Misurazione e uso di anticorpi. Misurazione delle funzioni dei linfociti T

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1 Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T

2 Misurazione e uso di Abs Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

3 Citometria a flusso E una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione di cellule sospese in un mezzo fluido. Rende possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cells ad una velocità molto rapida, permettendo una dettagliata analisi qualitativa e quantitativa

4 Un po di storia La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni 70, determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente limitata alla misura di 1-2 parametri, portò grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all utilizzo di Ab monoclonali marcati con fluorescina (FITC)

5 La complessità del sistema immunitario e la presenza di diverse sub-popolazioni che reagivano con lo stesso Ab stimolarono: lo sviluppo di MoAb sempre più specifici; la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli Ab la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici

6 Applicazioni Studio della proliferazione cellulare Analisi del ciclo cellulare Analisi innunofenotipica multiparametrica Risposta del sistema immunitario Studio dei livelli di apoptosi

7 Vantaggi analisi multiparametrica elevato numero di cells esaminate rapidità dei tempi di analisi (1000 cells/s) obiettività, riproducibilità e affidabilità statistica delle letture campioni processati senza perdere la vitalità cellulare

8 Limiti analisi di cells molto rare, che a causa del loro ridotto numero in confronto agli eventi analizzati potrebbero essere difficilmente separabili dal rumore di fondo necessità di dover lavorare con campioni in fase monodispersa

9 Principi di funzionamento

10 Componenti di un CFM

11 Basi della Citometria a Flusso Fluidica Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse Ottica riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale Elettronica che viene inviato al computer

12 Fluorocromi utilizzati più Linee Laser Comuni comunemente nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

13 Schema generale della camera di flusso di un citofluorimetro Cella di Flusso Iniettore Fluido di rivestimento Granulocito Linfocito Monocito

14 Rilevamento dei parametri fisici Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi Sorgente luminosa Luce trasmessa Luce Riflessa

15 Scatter frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) luce dispersa in avanti Granulocito Laser Sensore per il FALS Linfocito Monocito

16 Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce scatterata nella direzione frontale (ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del forward scatter la luce dispersa in avanti (forward scatter) e legata alle dimensioni delle cellule

17 Scatter laterale (90 Degree Light Scatter o Side Scatter) luce riflessa Granulocito Laser Linfocito Sensore FALS Monocito Sensore per il 90 LS

18 Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce scatterata lateralmente (perpendicolare all asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del side scatter luce riflessa (side scatter) e da attribuire a parametri della morfologia cellulare come la granulosita del citoplasma, il rapporto nucleo/citoplasma, la rugosita di superficie.

19 Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare può essere usato per distinguere cellule da: vive/morte, piccole/grandi Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all interno della cellula può essere usato per distinguere cellule granulate da cellule non-granulate

20 Elaborazione e Rappresentazione dei dati L elaborazione dei dati e eseguita grazie al computer collegato allo strumento,che tramite specifici software provvede a tradurre i segnali in grafici e alla loro rappresentazione su display video in tempo reale.

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23 Rappresentazione dei dati Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico. Tra i più semplici abbiamo: citogramma istogramma

24 Citogramma Dot-plot diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione del forward e del side scatter. Permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche. Le rappresentazioni bidimensionali, permettono di mettere in correlazione due parametri tra di loro.

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26 Analisi citofluorimetrica pdc CD11c+ CD11b- DC CD11c+ CD11b+ FL2-H T cells CD11c- CD11b- B cells Macrophages CD11c- CD11b+ FL1-H FL1-H : CD11b FL2-H : CD11c

27 Esempio di analisi dei leucociti e gating elettronico GRANULOCITI LINFOCITI MONOCITI

28 Nuclei di linfociti normali o apoptotici

29 Gating

30 Istogramma L ascissa riporta l intensita di fluorescenza e l ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l antigene (diagramma di distribuzione).

31 Analisi statistica Si basa sull impostazione di cursori che delimitano le aree di interesse, e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano in tali aree. Per ogni picco e possibile calcolare dati statistici (valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, ecc)

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34 Analisi del ciclo cellulare

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36 apoptosi

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38 singole

39 488 nm laser FALS Sensor FACS: Fluorescence Fluorescence detector Activated Cell Sorting - + Piastre cariche elettricamente Cellule singole separate dentro diverse provette

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41 Crystal Electrode Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

42 Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

43 Electrode +/- 190 V Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Fluorescence Optics Electronic Delay Time Break-off Point Amp. (v)

44 + _ V V + _

45 Analisi pre-sorter Macrofagi peritoneali CD11b positivi

46 Gating Macrofagi peritoneali CD11b positivi

47 Sorted CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted

48 Misurazione e uso di Abs Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

49 ELISA Legame diretto con l Ag Sandwich

50 ELISA sandwich

51 ELISPOT

52 Western blotting

53 Cromatografia d affinità

54 Magnetic sorting

55 minimacs

56 Microscopia ad immunofluorescenza......

57 Immuno Staining (anti-occludina) polilisina/vetrino conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H 2 O 20 min. RT 2 lavaggi con H 2 O asciugare bene PREPARZIONE DEI CAMPIONI Seminare 1,5 x 10 5 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO siero Incubazione, 15 min 37 C (incubatore) Controllare al microscopio FISSARE LE CELLS Aspirare il surnatante Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4 C Lavare tre volte con PBS 1X (RT) A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4 C) 1 COLORAZIONE Aspirare il PBS Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice. Washing 3X con PBS Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT Washing 3x con PBS Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N ), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino 1 h on ice Washing 3x con PBS Secondary Ab, α-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n ). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino. 30 min on ice, al buio. Washing 3x con PBS Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol 30 min RT, buio Vetrino a 20 C. 2

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65 Misurazione delle funzioni dei linfociti T A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, l immunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare. Le cells T non secernono prodotti in grado di legare l antigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame

66 Studio di funzioni linfocitarie Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi: 1. Uccisione del bersaglio cellulare 2. Attivazione delle cellule APC 3. Produzione di citochine

67 Metodiche 1. saggio di citotossicità 2. saggio di proliferazione 3. misurazione di citochine

68 Attività citotossica: Rilascio di cromo da cellule bersaglio

69 Proliferazione antigene-specifica delle cellule T

70 Misura citochine prodotte: intracellular staining

71 Intracellular staining 1- cellule in piastra a concentrazione molto alta ( 5x10 5 cells/ml) 2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml 3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x10 6 cells/ml/sample) 4- blocking: incubare 100 µl di PBS-FCS 5% 10 min RT 5- aggiungere anticorpo di superficie 6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5% 7- fissare con 500 µl/tubo di paraformaldeide 2% e incubare 10 minuti RT 8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5% 9- permeare: risospendere le cells in 500 µl PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT 10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200 rpm x 5 min 11- risospendere in 100 µl di PB+siero per blocking (1:25) 12- aggiungere anticorpo intracellulare 13- incubare 30 min RT al buio 14- lavare 2 volte con PB 15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5%

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