IL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO DELLE SUPERFICI
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1 numero 1 dicembre 2005 IL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO DELLE SUPERFICI Soprattutto in ambito farmaceutico, ma sempre di più anche nel settore alimentare, è fondamentale minimizzare il rischio di contaminazione microbiologica nelle aree produttive. E compito del Controllo Qualità e dei Laboratori di supporto garantire un monitoraggio costante, che consente di intervenire per tempo qualora si presentino contaminazioni che possono influire negativamente sui processi produttivi. I controlli ambientali di tipo microbiologico sono volti soprattutto a monitorare le superfici e l aria, ed in questo numero tratteremo in particolare il controllo delle superfici. A seconda del grado d igiene necessario nei vari processi e del tipo di prodotto trattato, ogni unità operativa dovrà seguire propri standard di controllo. E possibile in ogni caso tracciare alcuni criteri universali, facendo riferimento alle GMP, alle farmacopee e alle linee guida esistenti in ambito farmaceutico e alimentare (es. FSA e FDA). Si tratta quindi di impostare un piano di monitoraggio, il quale dovrà descrivere: 1. Il campionamento, aree e frequenza 2. I sistemi di monitoraggio 3. I limiti di allerta e di azione 4. Le risposte alle eventuali deviazioni dai limiti. 1. CAMPIONAMENTO: AREE E FREQUENZA La definizione delle aree d interesse e della frequenza dei campionamenti deve essere successiva all esecuzione di uno studio preliminare, che permette di tracciare il profilo della flora microbica (o bioburden) presente nell ambiente. Lo studio consente di identificare i cosiddetti punti critici ed è necessario per individuare le possibili fonti di contaminazione e l eventualità di fenomeni ciclici. Il campionamento riguarda le più diverse superfici (pavimenti, pareti, attrezzature, ) ed è prioritario quando è previsto il contatto diretto con i prodotti; esso è condotto prima, durante e dopo situazioni operative ma è utile anche dopo operazioni di disinfezione e pulizia, per verificarne l efficacia. Il numero di campioni da considerare varia secondo l estensione dell area da monitorare. A titolo di esempio, consideriamo un impianto farmaceutico per produzione sterile. Le aree delle Clean Rooms sono classificate in 4 gradi, secondo il livello di attenzione richiesto: - Grado A: aree in cui si svolgono operazioni asettiche ad alto rischio, in cui è prevista l esposizione del prodotto all ambiente (es. riempimento di flaconi). - Grado B: locali in cui si svolgono attività asettiche, che includono le aree a Grado A KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
2 - Gradi C e D: locali meno critici, in cui si svolgono operazioni accessorie (es. preparazione di soluzioni da filtrare). Le aree a Grado A e B richiedono un monitoraggio più accurato e frequente. Se, ad esempio, i gradi A e B richiedono un monitoraggio di superfici, aria ed operatori al termine di ogni turno, per gli altri gradi è sufficiente un controllo giornaliero o settimanale. La frequenza va in ogni modo incrementata all aumentare dell operatività dell area. 2. SISTEMI DI MONITORAGGIO Attualmente, i sistemi più utilizzati per il monitoraggio microbiologico delle superfici sono i tamponi e le piastre da contatto. Nuove metodiche prevedono l utilizzo di spugnette e slides, molto utili in specifiche circostanze. 2.1 TAMPONI (SWABS) E un semplice sistema costituito da uno stelo rigido (in plastica, legno o alluminio) e da una testa morbida (in cotone, fibra sintetica o alginato). Sono utilizzati sia in campo alimentare sia farmaceutico e clinico, per la loro semplicità d utilizzo e per la versatilità di applicazione su molteplici superfici. I tamponi sono indicati soprattutto per le superfici irregolari o per i punti non agevoli da raggiungere. La difficile ripetibilità rende comunque il sistema più adatto per analisi qualitative piuttosto che quantitative. Caratteristiche I tamponi possono essere confezionati in blister o provette, e sono spesso inclusi in veri e propri kit che, oltre al tampone stesso, comprendono un terreno liquido o semisolido che può fungere da terreno di trasporto. I tamponi possono essere asciutti o preumidificati. Campionamento La procedura di campionamento deve essere standardizzata per minimizzare la variabilità dei risultati. Vi sono alcune fasi fondamentali da seguire: - Delimitazione dell area da campionare con una maschera sterile (tipicamente 10x10 cm 2 ). - Estrazione del tampone sterile dal proprio involucro. - Umidificazione con la soluzione appropriata; eliminazione dell eventuale liquido in eccesso premendo il tampone sulla parete della provetta. - Campionamento dell area in esame, strisciandovi il tampone orizzontalmente, verticalmente e diagonalmente per circa 20 secondi; il tampone va ruotato in modo che tutta la testa entri in contatto con la superficie. - Inserimento del tampone nella provetta contenente il terreno prescelto (soluzione neutralizzante o terreno di trasporto). - Striscio immediato su piastra oppure conservazione a +4 C fino al momento dell analisi. KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
3 La scelta del tipo di tampone deve tenere conto della necessità di non interferire con il recupero dei microrganismi, sia nella fase di campionamento sia in quella di conservazione. Negli ultimi anni sono state compiute notevoli innovazioni in questo senso, con modifiche apportate sia ai materiali utilizzati per i vari componenti sia ai terreni di trasporto per la conservazione dei campioni. In alternativa al cotone, sono state sviluppate fibre sintetiche (viscosa, dacron, rayon) e gel (alginato) che ottimizzano il recupero dei microrganismi dalle superfici senza interferirne con la crescita. L alginato, in particolare, consente un recupero totale dei microrganismi raccolti, andando a sciogliersi completamente nella soluzione in cui è immerso dopo il campionamento. Il terreno di conservazione del tampone può essere costituito da una semplice soluzione neutralizzante (in grado di neutralizzare l effetto dei disinfettanti utilizzati per la pulizia delle superfici, si veda la Tabella 1) oppure da un vero e proprio terreno di trasporto. La formulazione deve in ogni caso consentire la conservazione del campione mantenendone inalterate le caratteristiche. Un esempio di terreno di trasporto è costituito dal Maximum Recovery Diluent, soluzione isotonica con un basso contenuto di peptone, particolarmente indicato quando il campione deve essere sottoposto a successive diluizioni. Tabella 1: Agenti neutralizzanti più utilizzati e loro spettro d attività Agente neutralizzante Glicina o Istidina Lecitina Polisorbato 80 Sodio solfito Sodio tioglicollato Sodio tiosolfato Spettro d attività Aldeidi e fenoli Composti di ammonio quaternario Fenoli Formaldeide e glutaraldeide Composti a base di mercurio Composti alogenati La novità più recente è rappresentata dai tamponi preumidificati. Si tratta di tamponi con la testa già imbevuta di una soluzione neutralizzante accuratamente bilanciata, ed il vantaggio evidente è di non dover umettare il tampone prima dell utilizzo. Altrettanto interessanti sono i metodi che prevedono l utilizzo delle spugnette. Il vantaggio di poter campionare una superficie ben più ampia rispetto al tampone è importante soprattutto nel settore alimentare, per la ricerca di Listeria e Salmonella. In modo molto simile al prelievo col tampone, una spugna sterile umettata è passata sulla superficie da esaminare, quindi riposta in un sacchetto sterile da cui, dopo un passaggio in stomacher, è prelevata un'aliquota da inoculare in piastra Petri. Tamponi e spugnette nel catalogo KAIROSafe Kairosafe propone una vasta gamma di sistemi per il controllo microbiologico delle superfici. Oltre ai sistemi più semplici e classici, spiccano i tamponi preumidificati e spugnette di vario tipo, prodotti da TSC Ltd, azienda leader del settore. Nelle pagine seguenti si trovano un esauriente scheda prodotta relativa ai tamponi preumidificati e una lista dei vari prodotti disponibili. KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
4 SCHEDA PRODOTTO TAMPONI PREUMIDIFICATI Innovativi device che rendono semplice e veloce il monitoraggio microbiologico delle superfici. Possono essere utilizzati in campo alimentare, farmaceutico e clinico. Caratteristiche Il prodotto consiste in un tamponcino con stelo in polistirene e testa in viscosa, contenuto in una provetta di polipropilene, confezionato in peel pouch e sterilizzato con raggi gamma. La testa in viscosa è preumidificata con una soluzione neutralizzante propriamente formulata, che neutralizza i disinfettanti comunemente utilizzati e non interferisce con la crescita dei microrganismi durante la conservazione ed il trasporto del campione. Vantaggi Semplice da utilizzare, non occorre umettare il tampone Confezionamento singolo in peel-pouch Etichettatura sulla provetta per consentire l identificazione del campione Conservazione a temperatura ambiente Possibilità di formulazioni custom made Documentazione tecnica che accompagna il prodotto Certificato di Qualità lotto-specifico Istruzioni d uso Scheda tecnica Conservazione e stabilità I tamponi possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi Lista dei sistemi offerti da KAIROSafe per il controllo microbiologico delle superfici Tamponi asciutti senza provetta Tamponi asciutti in provetta di polipropilene Tamponi in provetta con neutralizzante Tamponi preumidificati in provetta Tamponi in provetta con Maximum Recovery Diluent Tamponi in provetta con terreni di trasporto Amies, Cary Blair e Stuart Spugnette asciutte o con neutralizzante. Spugnette con e senza manico Quadrato di campionamento 10x10 cm 2 KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
5 2.2 PIASTRE DA CONTATTO Si tratta di piastre con diametro di 55 mm (superficie 24 cm 2 ) e fondo grigliato. Sono riempite con agar a formare una superficie convessa e sono identificate con il nome commerciale di RODAC (Replicate Organism Detection And Counting). L utilizzo di queste piastre è molto diffuso grazie soprattutto alla semplicità di utilizzo ed alla ripetibilità dei risultati ottenuti. La disponibilità di vari tipi di confezionamento le rende particolarmente adatte al controllo delle aree sterili per produzioni farmaceutiche. Possono essere utilizzate su una gran varietà di superfici, purché lisce e di facile accesso, e presentano solo lo svantaggio di lasciare tracce di agar nel punto di campionamento, richiedendo quindi una pulizia accurata dopo l operazione. Le piastre possono essere confezionate in due modi: - Semplice (film termorestringente), per l uso in ambienti senza particolari esigenze asettiche. - Con più involucri e radiosterilizzate, per l utilizzo in isolatori o clean room farmaceutiche. Gli involucri sono eliminati gradualmente nel passaggio dalle aree meno critiche (grado C e D) a quelle con più alto grado d attenzione (grado A e B). Campionamento Il loro utilizzo è molto semplice, infatti, è sufficiente: - Asportare gli involucri esterni e selezionare un numero appropriato di piastre. - Togliere il coperchio dalla piastra. - Appoggiare il lato con l agar alla superficie da campionare, premendo leggermente per circa 10 secondi, oppure utilizzare gli appositi applicatori, che consentono di standardizzare sia la pressione sia il tempo d applicazione. - Chiudere la piastra con il coperchio ed incubare alle condizioni indicate. - Dopo l incubazione procedere alla lettura dei risultati: il numero di Unità Formanti Colonie (UFC) va riferito alla superficie della piastra. Caratteristiche Le piastre per controlli ambientali contengono di solito TSA, SDA o PCA. In commercio si trovano anche altre formulazioni, quelle offerte da Kairosafe sono elencate brevemente nella Tabella 2. Tabella 2: Terreni disponibili in piastre Rodac per il controllo di superfici Terreno MacConkey Agar Plate Count Agar (PCA) Sabouraud Dextrose Agar (SDA) SDA + Cloramfenicolo Tryptic Soy Agar (TSA) VRBG Agar Utilizzo Coliformi Carica batterica totale, ramo alimentare Funghi e lieviti Funghi e lieviti su superfici contaminate Carica batterica totale Coliformi KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
6 Nella scelta del tipo di terreno, va considerata l esigenza di neutralizzare l effetto battericida o batteriostatico dei disinfettanti utilizzati per la pulizia delle superfici, per questo ai normali terreni possono essere aggiunti agenti neutralizzanti, di cui abbiamo già parlato nelle pagine precedenti (torna a Tabella 1). Inoltre, per gli ambienti in cui si ritiene presente una contaminazione da antibiotici è previsto l utilizzo di piastre con TSA a cui sono state aggiunte la Beta-lattamasi (enzima per l inattivazione di tutti gli antibiotici beta-lattamici) oppure la Penasi (enzima in grado di inattivare le sole penicilline). L aggiunta di questi enzimi neutralizza gli antibiotici presenti nell ambiente, in modo che la crescita dei batteri ad essi sensibili non sia più inibita. Alternativamente alle piastre rodac, per il controllo microbiologico ambientale si possono usare le cosiddette "slides a contatto, palette di plastica con applicazione di agar su entrambi i lati. Come per le piastre, il tempo di contatto con la superficie da controllare è di circa 10 secondi. Si procede quindi con l incubazione alle condizioni indicate per i vari tipi di terreno. Piastre Rodac nel catalogo KAIROSafe Kairosafe propone una vasta gamma di piastre per il controllo microbiologico ambientale, sia contenenti terreni con formulazione classica che con aggiunta di neutralizzanti o enzimi. Tra queste spiccano sicuramente le piastre con TSA e Beta-lattamasi prodotte da Labobasi SA, azienda specializzata nella produzione di terreni di coltura pronti. SCHEDA PRODOTTO LE PIASTRE CON BETA-LATTAMASI Piastre Rodac 55 mm, oppure piastre 90 mm, con TSA e Beta-lattamasi per il controllo microbiologico di ambienti contaminati da antibiotici beta-lattamici. Piastre Rodac 55 mm con TSA + Beta-lattamasi + neutralizzanti Le piastre sono radio-sterilizzate e in triplo involucro per l uso in camere sterili e in isolatori. Le piastre Rodac sono disponibili anche in confezione semplice. Quando usare la Beta-lattamasi: La Beta-lattamasi è un enzima ad ampio spettro che agisce su tutti gli antibiotici betalattamici (penicilline e cefalosporine). Da usare negli impianti di produzione di antibiotici beta-lattamici. La Penasi (o penicillinasi) si limita all azione su una gamma di penicilline, escludendo del tutto le cefalosporine. Documentazione tecnica che accompagna il prodotto Certificato di Qualità Scheda tecnica dettagliata Scheda di sicurezza KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
7 3. RISULTATI DEL CAMPIONAMENTO E LIMITI Il risultato del monitoraggio microbiologico delle superfici si esprime in Unità Formanti Colonie (UFC)/unità di superficie. Utilizzando i tamponi, si fa riferimento ad una maschera di campionamento 10x10 cm 2 ed il risultato è espresso in UFC/100 cm 2. Utilizzando le piastre da contatto, si considera la superficie della piastra stessa ed il risultato è espresso in UFC/24 cm 2. Comunque, è preferibile considerare ogni campione in modo indipendente, piuttosto che analizzare la media fra più prelievi. Ciò consente di individuare le contaminazioni localizzate. Il giudizio sulla qualità microbiologica deve essere espresso in base agli standard stabiliti internamente, e può essere completata tenendo conto di due limiti: - Limite di Allerta: il numero di UFC è tale da indicare una deviazione rispetto alle condizioni operative standard. Il superamento del limite di allerta deve semplicemente mettere sull avviso ed indurre ad una valutazione attenta dei processi effettuati e del comportamento del personale. - Limite di Azione: segnala una situazione da correggere con interventi immediati. Tali limiti non possono assumere il significato di un valore assoluto, ma vanno inquadrati all interno di un trend e valutati seguendo le caratteristiche dell ambiente a cui sono riferiti. A titolo di esempio, riportiamo quanto previsto in un impianto farmaceutico per produzione sterile. Seguendo le normative di riferimento, si considerano quali Limiti di Azione i valori riportati dalla Tabella 3. Tabella 3: Limiti raccomandati per il monitoraggio microbiologico delle Clean Room Classificazione dell area UFC/piastra (24 cm 2 ) Grado A (classe 100, ISO 5) <1 Grado B (classe 100, ISO 5) 5 Grado C (classe , ISO 7) 25 Grado D (classe , ISO 8) 50 Per quanto riguarda i Limiti di Allerta, si dà la possibilità di definizione sulla base delle proprie esigenze operative. 4. STUDIO DEI RISULTATI ED AZIONI CORRETTIVE E importante che i risultati del monitoraggio ambientale siano valutati periodicamente e che siano tracciati trend specifici per le varie aree. La presenza di valori sopra i Limiti di Allerta deve portare come prima conseguenza all incremento del numero dei controlli e della loro frequenza. Invece, il superamento dei Limiti di Azione porterà ad approntare vere e proprie operazioni correttive, che dipenderanno dalla fonte della contaminazione e dalla sua entità. Oltre al dato relativo alle UFC, può essere utile anche l identificazione dei microrganismi. Questo vale soprattutto in particolari circostanze, come ad esempio durante la messa a punto del piano di campionamento, per definire la flora presente e la sua stagionalità, oppure nei casi KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
8 in cui si riscontra una contaminazione al di fuori dei limiti, per individuarne la fonte. Una conoscenza approfondita della contaminazione delle singole aree permette inoltre di scegliere i disinfettanti più adatti per le operazioni di pulizia. CONCLUSIONI L approntamento di un adeguato piano di monitoraggio ambientale consente di mantenere sotto costante controllo le aree operative. In particolare durante i processi produttivi, è fondamentale che si mantenga monitorata ogni fase, per garantire un intervento precoce ed evitare danni irreparabili ai lotti in produzione. Il monitoraggio delle superfici va associato al controllo dei parametri ambientali di temperatura e umidità, alla verifica dell eventuale contaminazione particellare dell aria ed al controllo degli operatori. La scelta dei metodi di campionamento più idonei, un adeguata frequenza dei test ed una pronta risposta alle eventuali deviazioni riscontrate rappresentano i punti di forza di un Controllo Qualità efficiente e risolutivo. Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Telefax: info@kairosafe.it web: Terreni di coltura disidratati Terreni di coltura pronti all uso Accessori per microbiologia Kit per controllo microbiologico delle superfici Ceppi microbici liofilizzati Indicatori biologici e chimici per sterilizzazione LAL test KAIROSafe review n. 1, dicembre /8
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