Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici

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1 Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici In questa lezione darò qualche breve cenno sui metodi di sequenziamento del DNA e specialmente quelli con marcatura fluorescente che attualmente vengono effettuati con apparecchiature automatiche. Il sequenziamento del DNA viene sempre più usato nella diagnostica medica perché molti laboratori, anche di piccole dimensioni, cominciano ad essere dotati delle apparecchiature necessarie. Sequenziare un frammento di DNA, per esempio per la identificazione di mutazioni del genoma, è diventato relativamente facile e veloce, senza dubbio più veloce che sequenziare una proteina, cioè determinare la sequenza amminoacidica di una proteina. A tal punto che, come sapete, la determinazione della sequenza dell intero genoma umano è già stata portata a compimento. Sequenziare un frammento di DNA significa stabilire la successione dei nucleotidi che ne formano la molecola: ACGGGGGGTTTAGCGCGATTCCAT Il sequenziamento del DNA viene attualmente effettuato con un metodo descritto già alla metà degli anni settanta da un certo Sanger. Sono stati abbandonati i metodi chimici di Maxam e Gilbert. Oggi in molte applicazioni si effettua il sequenziamento diretto: che cosa vuol dire? Fino a non molto tempo fa una sequenza di DNA prevedeva il clonaggio del frammento da sequenziare, una procedura che richiedeva e richiede l inserimento del frammento in un vettore, ad esempio un plasmide, che viene poi inserito in un batterio per poterlo replicare. Oggi è possibile evitare il clonaggio del frammento da sequenziale grazie alla possibilità di amplificare il DNA bersaglio con l uso della PCR (clonaggio a-cellulare). Il metodo di Sanger si basa sulla metodica di terminazione della catena coi di-deossi nucleotidi. E attualmente il metodo più usato per definire mutazioni specifiche. I vantaggi principali di questo metodo risiedono nella facilità d uso, e questa è stata aumentata negli anni recenti con l introduzione di marcature fluorescenti e sistemi automatizzati che hanno ovviato alla necessità di sostanze radioattive. Anche se il prezzo iniziale delle apparecchiature è elevato esso è compensato da una chimica single tube (in una sola provetta) e da una rapida analisi e definizione delle basi (base calling). Il vantaggio principale di sequenziare direttamente il DNA usando la PCR anziché sequenziare col clonaggio è che solo una sequenza deve essere determinata. I dati ottenuti rappresentano una media della sequenza dei DNA bersaglio in soluzione. Alternativamente, quando vengono sequenziati cloni di PCR un minimo di 4 o 5 differenti set di dati devono essere determinati.

2 Il principio su cui si basa il sequenziamento del DNA consiste nel blocco della reazione di estensione della catena DNA mediante i cosiddetti analoghi delle basi. Queste sono molecole molto simili a deossiribonucleotidi ma mancano dell ossidrile nel carbonio 3 (di-deossiribonucleotidi) per cui possono essere incorporati in una catena di DNA in fase di sintesi ma ad essi non possono essere legati altri dntp. Quindi se un di-deossi viene per caso incorporato nella catena nascente di DNA l ulteriore allungamento viene bloccato e la reazione termina. Quindi i di-deossi sono chiamati anche terminatori di catena. In pratica vengono allestite 4 reazioni in parallelo, ciascuna contenente una delle 4 basi sotto forma di di-deossi in concentrazione molto debole. Il frammento di DNA da sequenziare (stampo) viene incubato con una DNA polimerasi termostabile in presenza di desossiribonucleotide fosfati (dntps) e di un primer oligonucleotidico, complementare alla parte iniziale del DNA da sequenziare. tgcacacgcgcgctatatag... ACGTGTGCGCGCGATATATCGCTATATGACGGATCGGCGCTATAGC La polimerasi a partire dal primer genera un filamento complementare allo stampo, che si estende per una lunghezza indefinita a valle del primer. Ciò dà luogo a una amplificazione lineare dei prodotti di estensione.

3 Siccome la sintesi del DNA viene effettuata per esterificazione dell ossidrile 3 di un nucleotide, già incorporato mediante l estremità 5 fosfato, sul carbonio in alfa di un deossi nel momento in cui viene incorporato un di-deossi la sintesi si arresta (poiché non possiede un 3 ossidrile). Dal momento che questo nucleotide è presente in una concentrazione molto bassa esso verrà incorporato molto raramente e in modo casuale. Statisticamente si otterranno così tanti frammenti abortivi quante sono le volte in cui le basi corrispondenti sono rappresentate nel pezzo di DNA in questione. La dimensione dei frammenti sintetizzati corrisponde alla distanza tra l inizio del primer e la base a livello della quale si è fermata la replicazione. Il principio statistico è lo stesso utilizzato anche nei metodi chimici. La dimensione dei frammenti viene stimata attraverso un autoradiografia, che consiste in un elettroforesi del DNA marcato con radioisotopi o con molecole fluorescenti. In generale il metodo di sequenziamento più usato è il cosiddetto cicle sequencing cioè il metodo di sequenziamento ciclico basato sulla PCR. Si può utilizzare solo quando la zona di cui si vuole determinare la sequenza è conosciuta. La sua principale applicazione è la evidenziazione rapida della natura di una mutazione puntiforme. Questo lavoro, che normalmente necessita di parecchi mesi, può ora essere realizzato in qualche giorno. Si basa sull uso di una DNA polimerasi termostabile come quella descritta. La sequenza da analizzare è dapprima amplificata direttamente a a partire da un po di DNA gnomico mediante la tecnica del sequenziamento a doppia elica, utilizzando dei primer interni al segmento da amplificare. Uno degli oligonucleotidi è utilizzato in un primo tempo per determinare la sequenza della prima elica. Questa sequenza viene poi confermata mediante la determinazione dell elica complementare, fatta utilizzando un secondo oligonucleotide. Più gli oligo sono scelti vicino alla mutazione da cercare più la realizzazione sarà facile ed il risultato preciso. In una provetta si introducono il DNA campione, il cosiddetto templato, la DNA polimerasi i dntp e un primer di sequenza che funge da innesco per la polimerasi. Sono presenti i cosiddetti terminatori che essendo strutturalmente analoghi ai dntp vengono incorporati dalla polimerasi ma non possono a loro volta essere allungati. Il tutto viene introdotto in un termal cycler e sottoposto a oscillazioni termiche a cicli ripetuti. Il risultato è un amplificazione lineare dei prodotti di estensione. E un metodo che ha molti vantaggi tra cui l uso di piccole quantità di DNA campione (meno di 1 microgrammo). La natura ciclica dà origine ad un segnale forte e riduce la possibilità di inneschi parassiti (random priming) che producono rumore di fondo. L uso di una DNA polimerasi termostabile consente di sequenziale a 60 C e di ridurre le strutture secondarie nel templato dando più efficienti letture nelle regioni ricche in GC. Uno degli svantaggi della Taq è che l efficienza di incorporazione dei terminatori dipende strettamente dalla sequenza e

4 questo dà origine a profili di segnale molto irregolari. Se questo è un problema si può prendere in considerazione l uso di una polimerasi non termostabile come la Sequenase. Questo enzima dà incorporazioni molto più regolari e profili di segnale più uniformi ma non può essere usata a 60 C e quindi problemi di struttura secondaria danno origine a una porzione di sequenza illeggibile in gran parte delle sequenze. Disegno dei primer di sequenza Regole generali Esistono dei software che possono essere scaricati da siti web. Sono importanti la composizione in basi, l eventuale formazione di strutture secondarie, la stabilità. 1. La lunghezza del primer deve essere sufficiente da avere una elevata probabilità di formare un ibrido unico col templato. La temperatura di fusione del primer deve consentire la formazione di una quota significativa di ibridi stabili nelle condizioni di amplificazione prescelte. 2. Lunghezza ideale (minimo 17) % GC 4. Primer troppo ricchi in AT in genere formano ibridi scarsamente stabili 5. La sequenza del primer deve assomigliare il più possibile ad una successione random delle 4 basi evitare regioni omopolimeriche, specialmente al 3 6. Confrontare il primer candidato con sequenze ripetitive note (p.e. Alu) per evitare alineamenti multipli. 7. Evitare sequenze simmetriche che possono dare autocomplementarietà (problema nei primer ricchi in GC che esaltano ogni imperfezione) 8. Fare attenzione al nucleotide al 3. L esperienza insegna di scegliere come base terminale G e come penultima base se possibile una pirimidina C o T 9. Il primer deve essere disegnato da regioni conservate della sequenza, non deve contenere polimorfismi, inserzioni, delezioni Per decenni la marcatura utilizzata è stata quella con radioisotopi, fosforo 32 o fosforo 33, oppure per le sequenze zolfo 35 che ha una vita media più lunga e dà delle bande più definite all autoradiografia. I sequenziatori automatici sono basati invece sulla marcatura con sostanze fluorescenti. I radioisotopi sono stati il metodo di elezione per la marcatura delle macromolecole. Tuttavia restrizioni crescenti all uso dei radioisotopi insieme alla richiesta sempre maggiore di

5 velocità e sensibilità hanno shiftato verso tecnologie alternative di marcatura come la fluorescenza o la chemiluminescenza. Fluorocromi: sono molecole che possono assorbire energia, vengono eccitate e successivamente decadono ad un livello di energia più basso emettendo una parte dell energia assorbita nel processo, di solito sotto forma di luce visibile o a lunghezza d onda ancora maggiore. Per esempio se una molecola fluorescente viene illuminata da luce blu può emettere una luce verde. Questa tendenza recente ad esplorare e sfruttare le possibilità della fluorescenza sono dovute ad una combinazione di recenti sviluppi: sintesi di nuove molecole fluorescenti (fluorocromi) che possono più facilmente essere legate in modo covalente a macromolecole (DNA!), strumentazione migliore, uso di laser che consentono livelli di energia luminosa più alti e metodi migliori per la rivelazione e l analisi del segnale fluorescente. Le applicazioni della fluorescenza vanno dal sequenziamento del DNA all analisi dei cromosomi allo studio delle membrane cellulari, del trasporto ionico, dell apoptosi e della cinetica enzimatica, della struttura cellulare (microscopia confocale in fluorescenza). Negli ultimi 10 anni la fluorescenza ha sostituito la marcatura radioattiva soprattutto in quei campi dove è richiesto il processamento di un gran numero di dati. Per esempio nei laboratori del Progetto Genoma Umano cha ha determinati i circa geni che compongono il genoma umano non avrebbe senza il sequenziamento in cui il vantaggio principale è l automazione che risulta in un processamento più veloce ed efficiente. Il sequenziamento diretto di prodotti di PCR usando il metodo della terminazione della catena con i dideossi sviluppato da Sanger è attualmente il metodo più usato per definire mutazioni specifiche. Benefici principali: facilità di uso ed è stata aumentata recentemente con l introduzione di marcatura fluorescente e sistemi automatizzati che ovviano alla radioattività. Invece di frammenti di DNA marcati con radioisotopi su pellicola autoradiografica il DNA marcato in fluorescenza usando singole molecole può essere separato con elettroforesi. I dati sono raccolti in linea mediante strumentazione automatizzata. Un progresso recente in questo campo è lo sviluppo di marcature basate sul principio della fluorescenza a trasferimento di energia di fluorescenza tra due molecole. Le molecole (oligo) sono state attaccate due molecole fluorescenti. La prima detta molecola donatrice viene scelta per la capacità di trasferire in maniera efficiente energia elettromagnetica alla seconda molecola (accettrice). Questa molecola accettrice emette la luce assorbita come fluorescenza alla lunghezza d onda che le è propria e adatta agli strumenti di rivelazione. In questo modo l intensità effettiva è da 6 a 12 volte maggiore della sola prima molecola.

6 Un altra strategia è quella di marcare i terminatori. Questa variazione presenta tre vantaggi. Basta una sola incubazione invece di 4, perché il colore dipende solo dal dideossi incorporato. Per la stessa ragione gli arresti casuali delle polimerasi (falsi stop) che rendono spesso illeggibili le sequenze con tecniche classiche, sono senza effetto sulla lettura. Infine gli oligo che servono da primer non devono essere marcati, cosa che permette un economia importante. Un miglioramento radicale è stata la sostituzione del gel di poliacrilammide verticali per la separazione elettroforetica con capillari. Altro miglioramento è stato l introduzione di sistemi multicapillari che consentono la separazione elettroforetica di più prodotti di reazione in parallelo. Con i capillari si eliminano le lastre di gel e quindi il caricamento manuale, uno degli aspetti più noiosi della procedura. Invece di pipettare manualmente, il caricamento del campione viene effettuato con una iniezione elettrocinetica direttamente da una piastra da microtitolazione, il gel viene sostituito automaticamente e non ci sono vetri da lavare. L oligo viene marcato all estremità 5 con un fluorocromo di colore differente. A ciascuna di queste frazioni viene quindi aggiunto uno dei 4 dideossi trifosfati e viene condotta un incubazione di determinazione della sequenza. Tutti i frammenti la cui replicazione viene fermata dall incorporazione di un dato dideossi saranno dunque marcati con lo stesso colore, per esempio blu per le C, rosso per le T, arancio per le G e verde per le A. Le quattro miscele di reazione vengono quindi mescolate. Ciascuna banda osservata avrà il colore dell oligo che è servito da primer per la sintesi del frammento corrispondente. Il sequenziatore non è altro che una camera per l elettroforesi verticale di un gel di poliacrilammide. Ciò consente una risoluzione di una base dei prodotti di sequenza. I frammenti marcati con fluorocromi passano attraverso una finestra di lettura, 24 cm dai pozzetti di caricamento, che è scannerizzata da un laser e sono rivelati da filtri girevoli e fotomoltiplicatori. I segnali in fluorescenza sono inviati ad un computer che analizza la loro posizione e intensità produce un cromatogramma consistente di picchi colorati. L area sottesa al picco rappresenta l intensità del segnale e il colore del picco è specifico per la base che si trova in quella posizione. Il software attribuisce una base A, T, C o G a ciascuna posizione o assegna N se la posizione è ambigua. Sistemi di marcatura Marcatura dei primer In questo caso il fluorocromo deve essere attaccato al primer di sequenza. La marcatura viene introdotta al momento della sintesi dell oligo. Esistono dei kit commerciali che consentono di

7 farsi in casa la marcatura. Funzionano abbastanza bene però bisogna purificare il primer per togliere l eccesso di marcatura non legata. Occorrono 4 reazioni di sequenza separate, ognuna contenente un diverso terminatore. I prodotti sono poi mescolati tra loro ed estratti per eliminare l eccesso di primer marcati prima dell elettroforesi. Vantaggi: l intensità del segnale è indipendente dalla sequenza e quindi il profilo del segnale è più uniforme e non si vedono anamlie delle A delle T o problemi di rumore di fondo Maggiore lunghezza delle letture. Svantaggi: maggiore costo (4 marcature) Marcatura dei terminatori Vantaggi: si può usare qualsiasi tipo di primer 4 reazioni di sequenza in una sola provetta: meno pipettate Ideale quando si devono fare sequenze ripetute nella stessa regione Meno falsi stop dovuti al distacco prematuro della DNA polimerasi (non c è marcatura) Svantaggi: profilo del segnale poco uniforme Minore lunghezza delle letture I fluorocromi sono attaccati alle molecole dei dideossi terminatori e così il sequencing può essere ottenuto in una singola provetta Preparazione del campione Il campione di DNA da sequenziale deve essere perfetto. La resa e la purezza dell amplificato sono di importanza critica per ottenere sequenze di buona qualità. Cinque microlitri di amplificato vanno fat correre in agaros al 2% per stimare la concentrazione e la purezza. Se si vedono prodotti aspecifici la reazione di amplificazione deve essere ripetuta in condizioni più stringenti, in presenza di DMSO, etc. Amplificare il DNA mediante PCR e farlo correre in agarosio al 2% contenete bromuro di etidio Visualizzare il gel sul transilluminatore e ritagliare la banda corretta con un bisturi o un ago sterile, eluire overnigth la banda in 50 microlitri di acqua sterile deionizzata in una provetta da centrifuga. Usare 5 microlitri della soluzione quale temprato di una seconda PCR con gli stessi primer. Chekkare una aliquota del secondo prodotto di PCR per concentrazione e purezza oppure purificare il prodotto di PCR con colonnine da ultrafiltrazione tipo centricon che sono molto efficaci.