Prelievo di spermatozoi per la procreazione medicalmente assistita in pazienti affetti da azoospermia

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1 Urologia 2014; 81 ( S-23) : 1-5 DOI: /RU MEETING PROCEEDINGS 62 Convegno SUNI - Monastier di Treviso 2013 Prelievo di spermatozoi per la procreazione medicalmente assistita in pazienti affetti da azoospermia Massimiliano Timpano, Dario Fontana, Luigi Rolle, Mirko Preto, Marco Falcone, Mattia Sibona, Bruno Frea Sperm collection for medically assisted procreation in azoospermic patients Infertility is defined as the inability of a sexually active non-contracepting couple to achieve spontaneous pregnancy in one year. Factors of male infertility are present in 50% of infertile couples. Azoospermia is defined as the absence of sperm in the ejaculate, even after centrifugation of the sample, and affects 10%-15% of the infertile male population. Therefore, it represents a pathological condition of primary importance in the context of infertility management. Any assisted reproductive procedure must first refer to the availability of a suitable number of good quality gametes. As regards sperm collection, if ejaculated semen is not suitable or available, it may be taken from the seminal duct or directly from the testicular parenchyma with different methodologies and techniques, which can be divided into percutaneous techniques and open surgical (TeSE and ESA) or microsurgical (micro-tese) techniques. The purpose of this work is to evaluate and compare the retrieval rate in infertile patients suffering from azoospermia and treated with the various surgical techniques. Key words: Male Infertility, Azoospermia (obstructive/non-obstructive), TeSE - Testicular Sperm Extraction, Micro-TeSE - Micro Testicular Sperm Extraction, Retrieval Rate, Semen Cryopreservation, Medically Assisted Procreation, ICSI (IntraCytoplasmatic Sperm Injection) Parole chiave: Infertilità maschile, Azoospermia (ostruttiva/non ostruttiva), TeSE, Micro-TeSE, Tasso di recupero, Crioconservazione del seme, Fecondazione Assistita, Iniezione intra citoplasmatica di spermatozoi Accepted: September 20, 2013 INTRODUZIONE L infertilità è definita dalla WHO come incapacità di una coppia di ottenere una gravidanza dopo 1 anno di rapporti assidui e non protetti (1). L infertilità di coppia, primaria o secondaria, colpisce il 24% delle coppie che cercano una gravidanza; tuttavia, grazie al progresso delle tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA), solo il 5% di esse risulta definitivamente e irrimediabilmente incapace di ottenere una gravidanza (2, 3). L infertilità di coppia contempla tanto il fattore maschile quanto quello femminile, spesso concomitanti; fino al 50% 1

2 Azoospermia e PMA circa delle coppie infertili, presentano un fattore maschile come causa dell infertilità (1). L infertilità maschile, in realtà sarebbe più corretto parlare di infertilità di coppia da fattore maschile, si può manifestare come una riduzione del numero degli spermatozoi nell eiaculato (oligozoospermia) fino alla loro completa assenza (azoospermia), una riduzione della loro motilità (astenozoospermia), oppure un alterazione della loro morfologia (teratozoospermia). È frequente, tuttavia, osservare la presenza concomitante di tali alterazioni, in questi casi si parla dunque di sindrome Oligo-Asteno-Teratozoospermica (OAT) (4). La diagnosi laboratoristica di OAT è frequentemente, ma non invariabilmente, connessa al riscontro anamnestico o obiettivo di un fattore associato ad infertilità maschile. Tra questi fattori rientrano le malformazioni urogenitali congenite o acquisite, le infezioni genito-urinarie, l aumentata temperatura scrotale generalmente secondaria al varicocele, i disordini endocrinologici, le anomalie genetiche ed infine i fattori immunologici (2). Il 30%-40% dei maschi affetti da OAT, al contrario, non risulta affetto da nessuna condizione patologica riconoscibile, tanto da rientrare nella cosiddetta infertilità idiopatica. Il quadro più grave di alterazione del liquido seminale è certamente rappresentato dall azoospermia, definita come l assenza di spermatozoi nell eiaculato, anche dopo centrifugazione del campione. Essa interessa il 10-15% della popolazione maschile infertile (1, 4). Dal punto di vista fisiopatologico è necessario distinguere due forme di azoospermia, quella ostruttiva o escretoria (OA, 10%-15% degli azoospermici), che risulta caratterizzata da una normale produzione testicolare di spermatozoi, la cui progressione lungo la via seminale è però impedita da un ostacolo anatomico o funzionale, e quella non ostruttiva o secretoria (NOA, 85%-90% degli azoospermici), definita come difetto intrinseco al parenchima testicolare riguardante la produzione di spermatozoi. Nei pazienti affetti da NOA la spermatogenesi può essere completamente assente oppure conservata ma inferiore ad un livello soglia ; in questo secondo caso permangono delle isole di parenchima testicolare in grado di compiere la gametogenesi (3). Grazie ai progressi delle biotecnologie e alle tecniche di procreazione medicalmente assistita che si sono via via sviluppate a partire dagli anni Sessanta, oggi anche i maschi azoospermici possono sperare di concepire un figlio. Le tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita ad oggi disponibili possono essere suddivise in due categorie: le inseminazioni e le fecondazioni. Le inseminazioni prevedono l inserimento degli spermatozoi direttamente all interno delle vie genitali femminili in cui avviene la formazione dell embrione e il successivo impianto (la tecnica di inseminazione più utilizzata oggi è l inseminazione intra uterina - IUI). Nelle fecondazioni, invece, la formazione dell embrione avviene al di fuori delle vie genitali femminili, con il conseguente trasferimento dello stesso al loro interno in un secondo momento, le due tecniche di fecondazione più utilizzate sono la In Vitro Fecondation with Embrio Transfer (FIVET) e la Intracytoplasmatic Sperm Injection (ICSI). Proprio quest ultima tecnica, in grado di far formare un embrione attraverso l iniezione intracitoplasmatica nell uovo di un singolo spermatozoo, ha permesso di gestire le forme di infertilità maschile da azoospermia. della Per garantire la riuscita di una tecnica di fecondazione assistita, nel caso di un paziente azoospermicoè necessario disporre di un adeguato numero di spermatozoi di buona qualità. Quindi, se gli spermatozoi non possono essere recuperati dal seme eiaculato, è necessario procedere ad un prelievo condotto con l ausilio di presidi medico-chirurgici direttamente dall epididimo, nei casi di azoospermia in cui esista una componente ostruttiva, o dal testicolo; possiamo schematicamente suddividere le tecniche di prelievo in percutanee e chirurgiche a cielo aperto. Nel gruppo delle tecniche percutanee rientrano il prelievo da epididimo (PESA - Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration) eseguito con l ausilio di un ago-cannula da 23 G ed il prelievo dal testicolo con ago sottile (TeFNA - Testicular Fine Needle Aspiration) o per mezzo di ago-cannula butterfly (TeSA - Testicular Sperm Aspiration). I vantaggi delle procedure percutanee di prelievo dall epididimo o dal testicolo comprendono la semplicità della manovra che può essere eseguita ambulatorialmente in anestesia locale e ripetuta più volte, mentre a svantaggio si segnalano il fatto di essere manovre eseguite senza una visione diretta delle strutture anatomiche, il ridotto volume del materiale recuperato (sufficiente per un utilizzo a fresco), l assenza della possibilità di eseguire una valutazione istologica e dello score di fertilità (tipo Johnsens score). Queste procedure percutanee, pertanto, sono principalmente indicate nei casi di OA con utilizzo a fresco dei gameti recuperati. Tra le tecniche di prelievo chirurgico annoveriamo l estrazione testicolare di spermatozoi, senza o con l ausilio del microscopio operatore (rispettivamente, TeSE - Testicular Sperm Extraction e micro-tese) associata generalmente all aspirazione di spermatozoi dalla testa dell epididimo (ESA - Epididymal Sperm Aspiration o MESA utilizzando il microscopio 2

3 Timpano et al operatore per il recupero dal tubulo epididimario). Queste procedure chirurgiche, eseguite in anestesia locale o spinale per la tecnica microchirurgica in regime di Day Hospital, permettono di recuperare un adeguato volume di materiale utilizzabile per la PMA, anche in diversi cicli, sia a fresco che dopo crioconservazione e di ottenere allo stesso tempo una valutazione istologica del parenchima testicolare (5-9). Trattandosi di manovre chirurgiche a cielo aperto è possibile scegliere la sede, il numero e le dimensioni dei prelievi secondo le necessità e l aspetto del parenchima testicolare, anche se i dati di letteratura non consentono interpretazioni univoche di questi parametri. A prescindere dalla tecnica chirurgica utilizzata per il prelievo di spermatozoi, è inoltre necessario avere a disposizione un laboratorio di analisi con dei biologi della riproduzione facilmente raggiungibile dalla sala operatoria, in modo tale che, non appena estratto, il materiale venga subito inviato al laboratorio utilizzando soluzioni di trasporto adeguate, e sottoposto a processing ed estrazione degli spermatozoi eventualmente presenti. La possibilità di avere a disposizione il biologo della riproduzione direttamente in sala operatoria (situazione che non si verifica purtroppo in tutti i Centri) permette un atteggiamento più conservativo sul testicolo; in altri termini, è possibile asportare piccoli frammenti di parenchima testicolare e affidarli immediatamente al biologo per valutare il campione, con la possibilità di fermarsi nell esplorazione qualora il risultato fosse positivo. SCOPO DEL LAVORO Con il seguente lavoro intendiamo descrivere la nostra esperienza nel recupero di spermatozoi in pazienti affetti da azoospermia che si sono rivolti al nostro Centro di Andrologia per accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita mediante ICSI. MATERIALI E METODI Abbiamo raccolto in modo retrospettivo i dati dei pazienti azoospermici che si sono rivolti all ambulatorio andrologico della nostra divisione di Urologia nel periodo gennaio maggio Al momento della visita ambulatoriale è stata raccolta in modo sistematico l anamnesi fisiologica e sessuale, patologica remota e prossima e farmacologica di tutti i pazienti, alla ricerca di patologie, disturbi o fattori di rischio che potessero aver avuto una qualche influenza sulla loro fertilità. È stato inoltre eseguito l esame obiettivo genitale teso ad individuare possibili cause anatomiche alla base dell infertilità stessa. Dal punto di vista delle indagini strumentali tutti i pazienti hanno eseguito almeno due spermiogrammi per confermare l azoospermia, una valutazione ecografica testicolare e un ecodoppler dei funicoli spermatici in caso di varicocele clinicamente apprezzabile, il quadro ormonale con la valutazione dei livelli di testosterone totale, FSH ed LH. In previsione dell eventuale crioconservazione degli spermatozoi recuperati, tutti i pazienti hanno anche eseguito degli esami sierologici per valutare la loro positività rispetto ai virus potenzialmente trasmissibili anche nell azoto liquido (CMV, HBV, HCV e HIV). I pazienti sono quindi stati sottoposti ad un tentativo di prelievo di spermatozoi a cielo aperto: dal testicolo con tecnica TeSE standard (prelievo di circa 500 mg di parenchima testicolare) o micro-chirurgica (micro-tese con microscopio operatore a 20x, sec. Schlegel), normalmente associato ad un prelievo dalla testa dell epididimo mediante aspirazione con butterfly 23 G (ESA). La tecnica da utilizzare (TeSE o micro-tese) è stata scelta a seconda dei fattori prognostici (FSH e volume testicolare). I pazienti con diagnosi di azoospermia con fattori prognostici favorevoli (gruppo FP+), ovvero con un quadro ormonale di norma ed un volume testicolare adeguato, sono stati sottoposti a TeSE + eventuale ESA, mentre nei pazienti che al termine delle indagini clinico-laboratoristiche presentavano fattori prognostici negativi (gruppo FP-), FSH arbitrariamente scelto >17 UI/L e volume testicolare <15 cc, abbiamo scelto l esplorativa micro-chirurgica mediante micro-tese. La scelta di questo approccio è sostanzialmente dipesa dal fatto che la sala chirurgica del nostro Day Hospital non si trova in contiguità con la sala del biologo della riproduzione per il processing del campione. Pertanto, non potendo eseguire una valutazione immediata del campione di parenchima testicolare prelevato proseguendo con un ulteriore esplorazione solo se il responso del biologo è negativo, abbiamo scelto questo approccio per tentare di ottimizzare il rate di recupero (10). In occasione di tutte le procedure, con o senza l ausilio del microscopio operatore, è stato prelevato un ulteriore frammento di parenchima testicolare inviato per ottenere una valutazione istologica della gonade stessa. 3

4 Azoospermia e PMA RISULTATI Dei pazienti valutati per infertilità presso il nostro ambulatorio, 411 sono risultati affetti da azoospermia. In base alla valutazione preoperatoria, abbiamo classificato nel gruppo FP+ 253 pazienti a parametri predittivi positivi sul retrieval rate (FSH <17 UI/L - media 9,3 UI/L - e volume testicolare >15 cc) e nel gruppo FP- 158 pazienti con parametri predittivi sfavorevoli (FSH >17 UI/L - media 22,5 UI/L - e volume testicolare <15 cc). I pazienti FP+ sono stati sottoposti a TeSE + eventuale ESA. L intervento è stato condotto in anestesia locale (blocco del funicolo spermatico con 20 cc di bupivacaina al 7,5%). In 65 casi la procedura è stata bilaterale e in 117 pazienti è stata eseguita contestualmente l aspirazione dalla testa dell epididimo. Il tempo operatorio medio di una TeSE singola è stato di 12 minuti, di una TeSE bilaterale 18 minuti, di una TeSE con contestuale ESA 14 minuti. Il retrieval rate complessivo dopo biopsia singola del parenchima testicolare ed eventuale ESA contestuale è stato del 50%. Nel sottogruppo di pazienti dove l esame istologico ha evidenziato una spermatogenesi conservata, e quindi una azoospermia ostruttiva (OA), la combinazione TeSE + ESA ha consentito il recupero di spermatozoi nel 100% dei casi. Per quanto riguarda i 158 pazienti del gruppo FP-, la micro-tese è stata eseguita in regime di Day Hospital in anestesia spinale (prilocaina iperbarica), con accesso sul rafe scrotale mediano; in 84 pazienti, la procedura è stata bilaterale. In questo gruppo, è stato registrato un retrieval rate del 37%. Il tempo operatorio medio è stato di 45 minuti. La biopsia testicolare diagnostica eseguita contestualmente in questi pazienti, ha confermato la natura non ostruttiva dell azoospermia, in accordo con il sospetto clinico preoperatorio; si trattava per lo più di forme di sindrome a sole cellule di Sertoli. Tutti i pazienti sono stati dimessi entro qualche ora dal termine dell intervento e non è stato registrato alcun tipo di complicanza post-operatoria significativa. In particolare, anche nelle procedure bilaterali, non si sono registrati casi di ipogonadismo ad un controllo a 6 mesi dall intervento. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Dai dati disponibili in letteratura emerge che il retrieval rate per una TeSE per NOA varia da un minimo di 30% (10, 11) fino ad un massimo di 70%. (12, 13) I buoni risultati ottenuti nel nostro centro sono sostanzialmente in accordo con i risultati medi degli altri centri in cui si eseguono queste procedure. Gli studi che considerano il retrieval rate nei pazienti affetti da NOA sottoposti a prelievi micro-chirurgici (micro- TeSE) non sono omogenei in base ai fattori predittivi; vengono infatti riportate percentuali di recupero di spermatozoi che vanno dal 40% (14) fino al 63% (15, 16). La differenza di questi risultati rispetto alla nostra casistica dipende proprio dal fatto che nel nostro Centro i pazienti sottoposti ad una procedura micro-chirurgica sono quelli con i peggiori parametri predittivi. In un lavoro di Schlegel del 2005 sono stati confrontati il retrieval rate dei pazienti affetti da NOA sottoposti ad una procedura di prelievo di tipo microchirurgico (retrieval rate = 80%) rispetto a quello dei pazienti in cui il prelievo è stato eseguito senza ausilio del microscopio (retrieval rate = 50%); risulta evidente come la tecnica micro-chirurgica permetta di recuperare degli spermatozoi in una percentuale maggiore di casi data la possibilità di riconoscere le aree di parenchima testicolare più mature e trofiche, in cui i tubuli seminiferi appaiono dilatati, rispetto ad una classica procedura a cielo aperto dove non si possono identificare le aree di parenchima ottimali per eseguire il prelievo (10). Posta questa premessa, e sottolineando l impossibilità di un processing immediato del materiale estratto, nel nostro Centro utilizziamo la tecnica micro-chirurgica per i pazienti con fattori prognostici negativi, in modo da garantire la massima possibilità di recupero degli spermatozoi utilizzabili per una procedura di fecondazione assistita. Nei pazienti con fattori prognostici positivi riteniamo invece adeguata la tecnica chirurgica, almeno come primo tentativo di recupero; nel caso questo tentativo fallisse e con un esito istologico non del tutto sfavorevole (ipospermatogenesi, arresto maturativo tardivo) è possibile eseguire un secondo tentativo per via microchirurgica. In sintesi, al giorno d oggi le tecniche chirurgiche e micro-chirurgiche di recupero degli spermatozoi sono procedure standardizzate, semplici ed efficaci nel trattamento dell infertilità maschile. Il Day Surgery rappresenta la miglior collocazione dove eseguirle, per ottimizzare le risorse e i tempi. In assenza del biologo della riproduzione in locali attigui alla sala chirurgica, i parametri predittivi vanno considerati nella scelta della tecnica da utilizzare. 4

5 Timpano et al Disclaimers Financial support: No financial support was received for this submission. Conflict of interest: None of the authors has conflict of interest with this submission. Indirizzo dell autore: Dr. Massimiliano Timpano Specialista in Urologia, Andrologo Divisione Universitaria di Urologia A.O. Città della Salute e della Scienza di Torino - presidio Molinette C.so Bramante Torino massimiliano.timpano@gmail.com BIBLIOGRAFIA 1. World Health Organisation. WHO manual for the standardised investigation and diagnosis of the infertile couple. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2000; pag. 5-6.] 2. Dohle GR, Colpi GM, Hargreave TB, Papp GK, Jungwirth A, Weidner W; EAU Working Group on MaleInfertility. EAU guidelines on male infertility. Eur Urol Nov;48(5): Jungwirth A, Giwercman A, Tournaye H, Diemer T, Kopa Z, Dohle G, Krausz C; European Association of Urology Working Group on Male Infertility. European Association of Urology guidelines on Male Infertility: the 2012 update. Eur Urol Aug;62(2): World Health Organisation. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. ed. 5. Geneva, Switzerland: WHO, 2010; ed. 5; pag Kim ED, Gilbaugh JH 3rd, Patel VR, et al. Testis biopsies frequently demonstrate sperm in men with azoospermia and significantly elevated follicle-stimulating hormone levels. J Urol Jan;157(1): Colpi GM, Piediferro G, Nerva F, et al. Sperm retrieval for intra-cytoplasmic sperm injection in nonobstructive azoospermia. Minerva Urol Nefrol Jun;57(2): Esteves SC, Miyaoka R, Agarwal A. Sperm retrieval techniques for assisted reproduction. Int Braz J Urol Sep- Oct;37(5): Schlegel PN. Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod Jan:14(1): Okada H, Dobashi M, Yamazaki T, et al. Conventional versus microdissection testicular sperm extraction for non obstructive azoospermia. J Urol Sep;168(3): Ramasamy R, Yagan N, Schlegel PN. Structural and functional changes to the testis after conventional versus microdissection testicular sperm extraction. Urology Jun; 65(6): Tsujimura A, Matsumiya K, Miyagawa Y, et al. Conventional multiple or microdissection testicular sperm extraction: a comparative study. Hum Reprod Nov; 17(11): Glander HJ, Horn LC, Dorschner W, Paasch U, Kratzsch J. Probability to retrieve testicular spermatozoa in azoospermic patients. Asian J Androl Sep;2(3): Mulhall JP, Burgess CM, Cunningham D, Carson R, Harris D, Oates RD. Presence of mature sperm in testicular parenchyma of men with nonobstructive azoospermia: prevalence and predictive factors. Urology Jan;49(1):91-5; discussion Ishikawa T, Nose R, Yamaguchi K, Chiba K, Fujisawa M. Learning curves of microdissection testicular sperm extraction for nonobstructive azoospermia. Fertil Steril Aug;94(3): Ramasamy R, Fisher ES, Ricci JA, Leung RA, Schlegel PN. Duration of microdissection testicular sperm extraction procedures: relationship to sperm retrieval success. J Urol Apr;185(4): Schlegel PN Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod Jan;14(1):