L elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche.

Transcript

1 L elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche. L elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole elettricamente cariche. 1. relativamente poco costosa 2. rapida 3. versatile Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionizzabili e possono esistere in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come cationi, sia come anioni. Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono assumere una carica se trasformati chimicamente oppure se sono strutturati in polimeri complessi quali i glicosamminoglicani. 1

2 L elettroforesi viene condotta su un supporto inerte ed omogeneo (gel o matrice), il campione viene sciolto in un opportuno tampone con il quale viene saturato l eventuale supporto in modo da consentire la conduzione della corrente. La matrice può essere composta da una varietà di differenti materiali, inclusa la carta, l acetato di cellulosa, o gel fatti di poliacrilammide e agarosio. Poliacrilammide: L'acrilammide è l'ammide dell'acido acrilico. A temperatura ambiente si presenta come un solido cristallino incolore o leggermente bianco, solubile in acqua con reazione fortemente endotermica. La poliacrilammide è un derivato polimerico, che sotto forma di gel trova applicazione come mezzo di risoluzione e separazione delle proteine nell'elettroforesi e nella cromatografia. Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008) tossico estremamente tossico 2

3 Agar: L agar è una miscela, non tossica ricavato da alghe rosse, di due polimeri derivati dal galattosio: l agarosio e l agaropectina. Sottoforma di gel all 1% l agar presenta un elevato contenuto d acqua, una buona struttura fibrosa, un diametro dei pori elevato ed una bassa resistenza frizionale. I gel di agarosio sono usati soprattutto per la separazione di acidi nucleici e frammenti di DNA; in questo caso la migrazione differenziale è funzione semplicemente del numero di basi di cui sono composti gli acidi nucleici da separare. Da considerazioni di carattere fisico, si risale alla seguente formula: q x E Ve = 6π x η x r La velocità elettroforetica (Ve) è direttamente proporzionale alla carica della particella (q) e al campo elettrico applicato (E=V/d) e inversamente proporzionale alla viscosità (η) e alle dimensioni della particella (r), quindi nel caso di particelle aventi la stessa carica, migrerà più velocemente la particella di raggio minore. 3

4 Elettroforesi su gel di poliacrilammide Due Tipi: Elettroforesi Nativa: le proteine si muovono in funzione della loro massa e della loro carica netta Elettroforesi Denaturante in presenza di SDS (SDS-PAGE): le proteine, uniformemente dotate di carica negativa (SDS), si muovono in base alla loro massa. SDS-PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulphate-Polyacrilamide-Gel-Electrophoresis) 4

5 SDS-PAGE E uno dei metodi più largamente usati per separare le proteine e determinare il loro peso molecolare apparente. Abbinata al Western Blot e all Immunocolorazione costituisce un metodo riproducibile, rapido ed efficace per l isolamento e l identificazione delle proteine. (SDS-PAGE) In condizioni denaturanti le proteine sono separate in un gel di poliacrilammide in base alla loro massa molecolare (MM) La miscela proteica è trattata con : H 3 C-(CH 2 ) 10 -CH 2 OSO 3- Na + Sodio dodecil solfato (SDS) detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti delle proteine native 5

6 Gli anioni dell SDS si legano alle catene principali in un rapporto di: ~ 1 molecola di SDS e 2 residui di amminoacidi I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa Sottoposte ad un campo elettrico le proteine migrano dal catodo - all anodo + in base alla loro massa molecolare Fasi di una SDS-PAGE 1 - Montaggio dell apparato; 2 - Preparazione del gel; 3 - Preparazione e caricamento dei campioni; 4 - Corsa elettroforetica; 5 - Colorazione; 6 - Studio dell immagine ottenuta. 6

7 1-Montaggio dell apparato: - Lastra di vetro grande; - Lastra di vetro piccola; - Spaziatori; - Castello; - Pettini; Porosità del gel % T Intervallo di frazionamento Generalmente al crescere di % T la dimensione dei pori decresce perché l acrilammide è più concentrata, mentre al disotto del 3% si perde l effetto setacciante. 7

8 La dimensione dei pori è funzione della quantità totale di monomeri (% T) presenti nella soluzione e del rapporto tra l agente cross-lincante e l acrilammide (% C). Più spesso la composizione del gel viene data come rapporto in peso acril:bis-acril (per es. 30:0,8). I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell uso facendo copolimerizzare acrilamide con metilen-bisacrilammide, un agente cross-lincante, in presenza di una catalizzatore come il persolfato di ammonio (APS) allo 0,1-0,3% e un iniziatore come il TEMED. Questa polimerizzazione radicalica viene fatta avvenire all interno dello spazio compreso tra due vetri, in modo da ottenere una matrice piatta con spessore che varia da 0,75 mm a 1,5 mm. 8

9 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Il TEMED catalizza la rottura omolitica dell APS, producendo così i radicali necessari per la reazione di polimerizzazione radicalica dell acrilammide. Il TEMED va conservato al buio, a RT, e possibilmente, in ambiente anidro. Questo perché il TEMED è igroscopico ed in presenza di acqua si ossida perdendo le sue proprietà catalitiche. Il TEMED ossidato si riconosce in quanto assume colorazione giallastra. Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008) Simboli di rischio chimico infiammabile corrosivo Nocivo Ammonio persolfato L APS è una molecola instabile, ed estremamente igroscopica. Quando è sciolto in acqua si scompone spontaneamente, pertanto si consiglia di preparare la soluzione appena prima dell uso. Generalmente, si prepara una soluzione madre al 10 % e la si conserva a -20 C. APS e TEMED aggiunti in quantità eccessive, oltre ad alterare le proprietà del gel, possono ossidare le proteine del campione. Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008) Simboli di rischio chimico estremamente tossico Comburente Nocivo 9

10 2-Preparazione del gel - Preparazione del resolving gel o gel di risoluzione. La scelta della % di acrilamide è in base alle dimensioni della proteina in esame); - Preparazione dello stacking gel o gel di impaccamento (4-5%) Resolving gel al 12% Componenti: Volume 20 ml H 2 O % acrilamide 8.0 Proteine 1.5 M Tris/HCl (ph 8.8) % SDS 0.2 Maglie di acrilamide 10% ammonio persolfato 0.2 TEMED

11 Menisco di ossigeno butanolo saturo di acqua (10:1) gel di separazione Preparazione dello Stacking al 5 %: Componenti: Volume 10 ml H 2 O % acrilamide M Tris/HCl (ph 6.8) % SDS % ammonio persolfato 0.1 TEMED

12 Gel di impaccamento Dopo circa 1 h dalla deposizione del gel di separazione, si stratifica su di esso il gel di impaccamento (o stacking) Pettine stacking gel Il gel di impaccamento ha un ph di 6,8 e un rapporto di acrilam/bis-acrilam pari al 4-5% separating gel Appena deposto il gel di impaccamento. si dispone il pettine per la formazione dei pozzetti Quando i gel si sono solidificati si rimuove il pettine, lasciando nello stacking la serie di pozzetti pronti per il caricamento dei campioni. 12

13 3-Preparazione dei campioni - Campione contenente l Albumina: - Sample buffer 5x (Tris/HCl 0.3 M ph 6.8, 10% SDS, 0.05% Blu di Bromofenolo, 50% Glicerolo e 500 mm DTT) - Riscaldare a 95 C per 5 minuti Preparazione dei campioni SDS: Denatura le proteine e conferisce la stessa densità di carica negativa DTT (ditiotreitolo) e b-mercaptoetanolo: Rompe eventuali ponti disolfuro Glicerolo: Aumenta la densità dei campioni depositandoli nel pozzetto Blu di bromofenolo: Visualizza i campioni e va a costituire il fronte di migrazione Bollitura (100 C per 2-3 minuti): Accelera la completa denaturazione 13

14 3-Caricamento dei campioni Inserimento dei campioni tra le due lastre di vetro mediante puntali monouso Il gel di poliacrilamide ha una capacità limitata e sovraccaricarlo con le proteine può dare risultati di precipitazioni ed aggregazione, produzione di striature e macchie. I risultati migliori si ottengono caricando, per ogni pozzetto, 10 µl di proteina denaturata concentrata 2 mg /ml. 14

15 4-Corsa elettroforetica - connessione all alimentatore di corrente; - impostazione dei valori di voltaggio o amperaggio desiderato; - avvio della corsa; - arresto della corsa quando si vede che il fronte e giunto alla fine del gel. 4-Corsa elettroforetica Stacking gel Resolving gel

16 5-Colorazione 1. Colorazione di proteine con coloranti che si legano con forza ad esse. Rosso Ponceau Blue di Coomassie Colorazione con Argento Analisi Dopo preventivo essiccamento (gel dryer system) le proteine colorate su gel possono essere analizzate (PM, quantità) tramite densitometria (scanner, digital camera, densitometro) Rosso Ponceau La colorazione tramite rosso di ponceau è utilizzata per rilevare e colorare le proteine su acetato di cellulosa, PVDF e membrane di nitrocellulosa. La procedura è reversibile e non invasiva e permette ulteriori test di carattere immunologico sul campione. Il limite minimo per l identificazione è di 250 ng di proteina in gel di poliacrilamide. Il colorante è fortemente elettronegativo e si lega ai gruppi amminici della proteina, oltre che alle regioni non covalenti e non polarizzate. Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle, evidenziare l'area di lavoro le linee di corsa. Queste informazioni sono utili per tagliare la membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie linee o verticalmente o orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi. 10 ml H 2 O distillata 0.3 ml acido aceticog laciale g Ponceau S Fino a 30 ml con H 2 O distillata 16

17 Blue di Coomassie Il blue Coomassie si lega alle proteine attraverso legami ionici tra i gruppi sulfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine oltre che attraverso forze di VanderWaals Procedura di colorazione: Colorante-SO NH 3 -L-COOH 1. rimozione del gel dall apparato di corsa e inserimento in una vaschetta pulita 2. trattamento gel con acido acetico diluito e metanolo per fissaggio proteine al gel e rimozione dell SDS 3. immersione del gel nel colorante sciolto in acido acetico diluito e metanolo da 5 min a 1 h 4. rimozione del colorante non legato alle proteine tramite immersione del gel in acido acetico diluito e metanolo NB Con questo metodo si possono quantificare le proteine sottoponendo il gel a scansione con un densitometro Blue di Coomassie 17

18 Colorazione con l argento Procedura: 1. rimozione del gel dall apparato di corsa e inserimento in una vaschetta 2. trattamento gel con acido acetico diluito e metanolo per fissaggio proteine al gel e rimozione dell SDS 3. Incubazione del gel con una soluzione acida di nitrato di Ag che reagisce con le proteine 4. Incubazione con formaldeide a ph alcalino che riduce Ag + ad Ag metallico che colora le proteine a cui si era precedentemente legato 5. Arresto della reazione con acido acetico Colorazione con l argento 18

19 Essicamento del gel Una volta colorati i gel devono essere essiccati per una buona e lunga conservazione 6 - Studio dell immagine ottenuta A B C D E F Standard (low range) MM A- Fosforilasi B B- BSA C- Ovalbumina D- Anidrasi carbonica E- Inibitore della tripsina F- Lisozima , 2, 3, 4, 5, 6 = campioni di albumina 19

20 Determinazione della massa molecolare di catene polipeptidiche Mobilità relativa di ciascuna proteina 5 4,8 Standard Campione Log PM Log PM 4,6 4,4 4,2 y = 5,0635-0,19269x R= 0, Mobilità relativa Mobiltà relativa Standard in nero, campione in blu Standard e Campione Principali impieghi di una SDS-PAGE Controllo di omogeneità (purificazione di una proteina) Caratterizzazione (determinazione del peso molecolare) Proteomica (analisi dell insieme di proteine di una cellula) Analisi con anticorpi (Western Blotting) 20

21 5-Colorazione - Coomassie Brilliant Blue R Nitrato di argento (10 a 100 volte piu sensibile della colorazione con Coomassie Brilliant Blue R-250) - Metodi immunochimici previo trasferimento su membrana. Ab anti lectina Ab anti lox-1 21