di terreni selettivi specifici per la crescita seguito da una CARATTERIZZAZIONE mediante saggi fisiologici e metabolici Tecniche che prescindono dalla coltivabilità di un microrganismo. Consentono di monitorare la COMPOSIZIONE e le DINAMICHE di popolazione delle comunità microbiche presenti in varie matrici (acqua, suolo, reflui, etc.) senza ricorrere a isolamenti preventivi Permettono di analizzare le caratteristiche biochimiche e genetiche delle cellule che compongono la comunità Metodi MICROSCOPICI Utilizzando sonde fluorescenti permettono l identificazione in situ dei microrganismi (FISH)

5 Le tecniche molecolari permettono la caratterizzazione sia della frazione coltivabile che di quella non coltivabile presente in un campione ambientale. Con le tecniche di coltivazione standard è invece possibile identificare solo quei microorganismi capaci di crescere su determinati terreni selettivi La quantità di campione necessaria per lo studio della comunità microbica utilizzando tecniche molecolari è minore rispetto a quella necessaria per l approccio classico Solo con le tecniche culture-dependent è possibile avere a disposizione il microorganismo isolato per studi di carattere fisiologico e metabolico. È importante cercare di ottimizzare le tecniche di pre-arricchimento e arricchimento selettivi per riuscire a recuperare le popolazioni microbiche meno dominanti, stressate e non coltivabili, che sono presenti a bassa carica

6 METODI CULTURE-DEPENDENT Costituiscono le cosiddette procedure standard di identificazione dei microorganismi Prevedono: 1) ISOLAMENTO in COLTURA PURA 2) CARATTERIZZAZIONE fenotipica degli isolati ottenuti sulla base di caratteristiche morfologiche, biochimiche e della composizione chimica cellulare LIMITI Questo approccio non è applicabile indifferentemente a qualsiasi specie microbica. Necessita quindi di essere adattato e ottimizzato di volta in volta sulla base della matrice (ambientale e/o alimentare) da analizzare e dei ceppi microbici in studio. Le tecniche proprie della tassonomia fenotipica forniscono risultati a volte incerti e di difficile interpretazione I microorganismi coltivabili e quindi isolabili in una matrice rappresentano solo una parte dell intera comunità microbica Per esempio: in una matrice ambientale i coltivabili sono < 10% del totale

7 ISOLAMENTO DI CEPPI MICROBICI IN COLTURA PURA Anche su mezzo di crescita ottimizzato risulta isolabile al massimo il 20%, in media la frazione isolabile risulta compresa tra 1%-10% CONDIZIONI COLTURALI NON ADEGUATE Vi sono microrganismi che su determinati terreni di coltura non attecchiscono o crescono molto lentamente VITALITA del microorganismo da isolare Vi sono microrganismi che in condizioni ambientali sfavorevoli entrano in uno stato di metabolismo ridotto VNC non coltivabili ma vitali (viable but not cultivable) Giovanni Vallini 2006

8 LA COLTIVAZIONE DEI BATTERI I microorganismi quando crescono su un terreno di laboratorio sono chiamati COLTURA I MEZZI SU CUI VENGONO COLTIVATI I MICROORGANISMI VENGONO DETTI TERRENI DI COLTURA I TERRENI DI COLTURA Con i terreni di coltura si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microorganismo che si desidera coltivare. Il terreno prima della semina deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto. Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell ambiente

9 I TERRENI DI COLTURA IMPIEGHI conteggio dei microorganismi presenti in una matrice; isolamento dei microorganismi; mantenimento in coltura pura; identificazione e studio delle caratteristiche biochimiche; coltivazione per la produzione di antibiotici, enzimi, tossine, antisieri, vaccini, colture starter; valutazione dell attività di prepararti farmacologicamente attivi (per es: antibiotici, ricerca di sostanze inibenti)

10 IL CAMPIONAMENTO L'analisi di un piccolo campione prelevato da una massa di grandi dimensioni ha senso soltanto se il campione è rappresentativo di tutta la massa e ne rispecchia quindi la composizione media. IL CAMPIONE AMBIENTALE NON è OMOGENEO!! Le cellule presenti in un singolo grammo di matrice NON SONO UGUALMENTE DISTRIBUITE nello spazio della matrice (aggregati) Numerosi REPLICATI Raccolti in punti diversi dell ambiente in esame 1. OMOGENIZZAZIONE 2. DISTACCO DELLE CELLULE MICROBICHE DALLA MATRICE lavaggi con soluzioni saline che alterano le interazioni elettrostatiche tra la parete batterica e la matrice stessa 3. La sospensione microbica così ottenuta viene quindi utilizzata per l isolamento o la quantificazione

11 ISOLAMENTO E COLTIVAZIONE DEI BATTERI Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) su un substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine una popolazione di cellule appartenenti ad un unica specie. COLTURA PURA o AXENICA Per coltura pura si intende l insieme delle cellule che si ottengono dalla riproduzione di una sola cellula iniziale

12 METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI DIRETTI conta al microscopio ottico conta al microscopio a fluorescenza (FISH, colorazioni) conta su piastra MPN INDIRETTI PCR quantitativa Biomassa attività microbica

13 METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI CONTA SU PIASTRA Partendo dalla matrice ambientale preparo una sospensione Vengono allestite diluizioni seriali della sospensione Opportune diluizioni seriali vengono seminate su opportuni mezzi di crescita: Minimi, ricchi, arricchiti, selettivi Sulla base della diluizione piastrata e del volume piastrato posso risalire al numero di UFC (Unità Formanti Colonia) presenti per grammo di matrice M (UFC)= n * F V M= num di m.o. per ml n = num di colonie cresciute V = volume seminato F = fattore di diluizione

14 METODI PER L ISOLAMENTO DI CEPPI BATTERICI in COLTURA PURA ISOLAMENTO DIRETTO Sospensione di un aliquota di matrice in soluzione fisiologica (0.9% NaCl) -L ottenimento dei ceppi avviene a seguito di semina su piastra contenente mezzo non selettivo agarizzato -i ceppi ottenuti vengono successivamente testati per la loro capacità di crescere in presenza del contaminante di interesse COLTURA PURA L ottenimento di ceppi in coltura pura avviene dopo strisci successivi di colonie singole a partire dalla piastra iniziale MANTENIMENTO degli isolati Gli isolati devono essere mantenuti su mezzi di crescita in presenza del contaminante

15 METODI PER L ISOLAMENTO DI CEPPI BATTERICI in COLTURA PURA COLTURA DI ARRICCHIMENTO Fa ricorso all utilizzo di terreni selettivi in grado di sostenere la crescita delle differenti specie microbiche aventi necessità trofiche distinte Sospensione di un aliquota della matrice in mezzo di crescita liquido selettivo, contenente il contaminante di interesse. Fattori importanti da considerare: -Concentrazione del contaminante -Solubilità in acqua del contaminante: possono essere utilizzati solventi organici miscibili in acqua DMSO, DIMETILFORMAMMIDE, ALCOOL ETILICO, ACETONE (conc del solvente < 1% vol/vol) -Il contaminante può essere aggiunto anche per evaporazione -Preparazione di soluzioni stock sterilizzate per filtrazione -Tempo di incubazione L ottenimento dei ceppi selezionati avviene a seguito di semina su piastra contenente mezzo selettivo agarizzato

16 CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE MACROSCOPICHE Colore e forma delle colonie CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE MICROSCOPICHE - Forma delle cellule batteriche (cocchi, bacilli, spirilli) - Dimensione cellulare - Colorazione di Gram MICROSCOPIA OTTICA MICROSCOPIA ELETTRONICA TEM (microscopia elettronica a trasmissione) SEM (microscopia elettronica a scansione) Risulta estremamente difficile identificare ogni componente di una comunità microbica attraverso la semplice osservazione al microscopio. Inoltre molti gruppi microbici presentano caratteri fenotipici non specifici e quindi non utilizzabili ai fini della loro identificazione

17 STUDIO DELLA MORFOLOGIA NUTRIENT AGAR SLANT quantità di crescita: nessuna, lieve, moderata, abbondante colore: il colore può essere presente nella biomassa batterica (Serratia marcescens),oppure diffondere nel mezzo facendolo colorare (Pseudomonas fluorescens) opacità: dipende dalla quantità di biomassa prodotta: opaco, trasparente, traslucente forma: la strisciata su uno slant può dare crescita di diversa forma a seconda del tipo di batterio

18 STUDIO DELLA MORFOLOGIA NUTRIENT AGAR PLATE

19 CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA I saggi biochimici forniscono un maggior numero di informazioni rispetto ai saggi morfologici,consentendo quindi una più facile identificazione È tra le più efficienti e per questo è molto utilizzata Misurano: - capacità di utilizzare diverse fonti di carbonio - capacità di condurre determinate reazioni enzimatiche (ossidasi, catalasi) Alcuni KIT diagnostici per microbiologia Svantaggi: API (BioMerieux) BIOLOG CRYSTAL (Becton-dickinson) AUXACOLOR (Sanofi Pasteur) 1. Le proprietà biochimiche possono essere instabili e suscettibili alle variazioni dell ambiente circostante (es. temperatura, ph, età della coltura, concentrazione di O 2 ) 2. Può risultare difficile distinguere microrganismi appartenenti a specie diverse che presentano lo stesso profilo biochimico 3. I saggi biochimici sono immediati ma proprio per questo è facile interpretare in maniera errata l esito della reazione 4. È necessario mettere a punto saggi biochimici sempre più sensibili in grado di discriminare nuove specie microbiche

20 ANALISI DEGLI ACIDI GRASSI (FAME) METODO BIOCHIMICO CHE SI BASA SULLA SEPARAZIONE GAS CROMATOGRAFICA DEGLI ESTERI METILICI DEGLI ACIDI GRASSI Gli acidi grassi rappresentano un frazione relativamente costante della biomassa cellulare Esistono profili di acidi grassi caratteristici e distintivi dei principali gruppi tassonomici di microrganismi Nel caso in cui tale analisi sia effettuata su campione ambientale, una variazione del profilo in acidi grassi può essere dovuto a un cambiamento nella composizione tassonomica della comunità microbica

21 METODI CULTURE-INDEPENDENT 1. SEGUIRE L EVOLUZIONE E IL COMPORTAMENTO DI UN CONSORZIO MICROBICO NEL TEMPO (MONITORAGGIO DIACRONICO) 2. VALUTARE LA SICUREZZA MICROBIOLOGICA TRAMITE MONITORAGGIO in situ DI MICROORGANISMI PATOGENI 3. RICOSTRUIRE L EFFETTIVA COMPOSIZIONE DI UNA COMUNITA MICROBICA 4. MONITORARE in situ LA PERSISTENZA DI UN DETERMINATO INOCULO BATTERICO (bioaugmentation) TECNICHE MOLECOLARI Permettono di rilevare sia microorganismi presenti a basse concentrazioni che microorganismi non coltivabili in laboratorio

22 Le tecniche molecolari sviluppate per il monitoraggio della dinamica delle comunità microbiche possono essere raggruppate essenzialmente in due categorie: A. Tecniche che si basano sull analisi delle sequenze di DNA indipendentemente da conoscenze pregresse circa la struttura della comunità microbica di interesse. In particolare le tecniche che si basano sulla PCR si sono rivelate un mezzo estremamente veloce ed efficace per l identificazione, la caratterizzazione e il monitoraggio dei microorganismi in generale e dei batteri in particolare B. Tecniche di ibridazione che impiegano sonde molecolari, utilizzate quando esistono informazioni pregresse riguardo alla comunità microbica di interesse

23 PRINCIPALI TECNICHE DI INDAGINE MOLECOLARI

24 TECNICHE DI PCR FINGERPRINTING In generale le metodiche molecolari basate sull utilizzo della PCR permettono di distinguere entità microbiche strettamente correlate dal punto di vista genetico attraverso l ottenimento di specifiche impronte molecolari (molecular fingerprinting) PCR con primers per marker genici di particolare interesse filogenetico 16S rdna, 23S rdna, regione intergenica 16S-23S 18S e 26S rdna

25 rrna RIBOSOMALI Molecole essenziali per la vita delle cellule Costituiscono la parte non proteica dei ribosomi Elementi chiave della sintesi proteica I rrna possono essere considerati dei veri e propri CRONOMETRI MOLECOLARI perché caratterizzati dalla presenza al loro interno di zone più o meno conservate,soggette a differente variabilità durante il processo evolutivo. L informazione contenuta nei rrna fa si che il sequenziamento dei geni (rdna) che codificano per le suddette macromolecole permetta l individuazione,su base genetica, di generi e specie, anche nel caso di batteri di difficile classificazione

26 IL GENE 16S rdna LA SEQUENZA DEL GENE CHE CODIFICA PER IL16S rrna NEI MICROORGANISMI PROCARIOTI (EUBATTERI E ARCHEBATTERI) SI E RIVELATA UN OTTIMO STRUMENTO TASSONOMICO È una sequenza universale tra i batteri Non è soggetta a trasmissione orizzontale Presenta regioni conservate e regioni variabili intersperse discriminanti le diverse specie batteriche Le regioni al 5 e 3 del 16S rdna sono fortemente conservate mentre quelle interne presentano una maggiore variabilità. I primers per le reazioni di PCR possono essere disegnati su tutte e due le regioni fornendo informazioni differenti: -Se disegnati al 5 e 3 permettono amplificazione e sequenziamento di regioni conservate che consentono l identificazione del genere -Se disegnati sulle regioni ipervariabili è possibile ottenere anche l identificazione della specie RDP Ribosomal Database Project allineamento e identificazione

27 ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis PCR-RFLP Tecnica efficace, veloce, semplice ed economica per l identificazione della composizione di comunità microbiche complesse Permette analisi simultanea di un elevato numero di microorganismi Fornisce importanti informazioni sulle popolazioni microbiche presenti in ambienti differenti descrivendo il loro grado di biodiversità e il loro comportamento nel tempo Riesce a discriminare i microorganismi a livello di specie Consiste nello studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo digestione con enzimi di restrizione della sequenza di 16S rdna ottenuta mediante PCR

28 ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis L ARDRA può essere utilizzata per lo screening di microorganismi coltivabili e non coltivabili Su 16S/18S/26S Per ceppi microbici coltivati: 1. Isolamento dei batteri dall ambiente naturale mediante le tradizionali tecniche di coltura 2. Amplificazione del 16S/18S rdna dei singoli isolati via PCR 3. Digestione degli ampliconi ottenuti mediante l impiego di endonucleasi 4. Separazione elettroforetica dei prodotti della digestione per ciascun amplicone e ottenimento di profili elettroforetici tipici (impronta) per ciascun amplicone digerito 5. Suddivisione dei profili ottenuti per ciascun amplicone in gruppi definiti OTU (Operational Taxonomic Units) 6. Sequenziamento del 16S/18S rdna per il capostipite di ogni OTUs 7. Allineamento delle sequenze ottenute con quelle presente in banca dati mediante programma BLAST 8. Assegnazione dell appartenenza a genere e specie