BEIA EBV VCA IgG Quant 21850

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1 BEIA EBV VCA IgG Quant Edizione Solo per uso professionale TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA EBV VCA IgG Quant è un test immunoenzimatico qualitativo/quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma degli anticorpi di classe IgG specifici verso l antigene capsidico VCA gp 125 del Epstein Barr Virus (EBV). SIGNIFICATO CLINICO L'Epstein Barr Virus (EBV) appartiene alla famiglia erpetica e rappresenta l'agente eziologico di numerose patologie umane tra le quali la mononucleosi infettiva è la più frequente. Durante l'infanzia l'infezione primaria da EBV è asintomatica mentre nell'adolescenza circa la metà dei soggetti presentano segni clinici caratteristici della mononucleosi infettiva. L'infezione da Epstein Barr Virus comporta la produzione di anticorpi diretti verso differenti complessi antigenici quali gli anticorpi anti-ebna (Nuclear Antigen), gli anticorpi anti-ea (Early Antigen) e gli anticorpi anti-vca (Viral Capsid Antigen). La rilevazione degli anticorpi IgG anti-vca consente, in presenza di IgM anti-vca, di diagnosticare la fase attiva dell'infezione, mentre in assenza di IgM anti-vca e in presenza di IgG anti-ebna-1 consente di diagnosticare la fase pregressa. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA EBV VCA IgG Quant è un dosaggio immunoenzimatico in micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con l'antigene VCA. I campioni da esaminare vengono incubati nei micropozzetti; le IgG del campione si legano formando un complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgG anti-vca viene rilevata attraverso il legame con un anticorpo monoclonale anti-igg umane coniugato con perossidasi (HRP). Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato viene aggiunto il Substrato-TMB che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

3 L aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla quantità di IgG specifiche presenti nel campione in esame. Nei kit BEIA EBV VCA IgG Quant la concentrazione degli anticorpi di classe IgG viene calcolata mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione ed espressa in Unità Arbitrarie/mL. CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96 determinazioni. Componente SORB A Strip da 8 micropozzetti frazionabili 12x8x1 CAL 0 B Calibratore 0 (0 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibratore 1 ( 10 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibratore 2 ( 20 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibratore 3 ( 50 UA/mL) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibratore 4 ( 120 UA/mL) 1 x 2 ml DIL SPE D Diluente Campioni BEIA System 1 x 120 ml CONJ E Coniugato 1 x 13,5 ml BUF WASH 20X F Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml SUBS TMB G Substrato-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 H Soluzione Stoppante 1 x 25 ml Istruzioni per l uso 1 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con antigene capsidico EBV gp 125 purificato, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli. B. Calibratore 0 UA/ml Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-vca. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

4 C. Calibratori 10, 20, 50 e 120 UA/mL Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG anti-vca. Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagenti pronto all uso D. Diluente Campioni BEIA System Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09% di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente pronto all'uso. E. Coniugato Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-igg umane, marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso. F. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti G. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB stabilizzanti e colorante (rosa). Reagente pronto all'uso. H. Soluzione Stoppante Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. REAGENTI INTERCAMBIABILI Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il Substrato- TMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

5 MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi. Evitare l'essiccamento dei micropozzetti. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del campione. Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

6 PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario, aliquotare i campioni e congelarli a -20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi esecuzione del test. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile 15 giorni se conservato a 2-8 C e comunque non oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso. CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i pozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i pozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al termine del lavaggio. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

7 ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). 1. Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni BEIA System (esempio 10 µl di siero e 800 µl di Diluente Campioni BEIA System). Agitare su Vortex. 2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame e dei Calibratori (vedi il paragrafo Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. 3. Quantitativo: Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in esame prediluito e dei calibratori. Qualitativo : Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in esame prediluito, del Calibratore 0 (0 UA/mL), del Calibratore 1 (10 UA/mL) e del Calibratore 4 (120 UA/mL) 4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Coniugato. 7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm. CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

8 il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (120 UA/mL) e la DO del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere 5.0. il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UA/mL) e la DO del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere 0.5. Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non conformità. CALCOLO QUANTITATIVO Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore e campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del 20%). Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle densità ottiche di ogni calibratore sull asse delle ordinate e le corrispondenti concentrazioni sull asse delle ascisse. Disegnare la migliore curva che passi attraverso i punti della calibrazione. Per calcolare la concentrazione di IgG anti-vca di ogni campione riportare il valore della densità ottica sull asse delle ordinate e collegare con una linea retta alla curva di calibrazione. Al punto di intersezione, collegare con una linea verticale all asse delle ascisse e leggere il corrispondente valore di IgG anti-vca. Qualora si disponesse di un sistema di calcolo automatico si consiglia di utilizzare una delle seguenti funzioni matematiche: spline cubica, iperbolica e lineare punto a punto. I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall utilizzatore. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

9 Esempio di calcolo con interpolazione spline cubica: Calibratori UA/mL Densità Ottica UA/mL Cal Cal Cal Cal Cal Campione A Campione B Campione C CALCOLO QUALITATIVO Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l index anticorpale (I.A.) con la seguente formula: DO campione Index anticorpale (I.A.) = DO Calibratore 1 (10 UA/mL) Per il Calibratore 1 (10 UA/mL) calcolare, se eseguito in multiplo, il valore medio di densità ottica (mdo). I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore. Esempio di calcolo: 1ª DO 2ª DO mdo I.A. Calibratore 0 (0 UA/mL) Calibratore 1 (10 UA/mL) Calibratore 4 (120 UA/mL) Campione A Campione B Campione C Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

10 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: Metodo Qualitativo IA Metodo Quantitativo UA/mL INTERPRETAZIONE > 1.1 > Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-vca Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-vca ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe IgG anti-vca Va tenuto presente che: - il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di classe IgG. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo; - una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili. Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione, eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello; - risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento. - La sierodiagnosi dell' EBV richiede la determinazione di più di un parametro e al momento non esiste un accordo universale di interpretazione del profilo sierologico. Nella tabella seguente viene riportato un criterio interpretativo dei test sierologici per l'ebv: Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

11 VCA-IGG VCA-IGM EBNA-1 IGG INDICAZIONI Neg Neg Neg Nessuna indicazione di infezione (soggetto suscettibile ) Neg/ Pos Pos Neg Infezione primaria acuta Pos Pos/Neg Neg/ Pos Infezione primaria recente Pos Neg Pos Infezione pregressa Pos Pos Pos Possibile riattivazione o infezione cronica Sono noti casi di perdita di produzione di IgG anti-ebna-1 in fase pregressa dell infezione (ad es. soggetti immunodepressi), casi di infezione primaria acuta senza produzione di IgM anti-vca (molto rari ) e casi di persistente presenza di IgM anti-vca nella fase pregressa dell infezione ( rari ). In questi casi il test IgG/IgM anti EA-D ed il test di avidità IgG VCA possono essere utilizzati per meglio interpretare lo stato clinico del paziente. La concentrazione di IgG anti-vca gp 125 nell infezione pregressa tende a diminuire nel tempo e può in alcuni casi presentare valori inferiori a 10 UA/mL. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

12 SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le prestazioni del kit BEIA EBV VCA IgG Quant nei confronti di un kit già immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA VCA IgG) BEIA EBV VCA IgG Quant EIA VCA IgG Da questi dati si ottiene: Sensibilità relativa 98.6% Specificità relativa 100% Concordanza 98.6% LIMITE DI RILEVAZIONE Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di rilevazione in 0.6 UA/mL. SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 2,5 g/l di emoglobina, fino a 340 mol/l di bilirubina e fino a 4 g/l di trigliceridi. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando un campione negativo con concentrazione < 5 UA/mL e due campioni positivi a due concentrazioni di circa 18 UA/mL e 75 UA/mL. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 15% per il campione negativo ed inferiori al 10% per i due campioni positivi. LIMITAZIONI Contaminazione batterica dei campioni o ripetuti scongelamenti e congelamenti possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

13 PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Reagenti pericolosi Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle S2-26 Conservare fuori dalla portata dei bambini. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

14 SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni Dispensare Metodo Qualitativo 100 L di Calibratore 0 (0 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 1 (10 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 4 (120 UA/mL) in doppio 100 L di campione prediluito in singolo o doppio, Metodo Quantitativo 100 L di Calibratore 0 (0 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 1 (10 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 2 (20 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 3 (50 UA/mL) in doppio 100 L di Calibratore 4 (120 UA/mL) in doppio 100 L di campione prediluito in singolo o doppio, Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm Test qualitativo Test quantitativo Qual 2 3 Quant 2 3 A Cal 0 P3 A Cal 0 Cal 120 B Cal 0 B Cal 0 Cal 120 C Cal 10 C Cal 10 P1 D Cal 10 D Cal 10 P2 E Cal E Cal 20 P3 F Cal F Cal 20. G P1.. G Cal 50. H P2 H Cal 50. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

15 BEIA EBV VCA IgG Quant Version For professional use only TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

16 INTENDED USE The BEIA VCA IgG Quant kit is a qualitative/quantitative enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies to Epstein Barr Viral Capsid Antigen (VCA) gp 125 in human serum or plasma samples. CLINICAL RELEVANCE Epstein Barr Virus (EBV), belonging to the Herpers virus family, is the etiological agent triggering many different human infections, among which infectiuos mononucleosis is the most frequent. During childhood a primary EBV infection is usually asymtomatic while during adolescence half of the subjects show typical clinical evidence of infectious mononucleosis. During EBV infection antibodies directed against different antigen complexes are developed, like anti-ebna (Nuclear Antigen), anti-ea ( Early Antigen), and anti-vca (Viral Capsid Antigen) antibodies. The presence of anti-vca IgG antibodies associated to anti-vca IgM antibodies leads to the diagnosis of an active infection while the non detectable levels of anti-igm VCA with the presence of anti- EBNA-1 IgG antibodies is a reliable diagnostic tool for past infection. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA EBV VCA IgG Quant kit is a qualitative/quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgG antibodies to VCA, in human serum or plasma. During the first incubation, only anti-vca specific antibodies present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the VCA antigen. After the first incubation the wells are washed to remove non-reactive serum components. During the second incubation a monoclonal antibody anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) is added. After a second washing cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent incubation. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

17 The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is directly proportional to the specific IgG anti-vca concentration in the patients samples. Since no International references were available, the BEIA EBV VCA IgG Quant has been arbitrarly calibrated. KIT COMPONENTS Package size: 96 tests. Component SORB A Coated Strip 12x8x1 CAL 0 B Calibrator 0 (0 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibrator 1 ( 10 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibrator 2 ( 20 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibrator 3 ( 20 AU/mL) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibrator 4 (120 AU/mL) 1 x 2 ml DIL SPE D Sample Diluent BEIA System 1 x 120 ml CONJ E Conjugate 1 x 13,5 ml BUF WASH 20X F Wash Buffer 1 x 100 ml SUBS TMB G Substrate-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 H Stop Solution 1 x 25 ml Package insert 1 A. Coated strips Breakable strips coated with purified capsid gp 125 EBV antigen packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. B. Calibrator 0 AU/mL Negative human serum for IgG antibodies anti-vca. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. C. Calibrators AU/mL Human serum, containing IgG antibodies anti-vca with different known concentrations. Contain 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

18 D. Sample Diluent BEIA System Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent E. Conjugate Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase. Ready to use reagent. F. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di Kathon CG and Tween 20. See Preparation of reagents. G. Substrate-TMB Tetramethylbenzidine(TMB)/H2O2 in stabilizing buffered solution. Contains pink dye. Ready to use reagent. H. Stop Solution 1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. INTERCHANGEABLE REAGENTS The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop Solution are common to all BEIA kits. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionised water. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

19 WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Only take the quantity necessary for the assay. Avoid wells drying. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. For repeated assays, each time provide for new diluted samples. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed on serum or plasma (heparin EDTA). Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See assay protocol. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

20 PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (20 X) Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 C; in any case, do not use it after expiry date printed on the original label. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. 1. Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent BEIA System (i.e. 10 µl of serum and 800 µl of Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex. 2. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed and the Calibrators (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. 3. Quantitative: Dispense 100 µl of each Calibrator and of the diluted sample. Qualitative: Dispense 100 µl Calibrator 0 (0 AU/mL), Calibrator 1 (10 AU/mL), Calibrator 4 (120 AU/mL) and of the diluted samples. 4. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

21 5. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 6. Dispense 100 µl of Conjugate in each well. 7. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 8. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 9. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. 10. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 11. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 12. Read the optical density (OD) in bi-chromatism at 450/620 nm. CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: The ratio of the OD for Calibrator 4 (120 AU/mL) to the OD for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be 5.0 The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 AU/mL) to the OD for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be 0.5 If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The non conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. QUANTITATIVE CALCULATION OF RESULTS Calculate the average O.D. values for each set of duplicate calibrators and samples (duplicates should have a CV < 20%). Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

22 Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each calibrator concentration on the ordinate against the IgG anti-vca concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the points of the graph. To determine the concentration of IgG anti-vca for each sample, first find the O.D. value on the ordinate and extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the corrisponding IgG anti-vca concentration. If an automated processor is available it s advise to select among the following curve fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line. The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. Example of calculation with cubic spline fit: Calibrators AU/mL O.D. AU/mL Cal Cal Cal Cal Cal Sample A Sample B Sample C QUALITATIVE CALCULATION OF RESULTS In order to correlate the analytical results to the immunity of the sample results should be determined calculating the antibody index (A.I.) using the following formula: O.D. sample Antibody Index (A I) = O.D. Calibrator 1 (10 AU/mL) For the Calibrator 1 (10 AU/mL) calculate, if assayed in duplicate, the mean OD value (mod). The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

23 1ª O.D. 2ª O.D. O.D. A.I. Calibrator 0 (0 AU/mL) Calibrator 1 (10 AU/mL) Calibrator 4 (120 AU/mL) Sample A Sample B Sample C INTERPRETATION OF RESULTS (Laboratory staff should establish their own specific cut-off in order to tell positive from negative patient samples). Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: QUALITATIVE A.I. QUANTITATIVE AU/mL > < INTERPRETATION Sample should be considered POSITIVE for the presence of anti- VCA IgG antibodies. Sample should be considered NEGATIVE for the presence of anti-vca IgG antibodies. GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE for the presence of anti-vca IgG antibodies. Please consider that: - the test only detects specific IgG antibodies. It cannot per se and univocally be referred to as evidence of infection; - a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests; Pag BEIA EBV VCA IgG Quant Ed

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