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1 Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione

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4 Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono trasferiti in una provetta da 1,5 ml, a cui si aggiungono : 30 µl di H2O bidistillata e autoclavata, per ottenere un volume di 50 µl. 5 µl di ammonio acetato 5 M 100 µl di etanolo al 100% 20 minuti a -20 centrifugazione a RPM per 15 minuti

5 Aspirare la fase liquida 200 µl di etanolo 80% Si effettua una seconda centrifugazione a RPM per 15 minuti, nuovamente si aspira la fase liquida senza toccare il pellet Liofilizzare

6 Marcatura La reazione di marcatura è una variante della reazione a catena della polimerasi (PCR). Big Dye: dntps, dideossinucleotidi (ddntps ) mancanti del 3 -OH oltre che del 2 -OH, Buffer per stabilizzare la reazione, MgCl2 che si inserisce nel sito attivo della Taq favorendo l attacco al gruppo 3 -OH, Taq polimerasi.

7 Nella reazione di sequenza inoltre viene usato un solo primer, che per convenzione è il primer L. L15996 per il tratto HVS-1 e L29 per HVS-2. I ddntps sono marcati con fluorocromi, ognuno diverso per ogni base. I quattro fluorocromi daranno una diversa emissione quando saranno letti dalla macchina del sequenziatore

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10 Precipitazione dei prodotti marcati L amplificato viene trasferito s una provetta da 1,5ml a cui si aggiungono 2 µl di sodio acetato 3 M 50 µl di etanolo al 95%. T ambiente per 15 minuti. centrifuga per 30 minuti a 2500 RPM. Al termine dei 30 minuti 150 µl di etanolo al 70% nuova centrifugazione a RPM per 10 minuti. Liofilizzare

11 Preparazione del prodotto marcato per il sequenziamento Il templato liofilizzato ottenuto dalla precipitazione deve essere denaturato prima di essere portato al sequenziatore automatico. Le condizioni per questa preparazione sono le seguenti: Si aggiungono 20 µl di formammide al materiale liofilizzato; Si conserva in un ambiente fresco per evitare una rinaturazione e si porta al sequenziatore.

12 SEQUENZIAMENTO Il sequenziamento permette di ricostruire l ordine delle basi azotate che si susseguono all interno di un tratto di DNA. La tecnica del sequenziamento automatico prende spunto dal metodo Sanger, dove si ha l utilizzo di un isotopo radioattivo dello zolfo.

13 Metodo Sanger Il metodo di Sanger prevede la sintesi di nuovi filamenti usando ddntps marcati di solito con 35S. La reazione di sequenza è suddivisa in provette ciascuna contenente DNA stampo, primer, DNA polimerasi, 4 dntps e un ddntps radioattivo. Al termine della reazione si ottengono tanti frammenti tutti con l estremità 5 in comune ma con diversa lunghezza perché ognuno bloccato in posizione diversa durante l allungamento.

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15 Il sequenziamento automatico usato per questo lavoro usa fluorocromi non radioattivi e non tossici per marcare i diversi ddntps e prevede l uso dell elettroforesi capillare. Il sequenziatore automatico che è stato usato, ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Perkin Elmir Applied Biosystem), possiede 4 capillari. Questo strumento effettua un sequenziamento mediante un'elettroforesi capillare usando come mezzo di separazione un polimero incluso nel capillare di silice.

16 La soluzione contenente l amplificato è posta a contatto con l anodo del capillare a cui viene applicato un potenziale elettrico. Le molecole del campione cominciano quindi a migrare con velocità differenti lungo il capillare. I frammenti migreranno nel capillare dal più piccolo al più lungo fin quando non arriveranno a una zona detta finestra del capillare dotata di un colore più trasparente rispetto al resto del capillare.

17 I frammenti di DNA marcati, colpiti da una sorgente luminosa (laser ad Argon), emettono una fluorescenza che viene rilevata, man mano che si spostano lungo il gel elettroforetico, da un sensore. La fluorescenza rilevata dal sensore proviene da quattro differenti colori ognuno dei quali è associato ad una base nucleotidica: adenina, citosina, timina e guaina.

18 La rappresentazione dei risultati ottenuti viene effettuata tramite un elettroferogramma. In esso ogni picco rappresenta una base letta durante il passaggio nel capillare in base alla remissione dei fotoni di DNA in seguito a sollecitazione con laser. Inoltre più molecole saranno colpite dal laser e più alto sarà il picco. È così possibile, con l aiuto di programmi appositi, individuare la successione delle basi che formano la sequenza.

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21 Aplotipo: set di mutazioni ereditate insieme (diverso dal concetto di aplotipo in senso genetico). Aplogruppo : un insieme di aplotipi tra loro differenti, tutti però originati dallo stesso aplotipo ancestrale. In particolare, tutti gli aplotipi di un aplogruppo presentano mutazioni a singolo nucleotide (SNPs) presenti nella forma ancestrale, più ulteriori polimorfismi che li rendono specifici e differenti tra di loro.

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