Proficiency test soia Roundup Ready (GTS )

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1 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA (D.L.vo n. 270) SEDE CENTRALE Roma/Capannelle- Via Appia Nuova, 1411 Tel. (06) (centralino) - Fax (06) BIOTECNOLOGIE Tel Fax crogm@izslt.it demetrio.amaddeo@izslt.it ilaria.ciabatti@izslt.it (GTS ) REPORT N. Laboratorio:

2 Report Sommario Materiali utilizzati per il proficiency test...3 Preparazione... 3 Verifica dell omogeneità dei campioni... 3 Campione A... 3 Campione B... 4 Campione C... 4 Verifica del materiale distribuito per la prova... 6 Analisi dei risultati...7 Analisi dei risultati qualitativi... 7 Analisi dei risultati quantitativi... 7 Calcolo del valore consenso, Xˆ... 7 Il valore di Deviazione Standard Target per il proficiency test, σ p... 7 Calcolo degli z-score... 8 Bibliografia...8 Risultati Analisi Qualitativa (Presenza/Assenza)...9 Campione A... 9 Campione B... 9 Campione C Risultati analisi quantitativa...11 Campione A Campione C Conclusioni...15 Allegati 1. Risultati questionario 2. Verifica risultati questionario (GTS ) Pagina 2 di 15

3 Report Materiali utilizzati per il proficiency test Preparazione I Campioni per il proficiency test sono stati preparati miscelando una farina di mangime contenente soia Roundup Ready ad una concentrazione >5% e una farina derivata da granella di soia non GM. Le farine sono state analizzate separatamente e poi miscelate in modo da ottenere due campioni la cui concentrazione di materiale GM fosse compreso nell intervallo di quantificazione (0,1-5%). Campione Mangime GM Farina non GM A 13 g 637 g B 0 g 700 g C 56 g 644 g I campioni sono stati suddivisi in aliquote da circa 10 g e conservati a temperatura ambiente. Verifica dell omogeneità dei campioni La verifica dell omogeneità dei campioni è stata eseguita in accordo con The international harmonized protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories (IUPAC, 2006). Dieci aliquote di ciascun campione sono state raccolte e analizzate in duplicato. I campioni sono stati estratti utilizzando la metodica CTAB e quantificati tramite PCR Real Time costrutto specifica (UNI EN ISO 21570:2006). Per il campione B le 10 aliquote sono state analizzate in duplicato per la presenza dei marcatori di screening Promotore 35S e Terminatore NOS tramite PCR end point e PCR Real Time costruttospecifica per la presenza di soia Roundup Ready (GTS ). Campione A % LOG Al. n. Replicato 1 Replicato 2 Replicato 1 Replicato 2 1 0,27 0,27-0,569-0, ,24 0,27-0,620-0, ,26 0,28-0,585-0, ,28 0,30-0,553-0, ,28 0,31-0,553-0, ,37 0,35-0,432-0, ,24 0,32-0,620-0, ,28 0,28-0,553-0, ,34 0,33-0,469-0, ,26 0,37-0,585-0,432 Media = -0,534 log 10 % ( 0,293%) target st.dev. (σ p ) = 0,20 [6] s an = 0,048 s am 2 = 0,001 σ all 2 = 0,0036 Valore critico = 0,0091 s am 2 < Valore critico? SI Il campione A è sufficientemente omogeneo (GTS ) Pagina 3 di 15

4 Report Campione B P 35S T NOS CP4EPSPS Al. n. Replicato 1 Replicato 2 Replicato 1 Replicato 2 Replicato 1 Replicato 2 1 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 2 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 3 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 4 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 5 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 6 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 7 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 8 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 9 Neg Neg Neg Neg Neg Neg 10 Neg Neg Neg Neg Neg Neg Il campione B è risultato negativo per la presenza di materiale geneticamente modificato Campione C % LOG Al. n. Replicato 1 Replicato 2 Replicato 1 Replicato 2 1 1,76 1,67 0,246 0, ,70 1,50 0,230 0, ,66 1,82 0,220 0, ,68 1,69 0,225 0, ,62 1,50 0,210 0, ,47 1,56 0,167 0, ,72 1,66 0,236 0, ,71 1,85 0,233 0, ,53 1,53 0,185 0, ,46 1,55 0,164 0,190 Media = 0,212 log 10 % ( 1,628 %) target st.dev. (σ p ) = 0,20 [6] s an = 0,021 s am 2 = 0,0005 σ all 2 = 0,0036 Valore critico = 0,0072 s am 2 < Valore critico? SI Il campione C è sufficientemente omogeneo (GTS ) Pagina 4 di 15

5 Report Rappresentazione grafica dei risultati di quantificazione dei campioni A e C Dispersione Log(%) 0,300 0,200 C = 0,212 0,100 0,000-0,100 Log -0,200-0,300-0,400-0,500 A = -0,534-0,600-0, n. campione Dispersione risultati % 2,00 1,80 1,60 C = 1,628% 1,40 1,20 % 1,00 0,80 0,60 0,40 A = 0,293% 0,20 0, n. campione 11 (GTS ) Pagina 5 di 15

6 Report Verifica del materiale distribuito per la prova Il materiale distribuito è stato conservato a temperatura ambiente per la durata del proficiency. Al termine del round ciascun campione è stato controllato per la quantità di soia Roundup Ready analizzando due aliquote dei campioni A e C, di seguito sono riportati i risultati per il campione A e per il campione C. Campione A Aliquota n. % 1 0,34 2 0,36 Campione C Aliquota n. % 1 1,62 2 1,63 (GTS ) Pagina 6 di 15

7 Report Analisi dei risultati Analisi dei risultati qualitativi I risultati ottenuti sono stati raccolti in tabella in modo da evidenziare il risultato qualitativo espresso sui campioni distribuiti. Per ciascun laboratorio il risultato qualitativo è stato indicato con A quando è risultato in accordo con il risultato consenso, con D ad indicare il disaccordo col consenso. Analisi dei risultati quantitativi Le procedure statistiche utilizzate per la valutazione dei risultati sono state scelte in accordo con The international harmonized protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories ed Calcolo del valore consenso, Xˆ Il valore consenso rappresenta la migliore stima della concentrazione reale dell analita ed è calcolato a partire dai risultati forniti dai partecipanti. La procedura seguita per derivare il valore consenso include: - Raccolta di tutti i risultati quantitativi forniti dai laboratori - Trasformazione logaritmica dei risultati in modo da ottenere una distribuzione normale dei dati [7] - Visualizzazione della distribuzione dei dati sottoforma di Kernel Density Plot. - La distribuzione dei risultati, come osservabile dai grafici di Kernel Density Plot, mostrano assenza di simmetria di distribuzione intorno ad un valore centrale. Come suggerito in [5] è stato utilizzato come valore consenso ( Xˆ ) la mediana e come indice di dispersione lo scarto medio assoluto dalla mediana ( σ ˆ ) - Calcolo dell incertezza standard (u) del valore consenso, calcolata come: con σˆ = scarto medio assoluto dalla mediana. n = numero dei dati. σ u = ˆ n L incertezza della media, calcolata dai risultati, è accettabile quando viene comparata con il valore di deviazione standard target (σ p ). In particolare: 2 2 u < 0,1 σp [5] cioè u 2 < 0, 02 Ciò indica che l incertezza del valore consenso ha un effetto trascurabile sul calcolo dello z-score e quindi Xˆ è considerato come la misura più attendibile [3, 5]. Il valore di Deviazione Standard Target per il proficiency test, σ p Il parametro descrive il valore di incertezza standard più appropriato per l ambito di applicazione dei risultati delle analisi. In particolare la stima del valore di σ p, la deviazione standard target, è un parametro che è usato per fissare il livello ritenuto accettabile per le deviazioni dei laboratori dal valore consenso ( x Xˆ ) e quindi per calcolare i valori di z-score. Il livello di 0,20 per σ p è derivato dall osservazione dei risultati di altri proficiency test per la rilevazione quantitativa di soia Roundup Ready tramite PCR Real Time come descritto in [6]. σ p (GTS ) Pagina 7 di 15

8 Report Calcolo degli z-score I valori di z-score sono stati calcolati utilizzando i dati dopo la loro trasformazione logaritmica. In particolare: ( Logx LogXˆ ) z = σ dove x = risultato del laboratorio Xˆ = valore consenso σ = deviazione standard target p Un valore di z-score uguale a 0 si ottiene quando il risultato del laboratorio è vicino al valore consenso. I valori di z-score compresi tra -2 e +2 indicano un risultato soddisfacente. I valori di z-score al di fuori del range -3 e +3 indicano un risultato insoddisfacente e richiedono un controllo delle procedure di analisi utilizzate. Per i valori compresi negli intervalli da -2 a -3 e da +2 e +3 richiedono attenzione ma sono attesi con una frequenza di 1 volta su 20. Bibliografia 1. Analytical Methods Committee, Robust Statistics How Not to Reject Outliers Part 1. Basic Concepts. Analyst, Dec 1989, Vol Analytical Methods Committee, Robust statistics: a method of coping with outliers. AMC technical brief, No. 6, Apr 2001 ( 3. FAPAS, Protocol for the Food Analysis Assessment Scheme, Organization and Analysis of Data, 6th Edition Fearn T., Thompson M. A new test for sufficient homogeneity. Analyst, 2001, 126, IUPAC. The international harmonized protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories. Pure Appl. Chem., Vol. 78, No. 1, pp , Powell J., Owen L. Reliability of food measurements: the application of proficiency testing to GMO analysis. Accred. Qual. Assur. (2002) 7: Thompson M. et. al., Scoring in genetically modified organism proficiency tests based on Log-transformed results. J. AOAC Int., Vol. 89, No. 1, AMC software p (GTS ) Pagina 8 di 15

9 Report Risultati Analisi Qualitativa (Presenza/Assenza) Legenda: A = Accordo col consenso D = Disaccordo col consenso Campione A Accordo col consenso = 100% Lab n. Rilevato/ non rilevato Risultato A/D Lab n. Rilevato/ non rilevato Risultato A/D 1 Rilevato A 14 Rilevato A 2 Rilevato A 15 Rilevato A 3 Rilevato A 16 Rilevato A 4 Rilevato A 17 Rilevato A 5 Rilevato A 18 Rilevato A 6 Rilevato A 19 Rilevato A 7 Rilevato A 20 Rilevato A 8 Rilevato A 21 Rilevato A 9 Rilevato A 22 Rilevato A 10 Rilevato A 23 Rilevato A 11 Rilevato A 24 Rilevato A 12 Rilevato A 25 Rilevato A 13 Rilevato A Campione B Accordo col consenso = 100% Lab n. Rilevato/ Risultato Lab n. Rilevato/ Risultato non rilevato A/D non rilevato A/D 1 Non Rilevato A 14 Non Rilevato A 2 Non Rilevato A 15 Non Rilevato A 3 Non Rilevato A 16 Non Rilevato A 4 Non Rilevato A 17 Non Rilevato A 5 Non Rilevato A 18 Non Rilevato A 6 Non Rilevato A 19 Non Rilevato A 7 Non Rilevato A 20 Non Rilevato A 8 Non Rilevato A 21 Non Rilevato A 9 Non Rilevato A 22 Non Rilevato A 10 Non Rilevato A 23 Non Rilevato A 11 Non Rilevato A 24 Non Rilevato A 12 Non Rilevato A 25 Non Rilevato A 13 Non Rilevato A (GTS ) Pagina 9 di 15

10 Report Campione C Accordo col consenso = 100% Lab n. Rilevato/ Risultato Lab n. Rilevato/ Risultato non rilevato A/D non rilevato A/D 1 Rilevato A 14 Rilevato A 2 Rilevato A 15 Rilevato A 3 Rilevato A 16 Rilevato A 4 Rilevato A 17 Rilevato A 5 Rilevato A 18 Rilevato A 6 Rilevato A 19 Rilevato A 7 Rilevato A 20 Rilevato A 8 Rilevato A 21 Rilevato A 9 Rilevato A 22 Rilevato A 10 Rilevato A 23 Rilevato A 11 Rilevato A 24 Rilevato A 12 Rilevato A 25 Rilevato A 13 Rilevato A (GTS ) Pagina 10 di 15

11 Report Risultati analisi quantitativa Campione A Lab n. % Log(%) Lab n. % Log(%) ,58-0, ,13-0, ,30-0, ,34-0, ,50-0, ,75-0, ,13-0, ,31-0, ,90-0, ,95-0, ,30-0, ,00 0, ,57-0, ,27 0, ,30-0, ,70-0, < 0,9% n.a. 24 0,90-0, ,58-0, ,75-0, ,80 0,255 n.a. non accettabile - Lab. che non eseguono prove quantitative Rappresentazione della distribuzione dei dati sottoforma di Kernel Density Plot Kernel Density Plot Fixed h:.15 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-1,5-1 -0,5 0 0,5 1 target st. Mediana σ ˆ Incertezza Valore dati n Log 10 % Log% dev. σ u Consenso, % p, Log 10 % 20-0,237 0,231 0,052 0,58 0,20 [6] (GTS ) Pagina 11 di 15

12 Report Risultati z-score Lab n. z-score Lab n. z-score ,0 2-3, ,0 16-1,2 4-0,3 17 0,6 5-3,2 18-1,4 6 1,0 19 1,1 7-1,4 20 1, ,0 9 1,7 22-1,4 10 0, n.a. 24 1,0 12 0,0 25 0,6 13 2,5 n.a. non accettabile - Lab. che non eseguono prove quantitative z-score Campione A 3,0 2,0 1,46% z-score 1,0 0,0-1,0-2,0-3,0 0,58% 0,23% -4, Lab n. Campione A Analita Soia Roundup Ready GTS numero di risultati soddisfacenti dati totali soddisfacenti % % (GTS ) Pagina 12 di 15

13 Report Campione C Lab n. % Log(%) Lab n. % Log(%) ,42 0, ,80-0, ,64 0, ,46 0, ,30 0, ,89 0, ,78-0, ,06 0, ,96 0, ,15 0, ,20 0, >5% A ,51 0, ,18 0, ,70 0, ,60 0, [0,9%;5%] n.a. 24 4,24 0, ,10 0, ,90 0, ,34 0,524 n.a. non accettabile - Lab. che non eseguono prove quantitative A risultato in accordo col consenso Rappresentazione della distribuzione dei dati sottoforma di Kernel Density Plot Kernel Density Plot Fixed h:.15 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ,5 0 0,5 1 1,5 target st. Mediana σ ˆ Incertezza Valore dati n Log 10 % Log% dev. σ u Consenso, % p, Log 10 % 19 0,462 0,187 0,043 2,90 0,20 [6] (GTS ) Pagina 13 di 15

14 Report Risultati z-score Lab n. z-score Lab n. z-score ,9 2-2, ,9 16-1,5 4-0,5 17 0,6 5-2,9 18-0,7 6 1,2 19 0,8 7 0,2 20 A ,3 9 0,8 22-1,2 10-0, n.a. 24 0,8 12 0,1 25 0,0 13 0,3 n.a. non accettabile - Lab. che non eseguono prove quantitative A risultato in accordo col consenso z-score Campione C 3,0 2,0 7,28% z-score 1,0 0,0-1,0 2,90% -2,0 1,15% -3, Lab n. numero di risultati soddisfacenti Campione Analita dati totali soddisfacenti % Soia Roundup Ready C % GTS (GTS ) Pagina 14 di 15

15 Report Conclusioni Il proficiency test per il rilevamento e la quantificazione di soia Roundup Ready (GTS ) ha coinvolto l intera rete di laboratori italiani e un laboratorio rumeno che svolgono il controllo ufficiale per la presenza di OGM in alimenti, mangimi e sementi. I 25 laboratori coinvolti hanno risposto in maniera ottimale alla prova qualitativa per la verifica della presenza/assenza dell analita (accordo col consenso pari al 100%) per i tre campioni (A, B e C). I laboratori (21) che hanno effettuato la prova quantitativa hanno risposto in maniera soddisfacente nell 81% dei casi per il campione a concentrazione più bassa (campione A) e nell 86% per il campione a concentrazione più alta (campione C). Soltanto un laboratorio non ha espresso i risultati in maniera tale da permettere il calcolo dei rispettivi z-score per i campioni A e C. Un solo laboratorio per il campione C ha indicato una concentrazione dell analita al di sopra dell intervallo di quantificazione (>5%); il risultato è stato considerato in accordo col valore consenso in quanto l intervallo individuato dalla distribuzione dei risultati ([1,15%;7,28%]) è in parte al di fuori dell intervallo di quantificazione ([0,1%;5%]). Dalla distribuzione dei dati (Kernel Density Plot) è possibile osservare come la distribuzione dei risultati non è simmetrica intorno ad un valore centrale, per tale motivo è stato scelto come valore di tendenza centrale la mediana [5] e come valore di dispersione lo scarto medio assoluto dalla mediana. Tale inconveniente riteniamo possa essere legato alla natura del campione per due motivi: la miscelazione di due matrici differenti (farina di soia e mangime) e la granulometria dei campioni distribuiti. I limiti di accettabilità del consenso sia per il campione A che per il campione C sono stati 2 2 comunque soddisfacenti essendo in entrambi i casi rispettata la relazione u < 0,1 σp. I dati raccolti attraverso il questionario sono stati organizzati in modo da presentare le risposte pervenute. Per i metodi molecolari utilizzati per l identificazione, la caratterizzazione e la quantificazione abbiamo provveduto ad una verifica e una riorganizzazione delle risposte andando a confrontare, dove possibile, le sequenze comunicate con quelle originali di pubblicazione in modo da fornire uno strumento ulteriore di confronto, pertanto non è da escludere che altre fonti bibliografiche siano altrettanto attendibili di quelle utilizzate per la verifica. (GTS ) Pagina 15 di 15

16 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA (D.L.vo n. 270) SEDE CENTRALE Roma/Capannelle- Via Appia Nuova, 1411 Tel. (06) (centralino) - Fax (06) BIOTECNOLOGIE Tel Fax crogm@izslt.it demetrio.amaddeo@izslt.it ilaria.ciabatti@izslt.it (GTS ) Risultati del questionario

17 Risultati Questionario 1. ESTRAZIONE 1.1 Metodo di estrazione utilizzato: CTAB: 3, 4, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Promega Wizard: 1, 14 GeneEluete Plant Genomic DNA Miniprep kit 2 High Pure GMO sample preparation kit (Roche) 5 Wizard PCR preps DNA Purification System 6 Sure Food Prep Plant X 15 DNeasy Plant mini-kit (Qiagen) 17 Riferimento bibliografico: CRL: "Event specific method for the quantification of maize GA21 using real-time PCR" 3, 24 Lipp et al. J AOAC Int Jul-Aug; 82(4) , 19 SLMB, 2004, 52B 6 ISO 21571: ISO ISO (partenza da 1 g) -A.3-12 DG JRC, Environment, Consumer protection & Food Unit - Method Based on publication of K. Pietsch, U. Waiblinger, P. Brodman and A. Wurz - Screening Method for the 14 identification of genetically modified organisms (gmo) in food. Annex II "Foodstuff-detection of genetically modified organisms and derived products-nucleic acid extraction CEN (draft)" 16 IZSLT POS VIR 052 SUP 10 Allegato alla nota N.600.5/40.4/3921 del inviata dal Ministero della Sanità 20, 23 Doyle & Doyle (modificato) 21 Pagina 2 di 14

18 Risultati Questionario 1.2 Purificazione del DNA: SI 2, 4, 7, 9, 10, 12, 19, 21, 22, 25 NO 1, 3, 5, 6, 8, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 23, 24 Metodo utilizzato: Wizard DNA Clean Up PROMEGA 4, 21 Resina e colonnine Wizard 7 Wizard Resin 19 colonnine silice (Sigma Cleanup kit Genelute) 25 Qiamp DNA mini kit 9 Qiaquick PCR purification kit 10 Qiamp DNA mini kit 12 QIAamp minicolumun (QIAGEN) 22 Pagina 3 di 14

19 Risultati Questionario 2. VERIFICA QUALITA E QUANTITA DEL DNA ESTRATTO Spettrofotometrica SI 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25 NO 4, 21 Strumento: Genequant - Pharmacia Biotech 8 UVIKON Jenway 6405 UV/Vis 5 Biofotometer Eppendorf 3, 6, 9, 12, 14, 17, 18, 20, 23, 24 Biofotometro 6131 Eppendorf 7, 10 GeneQuant Pro - Amersham 13 DU640 Beckman 16 Spettrofotometro UV-Vis doppio raggio Perkin Elmer (modello LAMBDA 25) 19 Agilent 8453E UV-Visibile Spectroscopy System 22 Nanodrop (Celbio) 25 Fluorimetrica SI 4, 7, 10, 21 NO 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24 Strumento: SFM 25 Biotek Instruments 4 Fluorimetro DQ300 Hoefer 7 Victor3V (Perkin Elmer) 10 BIO-TEK 21 Amplificabilità (monitor run) SI 2, 3, 7, 10, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 25 NO 1, 4, 5, 6, 8, 9, 13, 14, 17, 21, 23 Pagina 4 di 14

20 Risultati Questionario 3. DESCRIZIONE DELLE PROVE EFFETTUATE 3.1 Prove qualitative: Rilevazione del gene endogeno LECTINA Prova accreditata: SI 1, 2, 3, 5, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22 NO 6, 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 23, 24 Tipo: PCR end point 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 22, 23, 24 PCR Real Time 1, 2, 10, 18, 19, 21 Metodo di rilevamento Gel 3, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 22, 23 TaqMan 2, 10, 18, 19, 21, 24 Sybr Green 1 Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (n. Lab) Fw 1: cgc cac ccc aaa acc c 79 (1) Rv 1: gct acc ggt ttc ttt gtc cca Fw 1: cgg cac ccc aaa acc c 79 BioRad Laboratories (2, 21) Rv 1: gct acc ggt ttc ttt gtc cca Probe: ctc ttg gtc gcg ccc tct act cca c Fw 1: gac gct att gtg acc tcc tc 181 metodo interno (6) Rv 1: tgt cag ggg cat aga agg tg Fw 1: gcc ctc tac tcc acc ccc atc c Rv 1: gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg 118 UNI EN ISO 21569:2005 (9, 12) Collection of official methods Beuth Verlag GmbH (22) Fw 1: gcc ctc tac tcc acc ccc atc c Rv 1: gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg 485 Nota N.600.5/40.4/3921 a Min. della Salute (20) Pagina 5 di 14

21 Risultati Questionario Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (n. Lab) Fw 1: GMO3 118 JRC-User manual- training course... ed 2004 (5) Rv 1: GMO4 Fw 1: SL9 cat tac cta tga tgc ctc cac c 178 Feasibility study of the pengl Screening Mix "documento per uso membri ENGL, 2004 (16) Rv 1: SL10 aag cac gtc atg cga ttc c Fw 1: tca acg aaa acg agt ctg gtg 180 Hurst et al. Molecular Breeding 5: (1999) (7) Rv 1: ggt gga ggc atc ata ggt aat Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t Rv 1: ggc ata gaa ggt gaa gtt gaa gga 81 IZSLT POS VIR 061 INT (10) ISO/FDIS 21570:2005 (24) Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt cg Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t Rv 1: ggc ata gaa ggt gaa gtt gaa gga Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt gg 81 ISO 2005 (18) Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t Rv 1: gaa gga agc ggc gaa gct Probe: Fornita da Applied Biosystems Fw 1: tgc cga agc aac caa aca tg (Le1) Rv 1: tga tgg tct gat aga att g (Le2) 414 Vaitilingom et al., J. Agric. Food Chem 1999, (47), (19) H Lipp, A Bluth et al. Eur. Food res. Technol (2001) 212: (15) Fw 1: tgc cga agc aac caa aca tga tcc t 118 Meyer & Jaccaud, 1997 (13) Rv 1: tga tgg atc tga tag aat tga cgt t Fw 2: gcc ctc tac tcc acc ccc atc c Rv 2: gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg Gene Scan Sole/D 118 Meyer et al Z. Lebensh. Unters. forsh. 203, (14, 23) (17) IZSLT POS VIR 055 INT (8) (3) Pagina 6 di 14

22 Risultati Questionario Rilevazione del Promotore 35S Prova accreditata: SI 1, 2, 3, 5, 7, 12, 13, 15, 20, 22, 24 NO 6, 7, 8, 9, 14, 16, 17, 19, 23 Tipo: PCR end point 3, 5, 6, 7, 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 20, 22, 23, 24 PCR Real Time 1, 2, 14, 19 Metodo di rilevamento Gel 3, 5, 6, 7, 7, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 20, 22, 23, 24 TaqMan 2, 14, 19 Sybr Green 1 Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (n. Lab) Fw 1: cca cgt ctt caa agc aag tgg 123 Lipp et al., Eur. Food Res. Technol 212: (2001) (3, 7, 15, 16, 22, 24) Rv 1: tcc tct cca aat gaa atg aac ttc c Fw 1: cct aca aat gcc atc att gcg 205 Metodo interno (6) Rv 1: ggg tct tgc gaa gga tag tg Fw 1: gcc tct gcc gac agt ggt 81 ISO 21570:2005(E) pag (14) Rv 1: aag acg tgg ttg gaa cgt ctt c Probe: caa aga tgg acc ccc acc cac g Fw 1: gct cct aca aat gcc atc a Rv 1: gat agt ggg att gtg cgt ca 195 Circ. Min /40.4/3921 del (7, 20, 23) UNI EN ISO 21569:2005 (9, 12) Fw 1: p35s-cf3 123 Lipp et al, 1999 (13) (1, 17) JRC-User Manual ed 2004 (5) Rv 1: p35s-cr4 Fw 1: tgc ctc tgc cga cag tgg tc Rv 1: aag acg tgg ttg gaa cgt ctt c Probe: caa aga tgg acc ccc acc cac g 83 Sist. Ufficiale Svizzero (P. Hubner) citato da Bio-Rad Laboratories (2) IZSLT POS VIR 057 INT (8) Kit Applied Biosystems (19) Pagina 7 di 14

23 Risultati Questionario Rilevazione del Terminatore NOS Prova accreditata: SI 5, 7, 13, 15, 20, 22, 24 NO 3, 6, 7, 14, 16 Tipo: PCR end point 3, 5, 6, 7, 7, 13, 15, 16, 20, 22, 24 PCR Real Time 14 Metodo di rilevamento Gel 3, 5, 6, 7, 7, 13, 15, 16, 20, 22, 24 TaqMan 14 Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (Lab n.) Fw 1: gaa tcc tgt tgc cgg tct tg 180 Circ. Min /40.4/3921 del (7, 20) Rv 1: tta tcc tag ttt gcg cgc ta Fw 1: gac acc gcg cgc gat aat tta tcc Rv 1: gca tga cgt tat tta tga gat ggg 118 Lipp et al., Eur. Food Res. Technol 212: (2001) (7) Fw 1: gca tga cgt tat tta tga gat ggg 118 Metodo interno (6) Rv 1: gac acc gcg cgc gat aat tta tcc Lipp et al., Eur. Food Res. Technol 212: (2001) (15, 16, 22, 24) Fw 1: gtc ttg cga tga tta tca tat aat ttc tg 151 J. AOAC INT. 2002, vol. 85 n.5, (14) Rv 1: cgc tat att ttg ttt tct atc gcg t Probe: aga tgg gtt ttt atg att aga gtc ccg caa Fw 1: HA-nos 118-f Rv 1: HA-nos 118-r 118 JRC-User Manual ed (5) Fw 1: tta tcc tag ttt gcg cgc ta 180 Lipp et al, 1999 (13) Rv 1: gaa tcc tgt tgc cgg tct tg 123 MasterMix Gene Scan (3) Pagina 8 di 14

24 Risultati Questionario Rilevazione Specifica della Soia Roundup Ready (GTS ) Prova accreditata: SI 12, 13, 14, 19, 20, 21, 22 NO 3, 7, 8, 9, 15 (in accr.), 17, 23 Tipo: PCR end point 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 22, 23 PCR Real Time 19, 21 Metodo di rilevamento Gel 3, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 22, 17, 20 TaqMan 19, 21 Target Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (Lab n.) 35S:EPSPS Fw 1: atc cca cta tcc ttc gca aga 169 European Commission "The analysis of food sample for the Rv 1: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa presence of genetically modified organisms" sector 8,... (12) CP4EPSPS Fw 1: atc cca cta tcc ttc gca aga 169 Meyer et al Z. Lebensh. Unters. forsh. 203, (9) Rv 1: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa CP4EPSPS Fw 1: cat tcc cgg cga caa gtc 105 Protocollo Bio-Rad (21) Rv 1: ttg atg acg tcc tcg cct tc Probe: cct tca tgt tcg gcg gtc tcg c CP4EPSPS Fw 1: cca ctg acg taa ggg atg acg 169 (17) Rv 1: cat gaa gga ccg gtg gga gat Fw 2: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa Rv 2: atc cca cta tcc ttc gca aga CP4EPSPS Fw 1: cca ctg acg taa ggg atg acg 169 R. Meyer, E. Jaccaud (1997): Detection of genetically modified... Rv 1: cat gaa gga ccg gtg gga gat Proceedings of the IX European Conference on food chemistry Fw 2: atc cca cta tcc ttc gca aga (Vol., 23-28) (20) Rv 2: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa Pagina 9 di 14

25 Risultati Questionario Target Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (Lab n.) CP4EPSPS Fw 1: tga tgt gat atc tcc act gac g 171 Metodo interno (6) Rv 1: tgt atc cct tga gcc atg ttg t CP4EPSPS Fw 1: ttg gag agg aca cgc tga ca Vaitilingom et al., J. Agric. Food Chem 1999, (47), (19) Rv 1: cca tgt tgt taa ttt gtg cca ttc Probe: sequenza non disponibile CP4EPSPS-CTP Fw 1: cca ctg acg taa ggg atg acg 169 R. Meyer, E. Jaccaud (1997) Proceedings of the IX European Rv 1: cat gaa gga ccg gtg gga gat Conference on food chemistry (Vol., 23-28) (14, 23) Fw 2: atc cca cta tcc ttc gca aga Rv 2: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa CP4EPSPS-CTP Fw 1: atc cca cta tcc ttc gca aga 169 (22) Rv 1: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa P35S-CPT Fw 1: cca cta tcc ttc gca aga ccc ttc c 120 Hurst et al. Molecular Breeding 5: (1999) (12) Rv 1: ttg tat ccc ttg agc cat gtt gt Fw 1: tga tgt gat atc tcc act gac g 171 Working Group EU project SMT4-ct (13) Rv 1: tgt atc cct tga gcc atg ttg t Fw 1: cat gaa gga ccg gtg gga gat 169 Rv 1: cca ctg acg taa ggg atg acg Fw 2: tgg ggt tta tgg aaa ttg gaa Rv 2: atc cca cta tcc ttc gca aga H Lipp, Eur. Food res. Technol (2001) 212: (15) kit GeneScan (8) 128 MasterMix Gene Scan (3) Pagina 10 di 14

26 Risultati Questionario 3.2 Prova quantitativa: Prova accreditata: SI 2, 5, 13, 16, 19, 20, 21, 24 NO 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 22, 25 (in accr.) Sistema di quantificazione: Serie di standard a concentrazioni percentuali note (%) 3, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24 Numero di copie: diluizioni di DNA estratto da uno standard 2, 25 Percentuale: diluizioni di DNA estratto da uno standard 4 ng di DNA: diluizioni di DNA estratto da uno standard 14 kit: Lightcycler gmo soya quantification kit - Roche 5 Metodo di rilevamento: Taq Man Probe 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25 FRET 5 Strumentazione utilizzata per la prova quantitativa: Modello Marca Lab. ABI Prism 7700 Applied Biosystems 9, 12, 13, 19, 22, 24, 25 ABI Prism 7900 Applied Biosystems 3 ABI Prism 7900 Fast Applied Biosystems 10 ABI Prism 7300 Applied Biosystems 17 ABI Prism 7000 Applied Biosystems 7, 16 Gene Amp 5700 SDS (2001) Applied Biosystems 20 icycler BioRad 4, 6, 14, 18, 21 Icycler iq BioRad 2 Lightcycler 2.0 Roche 5 Stima dell incertezza di misura SI 2, 6, 13, 19, 20, 24, 25 NO 3, 4, 5, 7, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 21, 22 Pagina 11 di 14

27 Risultati Questionario Sistema endogeno: LECTINA Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (Lab n.) Fw 1: aac cgg tag cgt tgc cag Rv 1: agc cca tct gca agc ctt t Probe: ttc gcc gct tcc ttc aac ttc acc t Fw 1: cgg cac ccc aaa acc c Rv 1: gct acc ggt ttc ttt gtc cca Probe: ctc ttg gtc gcg ccc tct act cca c Fw 1: cgg cac ccc aaa acc c Rv 1: gct acc ggt ttc ttt gtc cca Probe: cct tca tgt tcg gcg gtc tcg c Fw 1: ctt tct cgc acc aat tga ca Rv 1: tca aac tca aca gcg acg ac Probe: cca caa aca cat gca ggt tat ctt gg Fw 1: gcc ctc tac tcc acc ccc atc c Rv 1: gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt cg Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t Rv 1: ggc ata gaa ggt gaa gtt gaa gga Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt cg Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t 81 Rv 1: ggc ata gaa ggt gaa gtt gaa gga Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt cg Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t 96 Rv 1: ggc ata gaa ggt gaa gtt gaa gga Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt cg Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t Rv 1: ggc ata gaa ggt gaa gtt gaa gga Probe: aac cgg tag cgt tgc cag ctt cg Vaitilingom et al., J. Agric. Food Chem 1999, (47), ; Circolare Ministero della Salute Prot.n. DGVA -IV/5674 P I.4.CC.8 del 16/2/2005, Allegato 8 (20) 79 Bio-Rad Laboratories (2, 4) 79 Bio-Rad Laboratories (21) 102 Knot G Berdal, Eur Food Res Technol : (25) 81 SLMB-Methode 52B/2.1.3/2000 / ISO21570:2005(E) (22) 80 Protocollo Ufficiale Svizzero Analisi Alimenti (7) IZSLT POS VIR 061 (3, 10) UNI EN ISO (9, 12, 13, 14) ISO 2005 (18) - SLMB, 2000, 52B (6) ISO/FDIS 21570:2005 (24) Taverniers I et al Eur. Food Res Technol. 213: (16) (17) Pagina 12 di 14

28 Risultati Questionario Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (Lab n.) Fw 1: tcc acc ccc atc cac att t Rv 1: gaa gga agc ggc gaa gct Probe: non disponibile Vaitilingom et al., J. Agric. Food Chem 1999, (47), (19) Sistema transgenico: Livello di specificità: elemento specifico 7, 16 costrutto specifico 2, 14, 22, 24 evento specifico 3, 4 Target Sequenze oligonucleotidi (5-3 ): bp Rif. Bibl. (Lab n.) CP4 EPSPS Fw 1: cat tcc cgg cga caa gtc 105 BioRad Laboratories (2, 21) Rv 1: ttg atg acg tcc tcg cct tc Probe: cct tca tgt tcg gcg gtc tcg c CP4 EPSPS Fw 1: cat tcc cgg cga caa gtc 105 BioRad Laboratories (18) Rv 1: ttg atg acg tcc tcg cct tc Probe: cct tca tgt tcg gcg gtc tcg g CP4 EPSPS Fw 1: cct tta gga ttt cag cat cag tgg 121 Kuribara et al., J. AOAC Int. 85, 5, 2002, (4) Rv 1: gac ttg tcg ccg gga atg Probe: cgc aac cgc ccg caa atc c CP4 EPSPS Fw 1: gca aat cct ctg gcc ttt cc Vaitilingom et al., J. Agric. Food Chem 1999, (47), ; Rv 1: ctt gcc cgt att gat gac gtc Circolare Ministero della Salute Prot.n. DGVA -IV/5674 P I.4.CC.8 Probe: ttc atg ttc ggc ggt ctc gcg del 16/2/2005, Allegato 8 (20) CP4 EPSPS CTP-EPSPS Fw 1: gcc atg ttg tta att tgt gcc at Rv 1: gaa gtt cat ttc att tgg aga gga c Probe: ctt gaa aga tct gct aga gtc agc ttg tca gcg Fw 1: gcc atg ttg tta att tgt gcc at Rv 1: gaa gtt cat ttc att tgg aga gga c Probe: ctt gaa aga tct gct aga gtc agc ttg tca gcg 83 IZSLT POS VIR 061 (3, 10) SLMB-Methode 52B/2.1.3/2000 / ISO21570:2005(E) (22) UNI EN ISO (13) - ISO/FDIS 21570:2005 (24) 83 UNI EN ISO 21570:2005 (9, 12, 14) Pagina 13 di 14