CORSO DI BIOCHIMICA PER INGEGNERIA BIOMEDICA 2 ESERCITAZIONE

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1 CORSO DI BIOCHIMICA PER INGEGNERIA BIOMEDICA 2 ESERCITAZIONE 1) Il collagene è una proteina (globulare / fibrosa). È formata da tre (catene alfa/alfa eliche) con andamento (destrorso/sinistrorso) che vanno a formare il tropocollagene che ha andamento (destrorso /sinistrorso). La struttura primaria è caratterizzata dalla ripetizione del tripeptide (Gly-X-Y/Ala-X-Y); X e Y possono essere, residui che hanno subito modificazioni post-traduzionali. Queste modificazioni avvengono ad opera di un enzima che necessita di VITAMINA C GLY/X/Y FIBROSA CATENE ALFA SINISTRORSO DESTRORSO 4-IDROSSIPROLINA O 5-IDROSSILISINA (vitamina C/ vitamina B) e la cui carenza comporta SCORBUTO l insorgenza della malattia (pellagra / scorbuto).

2 Catena α sinistrorsa Collagene Tre eliche si arrotolano insieme con un andamento destrorso ( TROPOCOLLAGENE)

3 Unità tripeptidica ripetuta Gly -X-Y Collagene O O O O O O C C C C NH CH C NH CH C N CH H 2 C 5 3 CH 2 H 2 C 5 3 HCH 2 C 2 5 HO CH HO N CH CH N 1 4 CH 2 4-idrossiprolina CH 2 3 CHH 2 C 5 N 1 4 OH CH 2 CH 2 3 CH OH H CH 2 CH 2 C CH 2 OH H CH 2 CH 2 C CH 2 OH ACIDO ASCORBICO (vitamina C) NH 3 NH 3 5-idrossiLisina

4 Collagene Legami covalenti CROCIATI inter-intramolecolari tra Lys, HyLys, o His TROPOCOLLAGENE

5 MALATTIE DEL COLLAGENE DOVUTE A MUTAZIONI GENICHE: sostituzione di un residuo di Gly con Cys o Ser in ciascuna catena α: Sindrome di Ehlers-Danlos

6 MALATTIE DEL COLLAGENE DOVUTE A MUTAZIONI GENICHE: sostituzione di un residuo di Gly con Cys o Ser in ciascuna catena α: Osteogenesi imperfetta (sindrome ossa di vetro)

7 Collagene SCORBUTO carenza di vitamina C

8 2) Le -cheratine (rispondere vero o falso) a) sono proteine globulari b) sono formate prevalentemente da -eliche c) sono formate prevalentemente da residui aminoacidici di piccole dimensioni d) l unità fondamentale delle -cheratine è la protofibrilla e) le struttura delle -cheratine è resa stabile da legami idrogeno

9 -cheratina catena polipeptidica con oltre 100 residui, elica destrorsa due polipeptidi danno origine a un avvolgimento avvolto dimerico e sinistrorso 2 file sfalsate di dimeri si associano testa-coda 2 protofilamenti si associano e formano le protofibrille

10 -cheratina 4 protofibrille

11 Conformazione nativa -cheratina Il numero dei ponti disolfuro è indice della durezza delle α-cheratine

12 3. Disegnare la curva di ossigenazione di una emoglobina avente un valore di p50 pari a 30 torr e determinare come varierà (rappresentandole graficamente) questa curva al variare dei seguenti parametri: 1) diminuzione del ph 2) diminuzione della concentrazione di BPG 3) motivare le risposte ai punti 1) 2)

13 Curva di dissociazione dell O 2 per l emoglobina Hb + 4O 2 = Hb(O 2 ) 4 Hb sigmoidale L emoglobina lega l O 2 quando la pressione parziale del gas (po 2 ) è elevata (polmoni) e lo rilascia quando la pressione è bassa (tessuti).

14 pco 2 pco 2 tu Camera mia bella Influenza della pco 2

15 Influenza del ph tessuti polmoni

16 Influenza del 2,3- BPG

17 4. Data la seguente reazione: Fruttosio-6-fosfato Fruttosio-1,6-bisfosfato Fosfofruttochinasi Calcolare la velocità iniziale della reazione enzimatica della fosfofruttochinasi sapendo che la concentrazione iniziale del Fruttosio-6-fosfato è 0.03 mm, la concentrazione della fosfofruttochinasi è 10 mm, Km corrisponde a 0.1 mm, V max a 0.66 mm/min. Spiegare brevemente il significato di Km.

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19 CINETICA ENZIMATICA: concentrazione del substrato La velocità di una reazione catalizzata da un enzima aumenta all aumentare della concentrazione del substrato fino a raggiungere una velocità massima (V max ). In questa condizione i siti attivi dell enzima sono saturi del substrato Quando tutto l enzima è saturato con il substrato: [ES] = [E tot ] V 0 = Vmax

20 La curva che esprime la relazione tra V 0 e S ha un andamento iperbolico ed è espressa algebricamente dalla equazione di Michaelis-Menten Costante di Michaelis e Menten La Km è quella concentrazione di substrato a cui la V 0 è pari a metà della Vmax

21 L equazione di Michaelis-Menten descrive la variazione della velocità di reazione al variare della concentrazione del substrato. v 0 = velocità iniziale della reazione V max = velocità massima K m = costante di Michaelis-Menten [S] = concentrazione del substrato

22 Caratteristiche della K m La K m è pari alla concentrazione di substrato alla quale la velocità della reazione (V 0 ) è 1/2 della V max. La K m riflette l affinità dell enzima per il substrato: K m piccola = alta affinità dell enzima per il substrato K m grande = bassa affinità dell enzima per il substrato. Ogni enzima ha una K m caratteristica per un dato substrato. La K m non varia al variare della [E].

23 I PARAMETRI CINETICI POSSONO ESSERE USATI PER CONFRONTARE LE ATTIVITA DEGLI ENZIMI

24 6) Che influenza possono avere temperatura e ph sull attività di un enzima?motivare la risposta

25 FATTORI CHE MODIFICANO LA VELOCITA DELLE REAZIONI ENZIMATICHE: 1) ph (curva a campana) 2) temperatura (curva bifasica a causa della denaturazione) 3) [S] (iperbole rettangolare a causa della saturazione) 4) inibitori CINETICA ENZIMATICA

26 CINETICA ENZIMATICA: ph Ciascun enzima ha un ph ottimale al quale la reazione è catalizzata con la massima efficienza. Esso in genere rispecchia il ph dell ambiente in cui l enzima svolge normalmente le sue funzioni. La concentrazione degli H + (ph) influenza l attività enzimatica modificando la geometria del sito attivo e la distribuzione delle cariche elettriche dei gruppi coinvolti nel legame del substrato o nel processo catalitico stesso. Valori di ph estremi possono anche provocare la denaturazione dell enzima.

27 CINETICA ENZIMATICA: ph

28 CINETICA ENZIMATICA: temperatura La velocità di reazione aumenta con l aumentare della temperatura fino a raggiungere un picco. Un ulteriore innalzamento della temperatura provoca una diminuzione della velocità di reazione a causa della denaturazione dell enzima.

29 CINETICA ENZIMATICA: temperatura

30 7) Indicare se le seguenti affermazioni relative al legame dell ossigeno all emoglobina sono vere o false. a) L effetto Bohr fa diminuire l affinità per l ossigeno in seguito all aumento del ph. b) Il biossido di carbonio fa aumentare l affinità per l ossigeno dell emoglobina, legandosi ai gruppi amminici terminali delle catene polipeptidiche. c) L affinità dell emoglobina per l ossigeno aumenta all aumentare della percentuale di saturazione. d) Il tetramero di emoglobina lega 4 molecole di 2,3-BPG. e) Il sangue fetale ha un affinità per l ossigeno più elevata del sangue dell adulto, perché la HbF ha una minore affinità per il 2,3-BPG. f) La composizione dell HbF è α2δ2.

31 Influenza del 2,3- BPG

32 Influenza del 2,3- BPG Il 2,3 BPG è una piccola molecola dotata di cariche negative che consentono il legame a una serie di cariche positive di catene laterali di AA situati sulle due catene β, formando ponti salini e stabilizzando la forma T. Il sito per il 2,3 BPG è presente solo nella forma tesa T.

33 Influenza del 2,3- BPG Nell Hb deossigenata (T) è presente una cavità centrale che si restringe consistentemente in Hb in forma R (ossigenata): tale cavità nella forma T ospita il 2,3 BPG, modulatore allosterico negativo.

34 EMOGLOBINA FETALE (HbF) Il significato del 2,3 BPG appare chiaro se si confronta la curva di saturazione dell HbA materna e dell Hb e fetale. Gli eritrociti fetali contengono un Hb con struttura quaternaria α2 2. Fra le catene il 2,3-BPG si lega più debolmente rispetto a quello che avviene nell HbA. La curva di saturazione dell Hb fetale è a sinistra rispetto a quella della HbA materna, indicando maggiore affinità per O 2. L'O 2 rilasciato nella circolazione placentare dall Hb materna a certe pressioni parziali, viene assunto dall Hb fetale, più affine, e ciò soddisfa l'esigenza fisiologica di rifornimento di O 2 al feto da parte della madre.

35 8) Come possono essere classificate le proteine di membrana?

36 Componente proteica INTEGRALI: strettamente associate al doppio strato lipidico tramite interazioni idrofobiche (rimovibili con detergenti oppure tramite reazioni enzimatiche) PERIFERICHE: interazioni elettrostatiche e legami a H con i domini idrofilici delle proteine integrali e con le teste polari dei lipidi di membrana (rimovibili con agenti in grado di interferire con il legame) ANFITROPICHE: si trovano sia nel citosol che associate alle membrane a seconda del tipo di regolazione a cui sono sottoposte

37 Componente proteica Proteine integrali di membrana Interazioni idrofobiche tra lipidi di membrana e domini idrofobici delle proteine

38 Componente Proteine integrali di membrana Barile β proteica Porine Consentono ai soluti polari di attraversare la membrana

39 9) Quali sono i costituenti di questi lipidi di membrana: a) triacilgligerolo b) acido fosfati dico c) ceramide

40 Triacilgliceroli (Trigliceridi)

41 Triacilgliceroli (Trigliceridi) T. Semplici: Glicerolo 3 ac. grassi uguali Legame estere T. Misti: Glicerolo 2 (o 3) ac. grassi diversi

42 Glicerofosfolipidi ( fosfogliceridi) Legame estere Legame fosfodiestere Legame estere

43 Glicerofosfolipidi (fosfogliceridi)

44 Glicerofosfolipidi (fosfogliceridi)

45 sfingolipidi Legame ammidico

46 10) Scrivere la formula di struttura di un triacilglicerolo a piacere e specificare: è un trigliceride misto o semplice? Che tipi di legami sono presenti tra le varie molecole costituenti?

47 Triacilgliceroli (Trigliceridi) T. Semplici: Glicerolo 3 ac. grassi uguali Legame estere T. Misti: Glicerolo 2 (o 3) ac. grassi diversi

48 11) Descrivere in modo sintetico le caratteristiche dei doppi strati lipidici. Inoltre, spiegare brevemente a cosa si riferiscono i seguenti termini: a) mobilità trasversale b) mobilità laterale c) asimmetria

49 Modello a mosaico fluido

50 Componente Lipidica Aggregazione di Lipidi Anfipatici in acqua Glicerofosfolipidi Sfingolipidi Liposoma

51 Dinamica delle membrane La struttura e la flessibilità delle membrane dipendono dalla temperatura e dalla composizione in lipidi

52 Le membrane sono FLUIDE La struttura e la flessibilità delle membrane dipendono dalla temperatura e dalla composizione in lipidi a temp. fisiologiche stato fluido ordinato

53 a temperature intermedie alla temperatura di transizione di fase (Tm) passano allo stato fluido La temperatura di transizione aumenta in proporzione alla lunghezza della catena degli acidi grassi e al grado di saturazione

54 Dinamica delle membrane a) Il calore produce un movimento termico delle catene laterali Transizione solido fluido b) Diffusione laterale nel piano del doppio strato I fosfolipidi, oltre a spostarsi lateralmente lungo il piano dello strato bimolecolare, possono passare da uno strato all altro per inversione testa-coda FLIP-FLOP c) Diffusione attraverso il doppio strato t1/2 da ore a giorni ( reazione non catalizzata). secondi (reazione catalizzata da flippasi)

55 Dinamica delle membrane A temperatura fisiologica FLIP-FLOP questo movimento è limitato dalla difficoltà di trasferire la testa idrofilica della molecola lipidica attraverso la zona centrale idrofobica dello strato bimolecolare.

56 Dinamica delle membrane Ca 2+ PE= fosfatidiletanolammina PS= fosfatidilserina

57 Interazione del Colesterolo con i lipidi di membrana

58 Interazione del Colesterolo con i lipidi di membrana

59 12) Descrivere le differenze tra trasporto attivo e trasporto passivo attraverso le membrane

60 Diffusione semplice Trasporto di soluti attraverso le membrane

61 Trasporto di soluti attraverso le membrane Soluti polari Diffusione facilitata trasporto passivo

62 Trasporto di soluti attraverso le membrane: cotrasporto

63 Trasporto di soluti attraverso le membrane Velocità ridotte, Saturabili Alta stereospecificità Velocità elevate non saturabili Minore stereospecificità Diffusione contro gradiente di concentrazione Diffusione secondo gradiente di concentrazione

64 Trasporto di soluti attraverso le Diffusione contro gradiente di concentrazione membrane

65 Trasporto di soluti attraverso le membrane Un esempio di trasporto attivo primario è dato dalle ATPasi: Na + K + ATPasi ha la funzione di mantenere la differenza di composizione ionica tra il citosol e il mezzo extracellulare [Na + ] [K + ]

66 13) Che cosa sono gli enzimi? Quale ruolo svolgono all interno degli esseri viventi?

67 catalizzatori biologici rendono possibile da un punto di vista cinetico le reazioni chimiche Gli Enzimi Sono le proteine più importanti e più specializzate Presentano un elevato grado di specificità per il substrato Operano in soluzioni acquose con temperature e ph blandi

68 Struttura generale degli enzimi Sono proteine globulari complesse: Addotto enzima-substrato Parte proteica Parte non-proteica Cofattore (ione metallico) Coenzima (natura organica: vitamina o altro) Gruppo Prostetico

69 SITO ATTIVO: specifica porzione dell enzima, deputata al legame con il substrato che porta alla formazione dell addotto ES Addotto ES

70 Proprietà dei Catalizzatori I catalizzatori sono sostanze capaci di abbassare l energia di attivazione rendendo piú facile la formazione dell addotto ES: la reazione diviene quindi piú veloce.

71 14) Sapendo che : a)il ΔG di idrolisi dell ATP ( ATP ADP + Pi) corrisponde a -31 KJ/n b)il ΔG di idrolisi della reazione Fruttosio 1,6 bisfosfato Pi + fruttosio 6-fosfato corrisponde a KJ/n Calcolare il ΔG della reazione ATP + Fruttosio 6 fosfato ADP + Pi + fruttosio 1,6-bisfosfato

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75 Reazioni accoppiate Somma :

76 Reazioni accoppiate 1 semireazione endoergonica 2 semireazione esooergonica Reazione complessiva accoppiata

77 15) Spiegare in che cosa consiste la fosforilazione a livello del substrato. Fai un esempio

78 7) Fosforilazione a livello del substrato: ADP riceve un fosfato da un intermedio metabolico

79 10) Fosforilazione a livello del substrato: ADP riceve un fosfato da un intermedio metabolico