Microscopio convenzionale

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1 Microscopio convenzionale 160 mm 195 mm 45 mm

2 Midollo osseo normale

3 Anti-kappa vs. Anti-lambda

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5 DEFINIZIONI Citometria a flusso Metodologia per misurare le proprietà di cellule in flusso Cell Sorting Separazione di cellule basata sulle proprietà misurate Chiamato anche Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

6 Fluidica Cellule in sospensione viaggiano in flusso in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse Ottica Disperdono (scatter) la luce ed emettono fluorescenze Elettronica Che sono raccolte, filtrate e Convertite a valori digitali Che sono salvati in un computer

7 Fluidica. Orientamento delle particelle e deformazione. Lo stress da flusso può anche causare deformazione cellulare (per esempio assumere una forma a sigaro).

8 Flow Cell Injector Tip Sheath fluid Fluorescence signals Focused laser beam

9 Ottica Sorgenti luminose Laser Possono fornire una singola lunghezza d onda di luce (laser line) o (più raramente) una miscela di lunghezze d onda Possono fornire da milliwatts a watts di luce Possono essere poco costosi (unità raffreddate ad aria) o molto costosi (unità raffreddate ad acqua) Forniscono luce coerente

10 Ottica Canali ottici Un canale ottico è un percorso che la luce può seguire dal volume illuminato fino ad un detector. Gli elementi ottici forniscono una separazione di canali ed una selezione di lunghezze d onda.

11 Forward Scatter Laser FALS Sensor Forward angle light scatter

12 ISTOGRAMMA DELLO SCATTER FRONTALE FORWARD SCATTER (FSC), SCATTER FRONTALE, SCATTER A 180 o

13 Ottica Canale del Forward Scatter Quando viene usata una sorgente laser, la quantità di luce scattered nella direzione frontale (lungo lo stesso asse della luce) viene rilevata nel canale del forward scatter, o scatter frontale, o 180 scatter L intensità del forward scatter è correlata alla dimensione, alla forma ed all omogeneità della cellula (o di altre particelle)

14 90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor

15 ISTOGRAMMA DELLO SCATTER LATERALE linfo granulo mono SIDE SCATTER (SSC), RIGHT SCATTER (RTSC), SCATTER LATERALE, SCATTER A 90 o

16 Ottica Canale del side scatter Quando viene usata una sorgente laser, la quantità di luce scattered di lato (perpendicolare all asse del laser) è rilevata nel canale del side o 90 o scatter, o right scatter, o scatter laterale. L intensità del side scatter è correlata alla complessità ottica delle cellule (o di altre particelle).

17 Ottica Lo scatter della luce Il Forward scatter distingue le cellule sulla base del volume ed è anche in grado di distinguere cellule vive da morte Il Side scatter tende ad essere più sensibile rispetto alle inclusioni all interno della cellula e può essere usato per distinguere le cellule granulate dalle non-granulate.

18 DESCRIZIONE MONOPARAMETRICA (ISTOGRAMMA) DESCRIZIONE BIPARAMETRICA (CITOGRAMMA)

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21 400nm 480nm 510nm 570nm 610nm 670nm violetto azzurro verde giallo arancio rosso

22 Ottica Canali di fluorescenza La fluorescenza emessa da ciascun fluorocromo è usualmente rilevata in un unico canale di di fluorescenza. La specificità del rilevamento è controllata dalla selettività di filtri ottici e di specchi.

23 Fluorescence Detectors Laser FALS Sensor Fluorescence Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)

24 Optical Design PMT 5 PMT 4 Sample Flow cell Dichroic Filters PMT 2 PMT 3 Scatter Sensor Bandpass Filters PMT 1 Laser

25 FITC (ISOTIOCIANATO DI FLUORESCEINA) PE (PHYCOERYTHRIN)

26 IMMUNOFLUORESCENZA ANTICORPO ANTIGENE

27 Citometro a flusso come selettore cellulare 488 nm laser FS Sensor Charged Plates - Fluorescence detector + Single cells sorted into test tubes

28 ROTTURA DELLE CELLULE Rompere la parete o la membrana cellulare Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari Metodi meccanici: omogeneizzatore Vibrazioni ultrasoniche Metodi non meccanici: Congelamento/scongelamento Shock osmotico Agenti litici

29 OMOGENIZZAZIONE/FRANTUMAZIONE Per ottenere un omogenato Molto usati sono i METODI MECCANICI

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36 MEZZO PER L OMOGENIZZAZIONE Soluzione ISOTONICA A composizione salina bilanciata Soluzione TAMPONATA DEVE ASSICURARE L INTEGRITA FISICA E METABOLICA DEGLI ORGANULI Mg 2+ aiuta a conservare l integrità di nuclei e ribosomi EDTA agente chelante inattivatori di proteasi DTT β ME agenti riducenti

37 METODI NON MECCANICI Digestione enzimatica (es. lisozima per la parete batterica) Detergenti o solventi organici (SDS, Triton, acetone, toluene) Shock osmotico (soluzioni ipotoniche) Congelamento/scongelamento

38 Metodi non meccanici 1- Lisi blanda (batteri) permette la formazione di piccoli pori nella membrana utilizando Triton e lisozima, in questo modo è possibile isolare solo DNA plasmidico mentre il DNA cromosomiale rimane attaccato alla membrana interna; 2- Lisi spinta in cui le membrane vengono completamente frantumate utilizzando detergenti anionici quali SDS. Con la lisi spinta si isolano acidi nucleici totali (DNA cromosomiale, mrna, rrna,trna ecc).

39 ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Tutte le metodiche per l estrazione di acidi nucleici utilizzano 3 fasi: 1. Una lisi cellulare (spesso combinata con l inattivazione delle nucleasi cellulari) 2. La deproteinizzazione del campione lisato 3. La precipitazione dell acido nucleico

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