SPETTROSCOPIA UV-VISIBILE
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1 Corso di Chimica Generale - CHI CCS Ingegneria Chimica A.A. 2015/2016 (I Semestre) SPETTROSCOPIA UV-VISIBILE Prof. Dipartimento di CMIC Giulio Natta
2 Spettroscopia A insieme di strumenti per misurare le proprietà molecolari. La spettroscopia è l assorbimento o l emissione di luce. L analisi spettrochimica può esser definita come l uso dello spettro della radiazione elettromagnetica in analisi qualitative e quantitative. Quando una molecola assorbe luce, la sua energia aumenta Quando una molecola emette luce, la sua energia diminuisce
3 Fotoni o Quanti di Luce Atomi e molecole assorbono solo alcune frequenza, ma non altre Ci sono due ragioni per questa osservazione. L energia assorbita o emessa è proporzionale alla frequenza,. Energia di un fotone = h e Costante di Plank
4 Effetto Fotoelettrico (emissione di elettroni da un metallo solido irraggiato) Batteria Elettrodo metallico illuminato e Luce incidente e - da sorgente Generatore a voltaggio variabile + Elettrodo di raccolta - Amperometro Misura dell energia cinetica degli elettroni emessi (fotoelettroni) = Voltaggio per cui la corrente è zero
5 Energia dei Fotoelettroni Emessi da Metalli E cin. / kj mol Infrarosso Visibile Ultravioletto 300 Cs K Mg Zn Ni Pt x (Hz) o del Cesio Pendenza = h (costante di Plank) E cin. = E fot. - E emis. = h - = h E cin. = h ( - )
6 Peculiarità dell Effetto Fotoelettrico L emissione fotoelettrica dimostra che l energia dell elettrone: Aumenta se si aumenta Non è influenzata aumentando l intensità L intensità influenza il numero di elettroni emessi per secondo
7 Quantizzazione dell Energia Molecolare Le energie molecolari sono quantizzate Se solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse energia energia
8 Quantizzazione dell Energia Molecolare Le energie molecolari sono quantizzate Se solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse energia energia
9 Altre Evidenze della Quantizzazione Assorbimento del corpo nero (Panck) Capacità termica dei solidi a bassa temperatura quindi E = h
10 Spettrometri sorgente monocromatore (selettore di frequenza) campione rivelatore
11 Strumenti a Dispersione Usati negli spettrometri visibile/ultravioletto e nei vecchi tipi di strumenti infrarosso
12 Strumenti a Trasformata di Fourier Richiedono estesi calcoli per convertire il segnale in uno spettro. Usati nei moderni strumenti.
13 Lo Spettro Elettromagnetico Frequenza [Hz] Ultravioletto Visibile Infrarosso Lunghezza d onda [m] E = h = c / Raggi Cosmici Raggi Gamma Raggi X Ultravioletto Visibile Infrarosso Microonde Radar Televisione NMR Radio Ultrasuoni Suoni (udibili) Infrasuoni
14 Transizioni Elettroniche nella Formaldeide transizione n * (285 nm) transizione * (187 nm)
15 Transizioni Elettroniche e Spettri di Atomi E E I S 2 S 0 S 2 S 1 S 0 S 1 S 0 S 0 S 2 S 0 S 1
16 Transizioni Elettroniche e Spettri UV-visibile in Molecole E S 2 I livelli elettronici livelli vibrazionali livelli rotazionali massimi di assorbimento ( max. ) S 1 Ampiezza della banda a metà altezza S u = transizioni elettroniche
17 Spettri Derivati di una Banda di Assorbanza Gaussiana 1.0 Assorbanza 1.0 Assorbanza Assorbanza: A f ( ) derivata derivata E E+00 1 a Derivata: da d f ' ( ) E E E-04 2 a Derivata: 2 d A 2 d f '' ( ) 2.0E E E E E-05 3 derivata 1.0E E E E-07 4 derivata
18 Aumento Risoluzione Sovrapposizione di 2 bande Gaussiane con un NBW di 40 nm separate da 30 nm Assorbanza Separate alla 4 a derivata derivata 5.0E E E
19 Trasmissione e Colore L occhio umano vede il colore complementare di quello che è assorbito
20 Assorbanza e Colori Complementari 800 Lunghezza d onda [nm] Colore assorbito Colore complementare rosso arancio blu verde verde blu giallo verde verde porpora rosso-porpora blu verde verde blu rosso arancio blu giallo violetto giallo-verde
21 Trasmissione e Concentrazione La Legge di Lambert-Bouguer 100% 50% 25% 12,5% 6,75% 3,125% I o I 1 I 2 I 3 I 4 I 5 Trasmittanza 100% 50% 25% Lunghezza Percorso T I / I e 0 Cammino Cost.
22 Trasmittanza e Cammino Ottico La Legge di Beer 100% C I 0 50% I 1 100% 2C 25% 100% I 2 100% 3C 12.5% I 3 Trasmissione 50% 100% 4C 6.75% I 4 100% 5C 3.125% 25% I 5 Concentrazione T I / I e 0 Concentrazione Cost.
23 La Legge di Lambert-Bouguer-Beer 1.5 Assorbanza Concentrazione A I / I log I / I b c log T log 0 0
24 Miscela Bicomponente 1.5 x y x + y Assorbanza Lunghezza d onda Esempio di miscela bi-componente con scarsa sovrapposizione spettrale
25 Miscela Bi-componente 1.5 x y x + y Assorbanza Lunghezza d onda Esempio di miscela bi-componente con significativa sovrapposizione spettrale
26 Influenza di un Errore Casuale del 10% 1.5 Vero Misurato Assorbanza Lunghezza d onda Influenza sulle concentrazioni calcolate Scarsa sovrapposizione spettrale: Errore 10% Significativa sovrapposizione spettrale: Dipende dalla similarità, può essere molto più alto (p.es. 100%)
27 Spettri di Assorbimento di Derivati dell Emoglobina Assorbanza [AU] Sulfemoglobina Ossiemoglobina Carbossiemoglobina Emoglobina (ph ) Deossiemoglobina Lunghezza d onda [nm] 650
28 Intensità dello Spettro della Lampada ad Arco di Deuterio Buona intensità nell intervallo UV Utile intensità nell intervallo del visibile Basso rumore di fondo Intensità calante nel tempo Irradiazione Spettrale Lunghezza d onda [nm]
29 Intensità dello Spettro della Lampada a Tungsteno-Alogena Bassa intensità nell intervallo UV Buona intensità nell intervallo visibile Rumore di fondo molto basso Basso drift Irraggiamento Spettrale Lunghezza d onda [nm]
30 Intensità dello Spettro della Lampada a Xeno Alta intensità nell intervallo UV Alta intensità nell intervallo visibile Rumore di fondo medio Irraggiamento Spettrale Lunghezza d onda [nm]
31 Dispositivi di Dispersione Prisma Dispersione non-lineare Sensibile alla temperatura Reticolo Dispersione lineare Differenti ordini Primo ordine Secondo ordine
32 Dispositivo Fotomoltiplicatore Alta sensibilità a bassi livelli di luce Il materiale catodico determina sensibilità spettrale Buon segnale/rumore di fondo Sensibile agli urti Catodo Anodo
33 Il Rivelatore a Fotodiodi Contatto metallico Fotone Ampio intervallo dinamico Rapporto segnale/rumore molto buono ad alti livelli di luce Dispositivo a stato solido SiO 2 strato p Regione intrinseca strato n Blocco d oro
34 Diagramma Schematico di un Dispositivo a Fotodiodi Luce Stesse caratteristiche dei fotodiodi Dispositivo a stato solido Veloci cicli di lettura Fotodiodo Capacitore Registro deviazione Deviatore transistor Linea video Ciclo di lettura
35 Spettrometro Convenzionale Monocromatore Rivelatore Campione Fessura d uscita Sorgente Dispositivo di dispersione Fessura d ingresso
36 Spettrometro a Diode Array Batteria di diodi Policromatore Sorgente Campione Fessura d ingresso Dispositivo di dispersione
37 Spettrometro a Diode Array Campione Shutter Lente Lampada a Tunsteno Fessura Lente Lampada a deuterio Reticolo Diode array a 1024-elementi Sistema ottico di uno spettrofotometro HP 8453 a diode array
38 Spettrometro Convenzionale Monocromatore Fessura d uscita Dispositivo di dispersione Riferimento Sorgente Fessura d ingresso Chopper Rivelatore Campione Sistema ottico di uno spettrofotometro a doppio raggio
39 Spettrometro a Diode Array Lampada UV Lampada visibile Cella del riferimento Specchi a lati di cubo Specchio sorgente Elisse sorgente UV Elisse spettrografica Specchio orientante il raggio inferiore Cella del campione Reticolo olografico Visibile Uscita Spettrografo e batteria rivelatore Specchio orientante il raggio inferiore Specchi a lati di cubo Sistema ottico dello spettrofotometro a diode array HP 8450A
40 Spettrometro Convenzionale Monocromatore Sorgente Fessura d ingresso Fessura d uscita Dispositivo di dispersione Deviatore del raggio Riferimento Rivelatore Campione Rivelatore Sistema ottico di uno spettrofotometro a raggio sdoppiato
41 Definizione di Risoluzione intensità Segnale in uscita dal rivelatore S max 0.8xS max lunghezza d onda lunghezza d onda La risoluzione spettrale è una misura della capacità di uno strumento di differenziare tra due lunghezze d onda adiacenti
42 Ampiezza di Banda Spettrale intensità I 0.5 I SBW lunghezza d onda La SBW è definita come l ampiezza, a metà dell intensità massima, della banda di luce uscente dal monocromatore
43 Ampiezza di Banda Spettrale Naturale assorbanza A 0.5 A NBW lunghezza d onda La NBW è l ampiezza della banda di assorbimento del campione a metà del massimo di assorbimento
44 Effetto della SBW sulla Forma della Banda assorbanza 5 nm 1 nm 10 nm 20 nm 50 nm lunghezza d onda Il rapporto SBW/NBW deve essere 0.1 o migliore per dare una misura di assorbanza con un accuratezza del 99.5% o migliore.
45 Effetto del Campionamento Digitale Assorbanza Assorbanza Spettro originale Processo di campionamento Spettro digitalizzato lunghezza d onda Anche l intervallo di campionamento usato per digitalizzare lo spettro per la valutazione e lo stoccaggio da parte di un computer influenza la risoluzione
46 Resettabilità della Lunghezza d Onda Errore = 0.0 AU Assorbanza [AU] Errore = 0.1 AU (10%) lunghezza d onda [nm] Influenza della resettabilità della lunghezza d onda sulle misure al massimo e sulla pendenza della banda di un assorbimento
47 Effetto della Luce Diffusa Assorbanza misurata % di Luce Diffusa 0.01 % di Luce Diffusa 0.10 % di Luce Diffusa 1.00 % di Luce Diffusa Assorbanza vera Effetto di vari livelli di luce diffusa sulle assorbanze misurate confrontate con le assorbanze reali
48 Errore di Assorbanza Teorico Errore % Curva dell errore da luce diffusa Curva errore luce diffusa + noise Curva errore luce diffusa - noise Assorbanza 1 4 L errore totale a qualsiasi assorbanza è la somma degli errori dovuti alla luce diffusa e al rumore di fondo (rumore dei fotoni ed elettronico)
49 Effetto del Drift Errore Assorbanza [AU] lunghezza d onda [nm] Il drift è una potenziale causa di errore fotometrico e deriva dalle variazioni tra le misure di I 0 e I
50 Caratteristiche di Trasmissione dei Materiali di Cella Trasmittanza [%] Silice fusa Quarzo fuso Plastica acrilica Vetro ottico Vetro lunghezza d onda [nm] Notare che tutti i materiali mostrano approssimativamente almeno il 10% di perdita nella trasmittanza a tutte le lunghezze d onda.
51 Tipi di Celle 1 (a) (b) Cella Standard rettangolare aperta in testa (a) e cella con apertura (b) per volumi limitati di campione
52 Tipi di Celle (II) (a) (b) Micro cella (a) per volumi molto piccoli e cella a flusso (b) per applicazioni automatizzate
53 Effetto dell Indice di Rifrazione (b) Raggio collimato Campione (b) Raggio focalizzato Rivelatore Luce non rivelata Variazioni nelle misure dell indice di rifrazione del riferimento e del campione possono causare misure sbagliate di assorbanza
54 Geometria non Planare del Campione Area fotosensibile Rivelatore Rivelatore Campione planare Campione inclinato Alcuni campioni possono agire come componenti ottici attivi nel sistema e deviare o defocalizzare il raggio luminoso
55 Effetto del Tempo di Integrazione Assorbanza [AU] Assorbanza [AU] ± AU ± AU 0.1 sec 16 sec S/N = 5.5 S/N = lunghezza d onda [nm] Mediare i dati raccolti riduce il rumore di fondo della radice quadrata del numero dei punti mediati
56 Effetto della Media sulle Lunghezze d Onda Assorbanza Assorbanza S/N Segnale Rumore NBW lunghezza d onda Intervallo ottimale # dei punti Mediare le lunghezze d onda riduce anche il rumore (della radice quadrata dei punti raccolti) L ampiezza del segnale viene influenzata
57 Aumento dell Intervallo Dinamico 3.0 Assorbanza [AU] mg/ml spironolattone 241 nm 266 nm Assorbanza Misurata [AU] lunghezza d onda Concentrazione mg/ml La scelta di una lunghezza d onda nella pendenza di una banda di assorbimento può aumentare l intervallo dinamico ed evitare la preparazione del campione come la diluizione
58 Diffusione Rivelatore Campione trasparente Rivelatore Campione che diffonde La dispersione causa un assorbanza apparente in quanto meno luce raggiunge il rivelatore
59 Spettri Diffusi 1.0 Assorbanza [AU] Diffusione di Tyndal Diffusione di Rayleigh lunghezza d onda [nm] Diffusione di Rayleigh : Diffusione di Tyndall : Particelle piccole rispetto alla lunghezza d onda Particelle grandi rispetto alla lunghezza d onda
60 Correzioni per Isoassorbanza Spettro analita Spettro interferente Spettro misurato Assorbanza [AU] A 1 A 1 A 1 =A 1 A A lunghezza d onda [nm] L assorbanza alla lunghezza d onda di riferimento deve essere equivalente all interferenza alla lunghezza d onda analitica
61 Modellizzazione del Fondo Assorbanza [AU] Spettro misurato Spettro diffuso estrapoato A C A 1 A C = A 1 A Intervallo del modello A lunghezza d onda [nm] Si può eseguire la modellizzazione del fondo se l interferenza è dovuta ad un processo fisico
62 Riferimenti Interni Spettro a Spettro b 1 Assorbanza [AU] A 1 a A 1 b A 2 a A 2 b lunghezza d onda [nm] Corregge per la costante absorbanza del fondo su un intervallo
63 Correzione a Tre Punti Assorbanza [AU] Spettro misurato A C A 1 A C = A 1 A A 2 A 1 A lunghezza d onda [nm] Uses two reference wavelengths Corrects for sloped linear background absorbance
64 Discriminazione delle Bande Larghe 1.0 Assorbanza Derivata prima Derivata seconda lunghezza d onda [nm] Le derivate possono eliminare l assorbimento di fondo Le derivate discriminano rispetto alle ampie bande di absorbanza
65 Correzione della Diffusione per Spettroscopia Derivata Assorbanza [AU] Spettro misurato Spettro reale Derivata prima lunghezza d onda [nm] La diffusione è discriminata come una banda ampia di assorbanza
66 Effetto della Fluorescenza Assorbanza [AU] Lunghezza d onda di eccitazione Spettro di assorbanza vera Spettro misurato con ottica diretta Spettro misurato con ottica inversa 0.5 Lunghezza d onda di emissione Lunghezza d onda [nm] La luce emessa da un campione fluorescente causa un errore nella misura dell assorbanza
67 Angoli di Accettazione e Grandezza dell Errore di Fluorescenza Ottica diretta Rivelatore Ottica inversa Fenditura Rivelatore Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d onda di eccitazione sono troppo basse Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d onda di emissione sono troppo basse
68 Calibrazione Inadeguata Assorbanza [AU] Assorbanza misurata dello standard Assorbanza [AU] Assorbanza del campione misurata Curve di calibrazione possibilmente vere Possibile risultato di 0.25 Concentrazione nota 0.25 quantificazione dello standard Concentrazione Concentrazione Teoricamente si richiede solo uno standard per calibrare In pratica, deviazioni dalla legge di Beer possono causare risultare sbagliati
69 Insieme di Dati di Calibrazione Assorbanza [AU] Assorbanza [AU] Concentrazione Concentrazione Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d onda di eccitazione sono troppo basse Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d onda di emissione sono troppo basse
70 Lunghezza(e) d Onda per la Migliore Linearità Assorbanza [AU] Coefficiente di concentrazione Intervallo ottimale Lunghezza d onda [nm] Una curva lineare di calibrazione è calcolata ad ogni lunghezza d onda Il coefficiente di correlazione da una stima della linearità
71 Lunghezza(e) d Onda per la Migliore Accuratezza Assorbanza [AU] Concentrazione Concentrazione misurata Concentrazione vera Intervallo ottimale Lunghezza d onda [nm] I risultati di quantificazione sono are calcolati ad ogni lunghezza d onda Le concentrazioni calcolate danno una stima dell accuratezza
72 Precisione di una Analisi Valore [mg/ml] Media = 1.41 mg/ml Deviazione standard = mg/ml Numero di misure La precisione di un metodo è il grado di accordo tra I singoli risultati delle prove quando si applica ripetutamente la procedura a campionamenti multipli
73 Lunghezza(e) d Onda per la Migliore Sensibilità Assorbanza [AU] % RSD Intervallo ottimale Lunghezza d onda [nm] Il calcolo della deviazione standard relativa dei valori misurati ad ogni lunghezza d onda La lunghezza d onda con la RSD % inferiore possibilmente fornirà la migliore sensibilità
74 Lunghezza(e) d Onda per la Migliore Selettività Assorbanza [AU] Concentrazione [mg/ml] Concentrazione misurata Concentrazione vera Intervallo ottimale Lunghezza d onda [nm] La selettività è l abilità di un metodo a quantificare accuratamente e specificamente l analita o analiti in presenza di altri composti
75 Assorbanza Ideale e Standard di Lunghezza d Onda Assorbanza [AU] Standard di assorbanza Standard di lunghezza d onda Lunghezza d onda [nm] Uno standard ideale di assorbanza dovrebbe avere una assorbanza costante a tutte le lunghezze d onda Uno standard ideale di lunghezza d onda dovrebbe avere picchi molto stretti e ben-definiti
76 Filtro Ideale per Luce Diffusa 100 Trasmittanza [AU] Lunghezza d onda [nm] Un filtro ideale di luce diffusa dovrebbe trasmettere tutte le lunghezze d onda eccetto quelle usate per misurare la luce diffusa
77 Soluzione di Perclorato di Olmio 0.8 Assorbanza [AU] Lunghezza d onda [nm] Il più comune standard per l accuratezza della lunghezza d onda è il perclorato di olmio
78 Soluzione di Dicromato di Potassio 2.0 Assorbanza [AU] nm 257 nm 313 nm 350 nm Lunghezza d onda [nm] Lo standard di accuratezza fotometrica richiesto da molte farmacopee è una soluzione di bicromato di potassio
79 Soluzioni Standard per Luce Diffusa Trasmittanza [AU] 100 KCl 200 nm NaI 220 nm NaNO nm Lunghezza d onda [nm] I più comuni standard per luce diffusa e le rispettive lunghezze d onda usate
80 Toluene in Esano (0.02% v/v) 0.5 Picco AU Assorbanza [AU] Valle AU Rapporto Lunghezza d onda [nm] La risoluzione è stimata prendendo il rapporto dell assorbanza del massimo vicino a 269 nm e il minimo vicino a 266 nm.
81 Analisi di Conferma 1.0 Caffeina 0.8 Assorbanza [AU] nm 274 nm 284 nm Acido salicilico Lunghezza d onda [nm] Nell analisi di conferma, si usa l assorbanza ad una o più ulteriori lunghezze d onda per quantificare un campione
82 Similarità Spettrale Normalizzato Normalizzato Incognito Standard Lunghezza d onda [nm] Incognito Standard Lunghezza d onda [nm] Standard [AU] Standard [AU] Incognito [mau] Correlazione = Correlazione = Incognito [mau] Grafici comparativi di spettri simili e dissimili
83 Precisione e Accuratezza Precisione Precisione + Precisione Precisione + Accuratezza Accuratezza Accuratezza + Accuratezza +
84 Uso dell UV Cinetica dell Idrolisi del Sultone Assorbanza [AU] Lunghezza d onda [nm]
85 Spettrometro Convenzionale La geometria più semplice si trova negli strumenti a singolo raggio. Per effettuare la misura, si introduce prima il bianco e se ne misura la I o. Quindi si introduce il campione (utilizzando la stessa cuvetta) e se ne misura la I, e lo strumento ne calcola a scelta la trasmittanza o l assorbanza. Rivelatore Fenditura d ingresso Dipsositivo di dispersione Fenditura d uscita Monocromatore Campione Gli strumenti a raggio singolo sono poco costosi, hanno alta resa luminosa, e perciò alta sensibilità, a causa della semplicità del sistema. Lo svantaggio sta nel tempo che deve intercorrere tra le due misure e nell aumento dei problemi di deriva. Sorgente
86 Rivelazione Spettrofotometrica a diode array Un rivelatore spettrofotometrico a diode-array usa una batteria di rivelatori e una configurazione ottica inversa, con il dispositivo di dispersione collocato dopo il campione. Si ha il vantaggio che solo la luce passante sull asse dalla sorgente alla fenditura prima del dispositivo di dispersione raggiunge il rivelatore; la luce avente altri angoli viene scartata. Così la luce ambiente non interferisce e si può lasciare aperta la zona del campione, rendendo il sistema più facile da utilizzare e versatile. Sorgente Campione batteria di diodi Dispositivo di dispersione Fessura d ingresso Policromatore La luce di tutte le lunghezze d onda colpiscono il diode-array e sono misurate simultaneamente. Lo spettro si recupera per scansione elettronica della batteria. In principio, gli spettrofotometri a diode-array possono avere una geometria a raggio singolo o doppio ma, in pratica, i vantaggi dei primi si combina bene con il rivelatore a diode-array.
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