SECONDA UNIVERSITA DI NAPOLI Di.S.T.A.Bi.F. SPETTROSCOPIA
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1 SECONDA UNIVERSITA DI NAPOLI Di.S.T.A.Bi.F. SPETTROSCOPIA 1
2 Telerilevamento NASA, aprile 1999 La tecnica che impiega la luce per ottenere informazioni sulle proprietàfisicheochimichediuncampioneprendeilnomedi spettroscopia; si occupa quindi della misurazione e dell interpretazione della luce assorbita o emessa da un campione. 2
3 Prevede l utilizzo di uno spettro, definito come la gamma di colori o bande spettrali che si osservano per dispersione della luce bianca. 3
4 Laspettroscopiaèutilizzatanell analisichimicasiaascopoqualitativo che quantitativo. I metodi spettroscopici possono essere suddivisi in base al tipo di analiti esaminati o al tipo di luce utilizzata. Se gli analiti studiati sono molecole si parla di «spettroscopia molecolare» mentre lo studio degli atomi o degli elementi prende il nome di «spettroscopia atomica». La classificazione più comune tiene conto del tipo di radiazione utilizzata e del modo in cui questa radiazione interagisce con la materia. 4
5 La spettroscopia nasce nel 1672 grazie a Isaac Newton che utilizzò un prisma per separare un fascio di luce solare bianca nei colori rosso, arancione, giallo, verde e blu. Permise di capire che la luce emessa da un certo materiale è correlata alla composizione chimica del campione. 1752: Acqua di mare + alcool, la fiamma generata assume una colorazione gialla (presenza del sodio). 1826: Diversi sali aggiunti ad un campione davano fiamme di colori diversi. 5
6 La velocità della luce nel vuoto è una costante fisica (c) ugualea m/s. La velocità della luce in un mezzo diverso dal vuoto viene indicata con il simbolo v. Il rapporto tra c e v è un parametro noto come indice di rifrazione (n). 6
7 Assorbimento e rilascio della luce della materia Telerilevamento passivo 7
8 Il rilascio di luce da parte della materia prende il nome di emissione. Atomi, ioni o molecole passano da uno stato eccitato ad uno stato a più bassa energia. Quando una sostanza chimica per rilassamento torna dallo stato eccitato ad uno stato a più bassa energia, deve rilasciare tale energia. Uno dei modi in cui ciòavvieneèattraversol emissionediunfotonediluce.il fotone emesso avrà un energia esattamente uguale alla differenza di energia tra lo stato eccitato iniziale e quello a più bassa energia finale della sostanza in esame. La rappresentazione grafica della luce emessa dalla materia a differenti valori di lunghezza d onda, frequenza o energia prende il nome di spettro di emissione. La differenza di energia tra lo stato eccitato e quello a più bassa energia diuna certa sostanza è spesso un valore caratteristico di tale sostanza. Laquantità di luce emessa sarà direttamente correlata alla quantità di sostanza. 8
9 Assorbimento: trasferimento di energia da un campo elettromagnetico a un entità chimica. Richiede che l energia del fotone che deve essere assorbito sia esattamente uguale al dislivello energetico esistente tra lo stato a bassa energia e lo stato eccitato della sostanza in esame. Intensità luce emessa dal campione < intensità luce assorbita La luce rimanente che ha attraversato il campione si dice che ha subito un fenomeno di trasmissione: passaggio di radiazione elettromagnetica attraverso la materia non associato a variazioni energetiche. luce trasmessa + luce assorbita = luce ingresso campione 9
10 Il grafico dell intensità della radiazione assorbita (o trasmessa) da un campione a diversi valori di lunghezza d onda, frequenza o energia è detto spettro di assorbimento. Sia la clorofilla a che la clorofilla b non assorbono luce tra 500 e 600 nm, perciò tali pigmenti e le piante che li contengono appaiono di colore verde/giallo. 10
11 In natura il colore di qualsiasi oggetto che assorbe luce è determinato dai restanti tipi di radiazione luminosa trasmessa (o riflessa) dall oggetto stesso. 11
12 ANALISI QUANTITATIVA IN SPETTROSCOPIA 12
13 La SPETTROFOTOMETRIA molecolare UV/Visibile è interessata ai fenomeni di assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del visibile ( nm) e del vicino UV ( nm). Viene interessato anche l UV lontano ( nm), anche se in questo caso si opera sotto vuoto o in atmosfera di gas inerte, perché l ossigeno atmosferico copre i segnali delle altre sostanze. 13
14 MONOCROMATORE 14
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16 L assorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanza A = - log(t) Secondo la legge di Lambert-Beer l assorbanza A è proporzionale sia alla concentrazione della sostanza assorbente, sia allo spessore dello strato attraversato, per cui più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l assorbanza (maggiore sarà la diminuzione dell intensità del raggio incidente). A = x b x C 16
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18 Si applica alla radiazione monocromatica ed è lineare per soluzioni diluite <0.01M 18
19 Grafico dell assorbanza misurata in funzione della concentrazione dell analita: diagramma di Lambert-Beer 19
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22 Nell'analisi quantitativa spettrofotometrica è fondamentale conoscere come varia l'assorbanza in funzione della lunghezza d'onda. Ciò viene espresso molto chiaramente con il diagramma in cui in ascissa si riportano i valori delle lunghezze d'onda e in ordinata i corrispondenti valori dell'assorbanza. Si ottengono così delle curve ( spettri ) che variano da sostanza a sostanza e presentano dei massimi caratteristici in corrispondenza di alcune lunghezze d'onda. 22
23 Nell'analisi quantitativa lo spettro è essenziale per la scelta della lunghezza d'onda più appropriata da utilizzare. In genere verrà scelta una lunghezza d'onda in modo che: l'assorbimento sia massimo (per motivi di sensibilità, se l'assorbimento è alto è possibile rilevare quantità piccolissime di sostanza); sia al centro di un picco 'largo' (per motivi di precisione, in modo che piccole variazioni di lunghezza d'onda comportino errori minimi sulla misura dell'assorbanza). Nel caso di miscele di sostanze, la scelta per la determinazione di una sostanza, cadrà su una lunghezza d'onda dove le altre sostanze assorbono il meno possibile. 23
24 SPETTROFOTOMETRI Le misure di assorbanza devono tenere conto dell inevitabile assorbimento dovuto al solvente e/o alla matrice in cui l analita è disperso e alle pareti del contenitore della soluzione in esame. In pratica lo strumento deve essere azzerato prima di ogni serie di misure; bisogna indicare allo strumento ciò che si considera come assorbimento nullo. Le diverse esigenze analitiche hanno portato alla realizzazione di diversi tipi di spettrofotometri UV/Visibile: strumenti monoraggio; strumenti doppio raggio; strumenti a serie di diodi; strumenti a fibra ottica. 24
25 SPETTROFOTOMETRI Gli spettrofotometri usati nell UV VISIBILE più comuni sono il monoraggio eil doppio raggio. Lo SPETTROFOTOMETRO monoraggio si usa per l analisi quantitativa, ma è più sensibile alla temperatura, alla luce ed alla stessa misurazione del bianco che deve essere ripetuta per ogni misurazione. Lo SPETTROFOTOMETRO a doppio raggio è più complesso e costoso, ma consente una grande precisione e praticità anche nelle analisi quantitative, poiché registra il bianco una sola volta e poi continua in automatico. Uno spettrofotometro è composto da: 1) SORGENTE di radiazione (lampade al Tungsteno o al deuterio) 2) SELETTORE di lunghezze d onda o MONOCROMATORE 3) PORTACUVETTE dove vengono inserite le CELLE 4) RIVELATORE, trasforma l energia radiante in un segnale elettrico. I più comuni sono detti celle (o cellule) fotoelettriche. 5) LETTORE converte il segnale che proviene dal rivelatore in una forma che può essere usata dall analista. 25
26 SCHEMA DI UNO STRUMENTO A SINGOLO RAGGIO IL MONOCROMATORE è un PRISMA o un RETICOLO DI DIFFRAZIONE 1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura l Intensità. 2) Si lava la cuvetta. 3) Si mette la soluzione e si misura l intensità. 4) Si fa il rapporto fra le due Intensità Converte l Intensità della radiazione in Intensità di corrente 26
27 SCHEMA DI UNO STRUMENTO A DOPPIO RAGGIO Il bianco (o riferimento) è costituito dal solvente senza la sostanza di cui si vuol esaminare l assorbimento La radiazione proveniente dal MONOCROMATORE si divide in due raggi che sono inviati contemporaneamente al campione ed al solvente. Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con l Intensità trasmessa I campione Il computer registra entrambe in modo alterno e calcola il rapporto. 27
28 Azzeramento e taratura dello strumento Per una soluzione con concentrazione infinita si deve avere T=0 e A mentre per una soluzione con concentrazione nulla si deve avere T=1 e A=0. Interponendo sul cammino dei raggi luminosi uno schermo perfettamente opaco (che rappresenta una soluzione a concentrazione infinita) lo strumento deve segnare 0 sulla scala delle trasmittanze; per la maggior parte degli strumenti, questa operazione è automatica e quindi non è necessario eseguirla (in caso contrario esisterà un dispositivo atto ad imporre la condizione T=0. La taratura a concentrazione nulla (A=0) viene invece effettuata con il cosiddetto azzeramento contro il bianco. 28
29 Significato dell'azzeramento contro il bianco Quando il raggio di luce monocromatica investe la celletta contenente il campione, avvengono diversi fenomeni: riflessione, rifrazione, assorbimento da parte delle pareti della celletta, del solvente e di tutti i reattivi aggiunti per formare il composto colorato, e ovviamente della sostanza in esame. L'assorbanza effettivamente misurata risentirebbe quindi di numerosi fattori non legati alla concentrazione della sostanza in esame, portando quindi ad errori nella determinazione della concentrazione di quest'ultima. Per aggirare questo problema, prima di misurare l'assorbanza del campione in esame, si azzera l'assorbanza introducendo il bianco, cioè una celletta identica a quella del campione e che contiene una soluzione il più possibile simileaquelladelcampionemaincuièassentelasolasostanzainesame. 29
30 Non effettuando l'azzeramento contro il bianco si perderà la proporzionalità diretta tra A e concentrazione, cioè non si otterrà una retta passante per l'origine nel grafico C-A. 30
31 31
32 Alcune frodi comuni: a) extravergini contenenti oli raffinati, di oliva e di semi; b) oli con parametri analitici non conformi alla classificazione; c) oli di semi commercializzati come oli di oliva. 32
33 Analisi spettrale U.V. Questo esame, oltre a fornire utili elementi di giudizio sulla qualità di un olio, ha permesso di risolvere definitivamente il problema del riconoscimento dell'olio rettificato eventualmente aggiunto all'olio di oliva vergine, sfruttando il fatto che gli oli naturali di pressione non contengono doppi legami coniugati che invece si formano, sia pure in misura minima, durante la rettifica, particolarmente nella fase di decolorazione su terre attive. 33
34 Ne consegue che i rettificati presentano valori di assorbimento nell'uv, particolarmente nella zona intorno ai 270 nm, notevolmente superiori a quelli degli oli vergini. Infatti i gruppi etilenici isolati, oppure i gruppi carbossilici degli acidi grassi, presentano massimi di assorbimento tra 175 e 185 nm, cioè al di fuori della zona utilizzabile dello spettro UV che inizia, come noto, a lunghezze d'onda superiori a 200 nm. Invece la formazione di idroperossidi in acidi grassi polinsaturi provoca uno slittamento del doppio legame con formazione di un sistema dienico coniugato che assorbe a 232 nm. 34
35 Durante la rettifica degli oli lampanti perossidati, il passaggio su terre attive provoca la formazione di trieni coniugati (aventi una banda di assorbimento, con tre massimi, intorno ai 270 nm) verosimilmente per decomposizione di un idroperossido linoleico. Anche la formazione di composti chetonici, per ossidazione ancora più spinta, provoca un maggiore assorbimento che si manifesta attorno ai 270 nm. L'esame UV viene condotto sull'olio disciolto in opportuno solvente (cicloesano o isottano) nell'intervallo compreso tra i 220 e i 280 nm. Le lunghezze d'onda più significative sono 232, 262, 268 e 274 nm. 35
36 36
37 Il comportamento spettrale è notevolmente diverso nei tre tipi di olio, ciò permette di individuare anche piccole aggiunte di rettificato o di sansa, all'olio di oliva vergine. L assorbimento dell olio d oliva vergine decresce rapidamente verso valori molto bassi nella zona di lunghezza d onda compresa tra 260 e 280 nm. L andamento della curva è praticamente parallelo all'asse delle ascisse. In ordinata sono riportati i valori di assorbanza. Nel caso del rettificato, e nel caso dell'olio di sansa, i valori di assorbanza in tale zona sono molto più elevati, la curva assume un andamento caratteristico con tre massimi, dovuti alla presenza dei trieni, dei quali il più accentuato è quello centrale a 268 nm. 37
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