Classificazione. I complessi. Le pietre miliari della tassonomia. Tassonomia del genere Mycobacterium. Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri

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Giovanna Farina
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1 Le pietre miliari della tassonomia Tassonomia del genere Mycobacterium Enrico Tortoli Centro Regionale di Riferimento per i Micobatteri Firenze Adamo è autorizzato da Dio a dare un nome a tutti gli esseri viventi (Genesi 2.19) 4 o secolo a.c., Aristotele si cimenta nella differenziazione di piante ed animali 1 o secolo d.c., Plinio il vecchio dedica 4 libri della Naturalis historia alla zoologia, e 8 alla botanica 18 o secolo: Linneo introduce il sistema binomio Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri 1896 Lehmann e Neuemann descrivono: Il genere Mycobacterium M. leprae M. tuberculosis 1899 descrizione di: M. smegmatis M. phlei 1901 descrizione di M. avium 1923 descrizione di: M. paratuberculosis M. chelonae 1926 descrizione di M. marinum 1938 descrizione di M. fortuitum Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri 1967 L. Wayne fonda lo IWGMT Analisi dei caratteri fenotipici Tassonomia numerica Studi cooperativi 1987 lo IWGMT riconosce il valore degli studi basati sull omologia del DNA Ceppi con omologia >70% appartengono alla stessa specie 1990 E. Böttger adotta, per primo, il sequenziamento genico per l analisi l della tassonomia del genere Mycobacterium Classificazione I complessi regno: Bacteria tipo: Actinobacteria classe: Actibobacteridae ordine: Actinomycetales famiglia: Corynebacteriaceae - genere: Mycobacterium M. tuberculosis complex M. avium complex M. terrae complex M. fortuitum complex 1

2 La tassonomia dei micobatteri Tassonomia basata sul genotipo fino agli anni 80 basata esclusivamente sui caratteri fenotipici negli ultimi 15 anni sempre più basata sui caratteri genotipici Le varie regioni del genoma sono soggette alle mutazioni in maniera diversa I geni che codificano per funzioni essenziali (house keeping genes) ) sono poco soggetti alle mutazioni e le rare sostituzioni di nucleotidi sono conservative Nelle regioni non codificanti le mutazioni sono largamente tollerate A metà strada si collocano le regioni codificanti per funzioni non essenziali e, fra le regioni non codificanti, quelle che vengono trascritte Principali target genetici degli studi tassonomici 16S rdna 23S rdna hsp65 ITS rpob pb altamente conservato divergenza <6% singola copia nei micobatteri a crescita lenta; doppia copia in quelli a crescita rapida 2 regioni ipervariabili A: : elica 10 (inizio posiz.. 120) B : elica 18 (inizio posiz.. 430) Il 16S rrna L elica 18 del 16S rrna L elica 18 del 16S rrna M. tuberculosis 5 CCA TCG ACG AAG GTC CGG GTT CTC TCG GAT TGA CGG TAG GTG GAG AAG AAG C M. chelonae 5 GTA GGG ACG AAG CGA AGG TGA CGG TAC CTA CAG AAG AAG G M. simiae 5 GCA GGG ACG AAG CGC AAG TGA CGG TAC CTG CAG AAG AAG C M. terrae 5 GTA TCG GCG AAG CTC CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA AGA AGC M. tuberculosis 5 CCA TCG ACG AAG GTC CGG --G TTC TCT CGG ATT GAC GGT AGG TGG AGA AGA AGC M. chelonae 5 GTA GGG ACG AAG CGA AGG T GAC GGT ACC TAC AGA AGA AGG M. simiae 5 GCA GGG ACG AAG CGC AAG T GAC GGT ACC TGC AGA AGA AGC M. terrae 5 GTA TCG GCG AAG CTC CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA AGA AGC 2

nucleotidi sono conservative Nelle regioni non codificanti le mutazioni sono largamente tollerate A metà strada si collocano le regioni codificanti per funzioni non essenziali e, fra le regioni non

3 L elica 10 del 16S rrna L elica 10 del 16S rrna M. tuberculosis 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCA CGG GAT GCA TGT CT M. simiae 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA CCA CGG AAC GCA TGT TT M. chelonae 5 CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA CCA CAC ACT TCA TGG TG M. terrae 5 CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis 5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGA ATA GAC CCT TCT GAT CCG ATG GTC M. tuberculosis 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG-A CCA CGG GAT GCA TGT CT M. simiae 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A CCA CGG AAC GCA TGT TT M. chelonae 5 CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A CCA CAC ACT TCA TGG TG M. terrae 5 CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG-A CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis 5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGA ATA GACC CTT CTG ATC CGA TGG TC Filogenesi basata sul 16S rdna Micobatteri a crescita lenta Specie a crescita lenta classiche Specie correlate a M. simiae Specie correlate a M. terrae Micobatteri a crescita rapida Specie a crescita rapida classiche Specie a crescita rapida termotolleranti I T S Spaziatore interposto fra rdna 16S e rdna 23S Lunghezza compresa fra 270 a 400 pb con variabilità concentrata in un tratto di 220 pb Molte specie ne hanno più di una copia A causa dell elevata elevata variabilità molte specie sono caratterizzate da più di un sequevar nel ITS; i sequevar sono particolarmente numerosi in: MAC M. fortuitum complex M. gordonae M. kansasii pb Tratto variabile lungo 250 pb Altissimamente conservato, alcune specie (in particolare quelle del MAC) non sono ben differenziabili 23S rdna hsp65 Gene codificante per la heath shock protein da 65 kda Lunghezza pb con 2 regioni ipervariabili incluse in un tratto variabile di 420 pb Variabilità superiore a quella del 16S rdna Miglior potere discriminatorio delle specie strettamente correlate Bassa variabilità intra-specie 3

terrae 5 CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis 5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGA ATA GAC CCT TCT GAT CCG ATG GTC M.

4 rpob Gene lungo pb codificante per una (la ß) ) delle 5 subunità della RNA polimerasi, il principale enzima del processo di trascrizione Altamente conservato ma più variabile del 16S rdna Presente in singola copia Un tratto ipervariabile di 300 pb, include l hot l spot in cui si concentrano le mutazioni associate alla resistenza alla rifampicina Un secondo tratto ipervariabile di 720 pb è particolarmente idoneo ala differenziazione delle specie micobatteriche a crescita rapida Ceppi con divergenza >3%: specie differenti Ceppi con divergenza <2%: singola specie Contenuto di G+C I micobatteri hanno un contenuto di guanina + citosina (61-71 mol%) più alto rispetto agli altri microorganismi Alcuni generi correlati al genere Mycobacterium hanno un alto contenuto di G+C L informazione fornita dal contenuto di G+C ha un significato grossolanamente comparabile a quello dell alcol alcol-acido acido grafiche del cammino dell grafiche del cammino dell grafiche del cammino dell grafiche del cammino dell 4

copia Un tratto ipervariabile di 300 pb, include l hot l spot in cui si concentrano le mutazioni associate alla resistenza alla rifampicina Un secondo tratto ipervariabile di 720 pb è particolarmente

5 Discrepanze emergenti dall analisi filogenetica di regioni diverse Correlazioni in base al 16S rdna Complesso M. fortuitum, M. peregrinum Complesso M. chelonae, M. abscessus Complesso M. smegmatis Correlazioni in base al rpob Complesso M. fortuitum, M. peregrinum Complesso M. chelonae, M. abscessus Complesso M. mucogenicum Complesso M. mageritense Complesso M. smegmatis Complesso M. wolinskyi Una proposta interessante L analisi filogenetica di vari geni combinati in un unica unica sequenza ne aumenta il potere discriminatorio Geni sparsi qua e làl nel genoma forniscono un immagine più fedele dell dell intero cromosoma PROBLEMA: non esiste un database Evoluzione dei micobatteri a crescita lenta a crescita lenta, correlati a M. terrae a crescita lenta, correlati a M. simiae a crescita rapida, termotolleranti a crescita rapida I caratteri fenotipici Caratteri biochimici Caratteri colturali Velocità di crescita Pigmento Temperature di crescita Analisi dei lipidi di parete Sensibilità agli antibiotici Principali caratteri tassonomici Ruolo centrale del genotipo (sequenziamento e/o omologia DNA- DNA) Criteri fenotipici di esclusione Velocità di crescita Pigmento Temperature di crescita Composizione lipidica della parete Caratteri fenotipici ausiliari Gennaio 2009: il genere Mycobacterium 133 specie ufficialmente riconosciute 7 specie, ben caratterizzate, ma non ufficialmente riconosciute Specie a crescita rapida 53% Specie a crescita lenta 47% Specie non cromogene 51% Specie scotocromogene 46% Specie fotocromogene 3% Specie patogene 61% Specie isolate esclusivamente dall ambiente ambiente 17% Specie isolate dall uomo ma non patogene 16% Specie isolate esclusivamente da animali 6% 5

wolinskyi Una proposta interessante L analisi filogenetica di vari geni combinati in un unica unica sequenza ne aumenta il potere discriminatorio Geni sparsi qua e làl nel genoma forniscono un

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