Spettroscopia di assorbimento nel visibile e nell ultravioletto. Carlo I.G. Tuberoso Appunti didattici uso laboratorio ver. 00
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1 Spettroscopia di assorbimento nel visibile e nell ultravioletto Carlo I.G. Tuberoso Appunti didattici uso laboratorio ver. 00
2 I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla misura della radiazione elettromagnetica prodotta o assorbita dagli analiti. Si possono classificare in funzione della regione dello spettro elettromagnetico (raggi X, ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e storicamente i primi metodi spettroscopici erano ristretti all uso della radiazione visibile.
3 La spettroscopia costituisce un potente strumento di analisi chimica poiché ogni elemento chimico, ed in generale ogni sostanza, presenta uno spettro caratteristico che fornisce informazioni dettagliate e precise sulla sua struttura o sulla sua composizione.
4 La luce viene emessa o assorbita sotto forma di quanti o fotoni. L'energia E di un singolo fotone è direttamente proporzionale alla frequenza di radiazione ν e quindi inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda λ,, secondo la formula: h costante di Planck c velocità della luce E = hν h = hc/λ
5 Si definisce lunghezza d ondad (λ)) la distanza minima tra due punti in fase e viene espressa in: Å = 10-8 cm (raggi( X) µm m = 10-4 cm (IR) nm = 10-7 cm (UV( UV-Visibile) La frequenza rappresenta il numero di oscillazioni al secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un punto nell unit unità di tempo e viene espressa in sec - 1.
6 Il colore o la lunghezza d onda d dei quanti di luce emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da una molecola, dipende dalla loro struttura interna. In un atomo, l assorbimento l o l emissione l di luce di una determinata lunghezza d onda d corrisponde alla transizione di un elettrone da un orbita ad un altra. Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade nell intervallo di frequenze dall infrarosso al visibile.
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8 TECNICHE SPETTROSCOPICHE
9 nm (UV) nm (Vis) µm m (IR) espresso anche come numero d onda d 1/λ cm
10 SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO Quando una radiazione d onda d compresa tra 190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli elettroni dei legami dei composti presenti in soluzione passano allo stato eccitato. Meno fortemente sono legati gli elettroni dei lagami entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza d onda della radiazione assorbita e quindi più bassa l energia. l
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12 ECCITAZIONE DELL ETILENE ETILENE
13 Quando un fascio di radiazione monocromatica attraversa una soluzione contenente un analita, parte della radiazione viene assorbita: P 0 = intensità radiazione incidente P = intensità radiazione emessa b = spessore dello strato di soluzione
14 Transmittanza T = P / P 0 Assorbanza A = log 1 / T A = log P 0 / P
15 LEGGE DI LAMBERT-BEER BEER A= ε b c A = assorbanza ε = assorbività molare (l mol -1 cm -1 ) b = cammino ottico (spessore cuvetta espresso in cm) c = concentrazione, espressa in mol l -1
16 Se si riporta il segnale (T( o A) ) in funzione della lunghezza del cammino ottico: La risposta dell assorbanza in funzione della concentrazione è lineare fino ad un certo punto:
17 I cromofori Sono gruppi presenti in molecole organiche che hanno la capacità di assorbire la radiazione elettromagnetica nella regione del visibile e in quella dell ultravioletto. I cromofori più comuni sono caratterizzati da gruppi insaturi in grado di delocalizzare le cariche (etileni( etileni, acetileni, dieni, carbonili,, azoico, benzeni ). Gruppi in grado di esaltare l attivitl attività del cromoforo vengono denominati auxocromi.
18 Caratteristiche di alcuni cromofori benzenici
19 Le variazioni dello spettro SPOSTAMENTO Lunghezze d onda d maggiore Lunghezze d onda d minore Assorbanza maggiore Assorbanza minore DENOMINAZIONE batocromico ipsocromico ipercromico ipocromico
20 Lo spettro UV-VIS VIS 0 Abs 2 QUERCETINA 200 nm 600
21 Lo spettro UV-VIS VIS
22 LO SPETTROFOTOMETRO Singolo raggio Doppio raggio
23 La sorgente luminosa è costituita da lampada a: deuterio per la zona dell UV D 2 + Ee D 2 * D + D + hv (U.V.) spettro della radiazione emessa: nm tungsteno (W) per la regione visibile temperatura filamento: 2870 K spettro della radiazione emessa: nm xenon (Xe( Xe) ) per coprire entrambe le zone
24 Il monocromatore scinde la luce nelle sue lunghezze d onda costituenti, ulteriormente selezionate da una fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il prisma e il reticolo di diffrazione:
25 Il rivelatore permette di trasformare l intensitl intensità luminosa in un segnale elettrico. Possono essere utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatori photomultiplier tubes,, b) o fotodiodi. (PMT, b
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27 Spettrofotometro con rivelatore a serie di diodi
28 LE CUVETTE lati opachi
29 Lampada: singola sorgente pulsata allo Xenon Intervallo: nm 1100nm
30 La taratura
31 Differenza spettri
32 L influenza del ph
33 Spettri in derivata
34 Rilascio di un farmaco da una formulazione
35 I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI) Grazie allo sviluppo di opportuni software, gli attuali spettrofotometri possono essere utilizzati come colorimetri, apparecchi che sono in grado di misurare la radiazione luminosa e fornire un dato numerico che corrisponde alla sensazione visiva percepita dall occhio umano.
36 Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione è possibile effettuare una scansione tra 380 e 780nm, impostare l osservatore l standard e il tipo di sorgente (in genere 10 e D65, rispettivamente) ottenendo i valori di coordinate cromatiche nel sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o L*C*H*. In tale modo vengono valutati l intensitl intensità,, la tinta e la saturazione senza bisogno di strumenti più costosi muniti della sfera. Poiché il colore viene influenzato dalle diluizioni, nel caso di campioni molto intensi è preferibile ricorrere a celle dal cammino ottico inferiore ed effettuare le opportune correzioni.
37 I parametri di misura del colore Tinta (Hue,, h) = definisce la tonalità del colore (rosso, giallo, verde, azzurro) Luminosità (L* L*): indica la diversa intensità di luce, ossia di quanto la tinta è diluita con il nero. Varia da zero (nero) a 100 (bianco) Saturazione (Chroma, C*): indica di quanto la tinta pura è diluita con il bianco. Varia da zero (bianco) a 100 (colori spettrali puri, luci monocromatiche)
38 LA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIO Spazio CIE xy (1931) Spazio CIE L*a*b* (1976)
39 Lo spazio CIE L*a*b* tinta, tonalità luminosità saturazione
40 LA FUORIMETRIA Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si parla di fluorescenza, processo che dura tra s e 10-5 s ed è indipendente dalla temperatura. Si parla di fluorescenza primaria quando la sostanza è fluorescente allo stato naturale, mentre la fluorescenza secondaria deriva dalla reazione con sostanze fluorescenti (derivatizzazione( derivatizzazione). Le molecole naturalmente fluorescenti sono quelle con sistemi fortemente coniugati o aromatici e struttura rigida. Il picco di emissione si trova sempre a lunghezza d onda d maggiori (spostamento di Stokes), e pertanto, a energia più bassa.
41 FUORIMETRI Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza molecolare (spettrofluorimetri( spettrofluorimetri) ) sono simili allo spettrofotometro UV-VIS: VIS: è presente una sorgente luminosa (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90 rispetto alla luce incidente.
42 Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni accorgimenti tecnici, ad es. l assenza l di fluorescenza provoca il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) ) o da sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di ph, temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si eseguono diluizioni pari a volte rispetto a quelle utilizzate in spettrofotometria UV-VIS. VIS.
43 SPETTROSCOPIA NELL INFRAROSSO È una tecnica molto utilizzata per identificare composti organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza delle molecole presenta spettri di assorbimento caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer. processo che dura tra s e 10-5 s ed è indipendente dalla temperatura.
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45 Il gran numero di legami presenti nelle molecole poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall analisi analisi IR siano molto complessi e forniscano un impronta digitale di identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare molecola.
46 GRUPPO hydroxyl amines aromatic rings alkenes alkanes nitriles carbonyl amines LEGAME O-H N-H C-H C-H C-H CΞN C=O C-N ENERGIA (approx, cm -1 )
47 STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IR sistemi a dispersione Globar Lampada di Nernst Filo Ni-Cr
48 STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IR sistemi a trasformata di Fourier
49 GLI SPETTRI IR
50 GLI SPETTRI IR
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