MCSa. L utilizzo delle Cellule Staminali Mesenchimali Adulte in Medicina Estetica. Nettuno 05 ottobre 2013

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1 MCSa L utilizzo delle Cellule Staminali Mesenchimali Adulte in Medicina Estetica Nettuno 05 ottobre 2013

2 Per definire una cellula staminale sono necessari quattro criteri : primo, la cellula deve poter andare incontro a molteplici e sequenziali divisioni cellulari di automantenimento, un prerequisito per sostenere una popolazione cellulare.

3 Secondo, le cellule figlie derivate da una singola cellula staminale devono poter differenziare in almeno un diverso tipo cellulare rispetto a quello della staminale.

4 Il terzo criterio per definire la staminalità riguarda la capacità delle cellule di ripopolare il tessuto di origine se trapiantate in un sito ricevente danneggiato.

5 Un ultimo criterio, meno condiviso e meno consolidato, è che le cellule staminali devono essere in grado di contribuire con una progenie differenziata in vivo anche in assenza di danni tessutali.

6 A differenza delle cellule staminali embrionali, le cellule staminali adulte hanno una minore capacità di automantenimento, in parte a causa di una carenza di alti livelli di attività delle telomerasi, che però sono superiori a quelli medi delle cellule somatiche

7 La telomerasi è in grado di sintetizzare le sequenze telomeriche riallungando così i telomeri accorciati, in modo da mantenere integri i cromosomi. Si tratta di una vera e propria trascrittasi inversa (o DNA polimerasi RNA-dipendente ), dal momento che utilizza frammenti di RNA, propri, come stampo per l'elongazione dei telomeri

8 Tutte le cellule dei mammiferi dispongono di un numero differenziato di replicazioni, dopodichè divengono incapaci di replicarsi ed entrano in uno stato di «senescenza replicativa «correlata all accorciamento dei telomeri

9 Si parla di senescenza replicativa quando una normale cellula si è divisa un certo numero di volte (questo numero varia a seconda del tipo di cellula ed anche dalle condizioni esterne), i telomeri diventano così corti che promuovono la stato di non divisione, la cellula è permanentemente bloccata nella fase G1. International Journal of Morphology versión On-line ISSN Int. J. Morphol. v.28 n.1 Temuco mar doi: /S Int. J. Morphol., 28(1):37-50, The Dual Role of Senescence in Tumorigenesis Papel Dual de la Senescencia en la Tumorigénesis Lilian Chuaire-Noack; Magda Carolina Sánchez-Corredor & Sandra Rocío Ramírez-Clavijo Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad del Rosario, Bogotá DC, Colombia

10 I telomeri hanno una funzione protettiva delle estremità, prevenendo le fusioni di cromosomi e contribuendo al mantenimento della stabilita genomica.

11 I telomeri troppo corti sono riconosciuti come una rottura del DNA e ciò porta alla formazione di foci contenenti H2AX (una variante fosforilata dell H2A), e al fenotipo senescente.

12 L H2A.X è un istone molto frequente nel genoma eucariotico che si sostituisce ad H2A. La sua funzione è implicata nella riparazione del DNA. In caso di danneggiamento infatti viene fosforilato l'istone H2A.X più vicino al sito di rottura; tale fosforilazione funge da segnale per richiamare in loco tutte le proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma.

13 Gli istoni (H1, H2A, H2B, H3, H4) sono proteine associate al DNA. L'interazione tra gli istoni ed il DNA e' molto ben regolata, infatti ogni sequenza di paio di basi di DNA e' legata ad una molecola di istone H1 e a due molecole di istoni H2A, H2B,H3 e H4

14 Conseguenze funzionali delle modificazioni istoniche Le modificazioni non influenzano la stabilità del core nucleosomale, ma alterano solamente la carica elettrostatica delle code N-terminali. Ciò modifica le proprietà strutturali dell istone o il suo legame al DNA.

15 Si crea un meccanismo che altera la struttura della cromatina, la cui conseguenza è una modificazione dello stato trascrizionale ( on-off ) oppure la definizione di strutture cromosomali di ordine superiore

16 Quindi la cellule senescenti quindi contribuiscono e paradossalmente incrementano l invecchiamento e l espressione fenotipica stimolando il tipico rimodellamento tissutale della cute senescente

17 L impiego di MSCa come supporto al pool di cellule staminali locali fornisce il vantaggio della presenza di una riserva di cellule staminali autologhe, impedendo e limitando l espressione fenotipica senescente

18 Sono conosciute anche con il nome di CFU-C colony forming fibroblast - cells

19 Dove si trovano le MSCa

20 Quante sono 1)Variabilità individuale solo a posteriori dopo il prelievo 2) Sede del prelievo

21 3) Traumi recenti nella sede del prelievo con consumo di cellule 4) Malattie endocrine gravi 5) Fumo di tabacco 7) Farmaci chemioterapici 8) Neoplasie in fase attiva 9) Abuso di alcool 10) Età

22 Hanno la capacità di muoversi e rispondono alla chemiotassi, producono sostanze anti-apoptotiche, citoprotettive, anti-fibrotiche, angiogeniche e mitotiche

23 Le cellule staminali mesenchiali adulte posseggono una elevata plasticità differenziativa.

24 La plasticità delle cellule staminali adulte è la capacità di acquisire il destino di tipi cellulari diversi da quelli del tessuto di origine

25 Numerosi meccanismi potrebbero sottostare a questa apparente plasticità ed esistono dati a supporto di ciascuno di quattro modelli : 1 ) cellule staminali tessuto-specifiche potrebbero essere presenti nel tessuto ricevente dell ospite

26 2) la plasticità potrebbe essere il risultato della fusione delle cellule del donatore con le cellule residenti in un organo;

27 3 ) Le cellule potrebbero andare incontro a dedifferenziamento e ri-differenziamento

28 4) vere e proprie cellule staminali potrebbero persistere nella vita post-natale.

29 Non esiste una definizione ufficiale di plasticità delle cellule staminali. Una definizione possibile è che cellule staminali adulte tessuto-specifiche, teoricamente commissionate verso un dato lineage cellulare, possono in particolari condizioni di microambiente acquisire lʼabilità di differenziare in cellule di un tessuto differente.

30 Questa definizione implica che: 1) differenti lineage cellulari devono poter derivare da una singola cellula iniziale.

31 I tipi cellulari differenziati devono mostrare funzionalità in vitro ed in vivo

32 Lʼattecchimento deve risultare robusto e persistente in presenza (ed in assenza) di danno tessutale.

33 Le cellule staminali adulte, multipotenti, rappresentano uno strumento eccezionale per lo studio dellʼautorinnovamento e del differenziamento.

34 Le cellule staminali multipotenti sono in grado di differenziare in un numero di tipi cellulari limitato al tessuto in cui risiedono; appartengono a questa classe le cellule ematopoietiche (HSCs) e le cellule mesenchimali (MSCs).

35 L origine delle cellule staminali embrionali è conosciuta mentre quella delle cellule staminali adulte non è ancora ben chiara.

36 Si pensa che le MSCa riescano a evitare il processo differenziativo tipico delle cellule durante lo sviluppo embrionale e a colonizzare appropriate nicchie.

37 Queste ultime avrebbero la funzione sia di mantenere la potenzialità delle cellule nella vita adulta sia di limitarne i processi di differenziamento (Lanza, 2004).

38 Numerosi studi hanno dimostrato che le MSCa sono dotate di potere rigenerativo (El Tamer, 2009; Miyahara, 2006; Suzuki, 2008; Harris, 2009; Arnalich-Montiel, 2008; Ferrari, 1998)

39 Le MSCa possono essere attenute da diversi tessuti, come midollo osseo, sangue periferico, cordone ombelicale, tessuto adiposo e derma (Jiang, 2002; Kuznetsov, 2001; Biebak, 2004; Koch, 2007; Yamamoto, 2007; Crigler, 2007).

40 Le cellule mesenchimali adulte sono caratterizzate da una morfologia simile a quella dei fibroblasti con una scarsa quantità di citoplasma, pochi mitocondri ed un apparato del Golgi poco sviluppato; possono essere espanse ex vivo (Pittenger, 1999; Chamberlain, 2007)

41 Riconoscimento delle MSCa

42 Tutte le cellule sono definite in funzione alle molecole di superficie, per lo più glicoproteine, espresse sulla loro membrana cellulare. Queste molecole sono usate comunemente come marker cellulari e sono dette cluster di differenziazione (CD).

43 A oggi sono stati identificati più di 320 CD. Generalmente una combinazione di marker è in grado di caratterizzare un solo tipo cellulare, che viene quindi descritto come avente questi marker.

44 Sono numerosi gli antigeni la cui espressione caratterizza le MSCa. Fenotipicamente le MSCa esprimono un certo numero di marcatori che, sfortunatamente però, non sono specifici per ciascuna MSCa.

45 Uno tra questi marcatori è lʼantigene endoglina, o CD105, riconosciuto dallʼanticorpo SH286; si tratta di una glicoproteina di 97 kda che lega ad alta affinità il TGFbI e III, ma non il TGFbII.

46 Il TGF beta svolge un ruolo fondamentale nelle interazioni tra le cellule endoteliali e nello sviluppo dei vasi

47 Il TGF-β è anche il più forte induttore dei miofibroblasti: esso modula l espressione dei recettori di diverse citochine, inclusi i recettori per il TGF-β e il PDGR e di endotelina

48 L endotelina-1 agisce insieme al TGF-β nel convertire i fibroblasti in miofibroblasti.

49 Friedenstein ha dimostrato che MSC umane da midollo possiedono multipotenzialità a livello di singola cellula verso i commissionamenti di osteoblasti, adipociti, condrociti, fibroblasti e cellule reticolari avventiziali.

50 Vanno di conseguenza consolidandosi le conoscenze sui fattori necessari per lʼinduzione in tali lineage, e sulle vie di segnalazione che sottintendono a tali processi.

51 Utilizzo delle MSCa

52 Ovviamente dopo opportuna estrazione, possono essere utilizzate da sole nei tessuti in tutte le condizioni in cui sia necessaria una rigenerazione, come l aging crono o fotoindotto, cicatrici, smagliature, atonia dei tessuti, ecc

53 Per indirizzare le MSCa verso le cellule della linea dermica viene associato l utilizzo di concentrato piastrinico, sia nella sua forma liquida sia in quella gelatinosa, come matrice per l applicazione di cellule staminali

54 Infatti la MSCa esprimono come caratterizzazione immunofenotipica anche il marcatore CD140A, che ha funzione recettoriale per il PDGF

55 Lo scopo è di ottenere, dalle piastrine debitamente attivate, la liberazione di diversi fattori di crescita necessari per la differenziazione delle cellule multipotenti in modo da accelerare la crescita e l impianto delle cellule staminali (Lucarelli, 2003; Kilian, 2004; Doucet, 2005; Del Bue, 2006; Gobbi, 2007; Everts, 2007) MSCa MSCa e PRP

56 I fattori di crescita liberati dalle piastrine, infatti, hanno dimostrato di possedere la capacità di favorire la differenziazione delle cellule staminali verso il destino cellulare e di promuovere l angiogenesi (Fotia, 2008).

57 L utilizzo combinato di MSCs e di PRP ha come importante vantaggio entrambi i biomateriali sono due composti autologhi, non tossici e biodegradabili.

58 L applicazione intradermica di MSCa e PRP è sicura e non induce nell ospite alcuna reazione di tipo immunitario o altri effetti collaterali locali o sistemici

59 Il trattamento con MSCa e PRP in associazione determina un potenziamento del processo di rigenerazione delle MSCa

60 Il trattamento con MSCs è in grado di migliorare qualitativamente la capacità rigenerativa del tessuto in maniera maggiore rispetto al trattamento con solo PRP

61 L associazione di MSCs e PRP è caratterizzata da un effetto sinergico che in grado di migliorare l efficacia d azione del PRP nel trattamento dei tessuti invecchiati

62 L utilizzo di MSCs o dell associazione delle MSCs e PRP risulta, perciò, una prospettiva molto interessante nel trattamento di patologie legate al processo dell invecchiamento, poiché induce una migliore rigenerazione del tessuto.

63 Le MSCa possono essere trapiantate anche con adipociti e PRP migliorando qualitativamente e quantitativamente le cellule trapiantate

64 Migliorano le prospettive di attecchimento del grasso trapiantato differenziandosi in adipociti ed aumentando in questo modo le cellule vitali depositate

65 FACE LIFT CON MSCa, ADIPOCITI E PLASMA

66 Si preparano MSCa ed adipociti e PRP. Utilizzando la tecnica con il polpastrello, il primo passo è infiltrare la linea al livello del bordo infraorbitario sul periostio. L'ago è introdotto attraverso l apertura piriforme e collocato sulla semiluna infraorbitale a livello periostale. Una frazione di MSCa adipociti e PRP viene depositato in quattro o cinque passaggi lungo il bordo orbitale del muscolo orbicolare.

67 Il secondo passo è l iniezione del PRP unito alla componente delle MSCa nel muscolo profondo dell'eminenza malare nonché nei componenti più profondi della piega naso-labiale, (cioè, i muscoli e strati sottocutanei). Questo viene realizzato in rivoli lineari per consentire la crescita ottimale dei vasi sanguigni.

68 Si completa poi con una iniezione superficiale a livello del bordo del derma sottocutaneo per stimolare la rigenerazione generale di elementi dermici, collagene, elastina, e la produzione di GAGs. Questo è possibile tramite una siringa 3cc che contiene le MSCa ed i fattori di crescita per favorire la formazione di collagene ed GAGs.

69 Modalità di estrazione delle MSCa

70 1.Prelievo del tessuto del donatore con un campione di 1 mm di profondità 2.Digestione enzimatica per almeno 1 ora a 37 con collagenase/dispase 3.Selezione attraverso i reagenti: attivazione Magnetica (MACS =Magnetic-activated cell sorting, a method for separation of various cell populations depending on their surface antigens) oppure luce attivata (FACS =Fluorescence-activated cell sorting, a biophysical technique used in flow cytometry)

71 Questi passaggi obbligano alla manipolazione dei tessuti e delle cellule e comportano un difficile e non sicuro trattamento degli stessi da parte del chirurgo rispetto alle procedure abituali.

72 Numerosi trattati hanno dimostrato che le staminali formano una popolazione con determinate caratteristiche morfologiche chiamate SIDE POPULATION.

73 Le caratteristiche principali della SIDE POPULATION sono: 1) la dimensione: le cellule hanno una dimensione sotto i 50 micron 2) la presenza dei marcatori di staminali significativamente maggiore che nella WILD POPULATION

74 FAC side population analisi

75 FAC analisi e sorting (selezione e isolamento) L antigene CD34 è una glicoproteina espressa sulla membrana delle cellule staminali e dei progenitori emopoietici che viene downregolata durante il differenziamento. Bonnet D. Haematopoietic stem cells. Journal of Pathology, 197: ,2002. Zanjani ED, Almeida-Porada G, Livingston AG, et al. Human bone marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multi-lineage expression that includes giving rise to CD34+ cells. Exp. Hematol., 26: , 1998.

76 Utilizzando esclusivamente il criterio della dimensione possiamo selezionare una popolazione sotto i 50 micron e senza enzimi in cui le cellule staminali possono raggiungere l 80 %

77 Si inserisce un frustolo di tessuto prelevato in sede sottoascellare all interno di una capsula con 1 ml di sol. fisiologica

78 Nella capsula il frustolo viene triturato e le cellule filtrate

79 Attraverso un apparecchio che ne permette la disgregazione

80 Nell epidermide è stato recentemente identificato nelle stem cells di cheratinociti il fattore di trascrizione P63. Il fattore di trascrizione p63 è un componente della famiglia dell'oncosoppressore p53, essenziale per lo sviluppo embrionale della cute umana e murina. L ipotesi è che p63 sia responsabile del potenziale differenziativo di queste cellule staminali.

81 L abilità dell epidermide umana nel mantenere un costante turnover delle cellule è basata sulla presenza, nello strato basale, di una popolazione di cellule staminali di cheratinociti (stem cells), dotate d alta capacità di autorinnovarsi durante la vita e con grande potenziale proliferativo.

82 Le stem cell, a loro volta, generano cellule che vanno incontro a differenziazione terminale conosciute come transient amplifying cells (TA) che, prima di andare incontro a differenziazione terminale, mostrano una limitata capacità proliferativa

83 La differente capacità proliferativa di tali cellule è stata studiata molto accuratamente in coltura, valutando la loro efficienza nel formare colonie (CFE). Nell epidermide umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di formare colonie: olocloni che sono considerati cellule staminali con la più alta capacità proliferativa (self-renewal, telomerase telomeri); paracloni (TA), che vanno incontro a differenziazione terminale dopo circa una decina di divisioni merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i paracloni e gli olocloni.

84 Grazie per l attenzione