Estrone ELISA. Enzyme immunoassay for the direct quantitative determination of Estrone in human serum.
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- Alina Paolini
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1 Instructions for Use Estrone ELISA Enzyme immunoassay for the direct quantitative determination of Estrone in human serum. DB C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PREVISTO Test immunoenzimatico per la determinazione quantitative diretta di Estrone nel siero umano. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Estrone è uno steroide simile a estriolo ed estradiolo, appartenente alla classe degli estrogeni. Gli estrogeni sono coinvolti nello sviluppo degli organi sessuali femminili e dei caratteri sessuali secondari. Prima che l ovulo sia fecondato gli estrogeni svolgono la funzione di preparare il tratto riproduttivo ad accogliere l ovulo fecondato. Durante la fase follicolare del ciclo mestruale il livello di estrone mostra un lieve incremento. La produzione di estrone aumenta marcatamente con un picco intorno al giorno 13, il picco è di breve durata e il giorno 16 del ciclo il livello è di nuovo basso. Se la fecondazione non avviene un secondo picco si verifica intorno al giorno 21 del ciclo dopodiché la produzione di estrone diminuisce. 3. PRINCIPIO DEL TEST Test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio di competizione. Una quantità sconosciuta dell antigene presente nel campione e una quantità fissa di antigene legato all enzima competono per i siti di legame sugli anticorpi che rivestono i pozzetti. Dopo incubazione i pozzetti vengono lavati per bloccare la reazione di competizione. Successivamente alla reazione del substrato l intensità del colore sviluppato è inversamente proporzionale alla quantità dell antigene presente nel campione. I risultati dei campioni possono essere determinati direttamente usando la curva standard. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico invitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 28 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. Dopo l apertura gli standard e gli controlli possono essere conservati 14 giorni a 28 C o, suddivisi in aliquote, a 20 C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. V7.1 March 24,2016 (02) 1 / 6
3 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. Non usare campioni che contengono NaN 3 o Thimerosal poiché possono portare a risultati falsi. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Conservazione: 4 C 10 C (Aliquote) Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Stabilità: 24 h 24 h Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ 1 x 2 ml CAL A 1 x 5 x 1.0 ml 1x 2 x 1.0 ml CAL BF CONTROL LOW CONTROL HIGH 1 x 18 ml TMB SUBS 1 x 8 ml TMB STOP 2 x 50 ml WASHBUF CONC Micropiastra Strisce separabili. Coniugato con anticorpo di anti Estrone (policlonale). Coniugato Enzimatico, Contiene: EstroneHRP Coniugato, in tampone contenente proteine, conservativos libero da mecurio. Standard A 0 pg/ml Pronto/a all uso. Contiene: Estrone, in tampone contenente proteine, conservativos libero da mecurio. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità. Standard BF 10; 25; 100; 400; 2000 pg/ml Pronto/a all uso. Contiene: Estrone, in tampone contenente proteine, conservativos libero da mecurio. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità. Controllo Elevato Pronto/a all uso. Contiene: Estrone contenente proteine, conservativos libero da mecurio. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette sulle provette o il certificato di Controllo Qualità. Soluzione Substrato TMB Pronto/a all uso. Contiene: TMB e Perossido di idrogeno in un tampone libero da DMF o DMSO. Soluzione Stop TMB Pronto/a all uso. 1 M H2SO4. Tampone Lavaggio, Concentrato (10 x) Contiene: Tampone con detergente nonionico e conservativos libero da mecurio. 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 50, 100, 150, 300 μl 2. Agitatore orbitale (600 rpm) (p.e.. EAS 2/4, SLT) o shaker lineare (200rpm) 3. Micropipetta 8Canali con contenitori per reagenti 4. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 5. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 6. Acqua bidistillata o deionizzata 7. Carta assorbente, puntali per pipette e timer V7.1 March 24,2016 (02) 2 / 6
4 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (1825 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Alcuni componenti contengono un volume 250 µl di soluzione. Assicurarsi che la soluzione sia sul fondo del flacone prima di aprirlo. 5. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 6. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 7. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 8. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 9. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRETEST Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati Diluire / dissolvere Componente con Diluente Rapporto Conservazione Stabilità 50 ml WASHBUF CONC 450 ml acqua bidist. 1:10 28 C 12 mesi Campioni contenenti concentrazioni più elevate dello standard massimo devono essere diluiti ulteriormente fino ad una proporzione 1:8 con lo standard A e dosati nuovamente. V7.1 March 24,2016 (02) 3 / 6
5 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 50 µl di ogni Standard, Controlli e campione nei rispettivi pozzetti della Micropiastra. 2. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimático in ogni pozzetto. 3. Incubare 1 h a TA (1825 C) su un agitatore orbital (appross. 600 rpm) o shaker lineare (200 rpm). 4. Lavare la piastra 3 x con 300 µl di Tampone di Lavaggio diluiti. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 5. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8canali. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. Usare uno spostamento positivo ed evitare la formazione di bolle d aria. 6. Pipettare 150 µl di Soluzione Substrato TMB in ogni pozzetto. 7. Incubare min a TA (1825 C) su un agitatore orbital (appross. 600 rpm) o shaker lineare (200 rpm) o fino al standard A ottene il colore di blu scuro per la DO desiderata. 8. Fermare la reazione del substrato aggiungendo in ogni pozzetto 50 μl di Soluzione Stop TMB. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 9. Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 nm* entro 20 min. *) Se la DO supera il limite massimo di riscontro o se non è disponibile un filtro da 450 nm, si può sostituire con un filtro da 405 o 415 nm. Le densità ottiche saranno inferiori, tuttavia questo non modificherà i risultati dei campioni dei pazienti/di controllo. 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette delle fiale. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni di incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o LogitLog. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRETEST e ritestati. Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard DO Valor (pg/ml) A B C D E F Ignorato V7.1 March 24,2016 (02) 4 / 6
6 14. VALORI ATTESI ES Come per qualsiasi altro dosaggio ciascun laboratorio deve raccogliere i dati e stabilire il proprio range di valori normali previsti. Gruppo Intervallo (pg/ml) Uomini Donne Premenopausa Donne Postmenopausa PERFORMANCE SENSIBILITÀ Il limite di rilevamento (LoD) è stato determinato dall'analisi di 60 campioni con bassi valori e di bianchi ed è stato calcolato come segue: LoD = μb σB σS, dove σb e σs sono la deviazione standard dei bianchi e dei campioni con bassi valori e μb è il valore medio del bianco. Il limite di rilevamento (LOD) è stato determinato in 3 pg / ml. SPECIFICITÀ (CROSS REATTIVITÀ) Sono stati dosati i seguenti composti per verificare la loro cross reattività con l anticorpo utilizzato nel Estrone ELISA. Estrone ha una cross reazione del 100%. Steroide Cross reattività % Estrone 100 Estrone3solfato ßestradiolo 2.2 Estrone3glucuronide ßestradiolo3glucoronidi 0.14 I seguenti steroidi hanno mostrato una cross reattività < 0.1%: Androstenedione, Colesterolo, Corticosterone, cortisolo, Cortisone, DHEAS, Diethylstilbesterone, Estriolo, 17βestradiolo3glucoronidi, Estradiolosolfato, progesterone, 17OH Progesterone, e testosterone. PRECISIONE INTRASAGGIO Tre campioni sono stati dosati 10 volte nello stesso esperimento con i seguenti risultati (espressi in pg/ml): Campione Media SD CV% PRECISIONE INTERSAGGIO Tre campioni sono stati dosati 10 volte durante 4 settimane con i seguenti risultati (espressi in pg/ml): Campione Media SD CV% V7.1 March 24,2016 (02) 5 / 6
7 RECUPERO Campioni positivi sono stati preparati aggiungendo quantità definite di estrone a tre sieri di pazienti. I risultati (in pg / ml) sono riportati di seguito: Campione Osservato Atteso Recupero% 1 non addizionati non addizionati non addizionati LINEARITÀ Tre campioni di siero sono stati diluiti con lo Standard A; il dosaggio ha dato i seguenti risultati (espressi in pg/ml): Campione Osservato Atteso Recupero% 1 1:2 1:4 1:8 2 1:2 1:4 1:8 3 1:2 1:4 1: CONFRONTO FRA METODI Il kit ELISA Estrone (y) è stato confrontato con LC / MS (x). Il confronto di 19 campioni di siero ha dato i seguenti risultati di regressione lineare: y = x r 2 = RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Hauptmann. H. et al: Concepts for the synthesis ofbiotinylated steroids. Part 2: 17βestradiol derivatives as immunochemical probes. Bioconjugate Chem. 11(2000) Dressendorfer R.A. et al: Synthesis of a cortisolbiotin conjugate and evalution as atracer in an immunoassay for salivary cortisol measurement. J. Steroid Biochem. Molec. Biol.: 43 (1992) Mayer H.H.D. et al: Immunoaffinity chromatography and a biotinstreptavidin amplified immunoassay for sensitive and specific estimation of estradiol17. J. Steroid Biochem. 35 (1990) Folan J. et al: Solidphase Enzymoimmunoassay of estrone in serum. Clin. Chem. 34(1988) Folan J. et al: SolidPhase Enzymoimmunoassay of estrone in saliva. Clin. Chem. 35:4(1989) Speroff L. et al: Hormone biosynthesis, metabolism, and mechanism of action. In: Clinical gynecologic endocrinology & infertility, 3rd ed. Willanms & Wilkins. 1983: Kim M.H. et al: Plasma levels of estrogen, androgens and progesterone during normal and dexamethasonetreated cycles. J. Clin. Endocrinol. Metab. 39(1974) Speight A.C. et al; Nonprotein bound oestrgens in plasma and urinary excretion of unconjugated oestrogens in nonpregnant women. J. Endocrino 83(1979) Kricka, L.J., Human antianimal antibody interferences in immunological assays. Clin. Chemistry 45:7, Check, J.H., et al, Falsely elevated steroidal assay levels related to heterophile antibodies against various animal species. Gynecol Obstet Invest 40:139140, V7.1 March 24,2016 (02) 6 / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθμόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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