SET RPLA SET RPLA : test di agglutinazione passiva inversa ( sensibilità del metodo : ng/ml )

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1 SET RPLA Test semiquantitativo utilizzato per la ricerca delle enterotossine stafilococciche A,B,C,D mediante agglutinazione passiva inversa al lattice Si utilizzano degli antisieri ricavati per immunizzazione di conigli con enterotossine stafilococciche purificate A,B,C,D. Le relative immunoglobuline vengono purificate per affinità cromatografica e con queste sensibilizzate le particelle di lattice. Queste ultime agglutinano in presenza delle corrispondenti enterotossine SET RPLA SET RPLA : test di agglutinazione passiva inversa ( sensibilità del metodo : ng/ml )

2 SET RPLA Test semiquantitativo utilizzato per la ricerca delle enterotossine stafilococciche A,B,C,D mediante agglutinazione passiva inversa al lattice 10 g di campione + 10 ml di Soluzione fisiologica omogeneizzazione Protocollo di estrazione Centrifugare a 900g per 30 a 4 C Filtrare il surnatante su membrana (0,2 0,45μm) a bassa capacità di legare le proteine Usare il filtrato come campione SET RPLA : test di agglutinazione passiva inversa ( sensibilità del metodo : ng/ml )

3 VIDAS Staph enterotoxin II Test qualitativo automatizzato sul sistema Vidas per la rilevazione delle enterotossine con la tecnica ELFA ( Enzyme Linked Fluorescent Assay ) PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE PER PRODOTTI LATTIERO-CASEARI CON CONCENTRAZIONE ACIDO TRICLOROACETICO DIALISI Questo protocollo è raccomandato per aumentare la concentrazione delle tossine nei prodotti lattiero-caseari e per sopprimere le rare interferenze riscontrate per certi formaggi a base di latte crudo Esempio : Roquefort

4 Concentrazione tramite Dialisi contro una soluzione di polietilen glicol (PEG) 25 g di campione + 40 ml di Acqua distillata a 38 C Omogeneizzazione e dispersione delle enterotossine nella fase acquosa Il campione subisce acidificazione e alcalinizzazione per eliminare le interferenze che potrebbero dare dei falsi positivi Il surnatante finale è sottoposto a dialisi per una notte per permettere la concentrazione delle enterotossine eventualmente presenti L analisi viene eseguita sul dializzato, tramite VIDAS SET2 : test immunoenzimatico

5 Concentrazione tramite Dialisi contro una soluzione di polietilen glicol (PEG) Vidas Staph. Enterotoxin è un test immunoenzimatico Sulla superficie interna del cono sono fissati anticorpi monoclonali di topo e ratto; gli antigeni presenti nel campione si legano agli anticorpi monoclonali fissati sulle pareti interne del cono

6 Criterio di sicurezza: enterotossine stafilococciche 15,0% Formaggi di malga: % campioni positivi per enterotossine stafilococciche (isolamento da alimento) 14,7% 10,0% 5,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 4,8% 0,0% : introduzione di un nuovo metodo di ricerca delle enterotossine stafilococciche direttamente dall alimento.

7 Campioni di formaggio analizzati Criteri d igiened Criterio microbiologico Stafilococchi coag (fino 30.11) Non conformi DPR 54/97 (10 4 ufc/g ) Non conformi Reg. 2073/05 (10 5 ufc/g ) E.coli Non conformi DPR 54/97 (10 5 ufc/g) limite non previsto dal Reg /05

8 Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi Formaggi di malga: % campioni non conformi per stafilococchi coagulasi positivi 90,00% 80,00% 77,42% 85.63% 85.64% 11,60% 15,31% 70,00% 60,00% 50,00% 45,16% 54,62% 40,00% 30,00% 25,23% 74,03% 70,33% 20,00% 10,00% 0,00% DPR 54/97 M= 10 4 ufc/g Reg. 2073/05 M= 10 5 ufc/g

9 Microrganismi indicatori di igiene del processo E.coli Formaggi di malga: % campioni non conformi per E.coli 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 13,33% 23,26% 22,11% 36,96% 17,57% 28,92% DPR 54/97 M= 10 5 ufc/g Reg. 2073/05 prevede la ricerca di E.coli nei formaggi prodotti con latte sottoposto a trattamento termico

10 Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi ( Friuli ) FORMAGGI A BASE DI LATTE CRUDO E TERMIZZATO: RICERCA STAFILOCOCCHI CUT10 5 ufc/g- OFF % campioni positivi : 50,00% 2007: 87.51% <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 2006: 50,00% 2007: 14.29% CLASSI DI VALORI (ufc/g)

11 Aspetti microbiologici nei prodotti a base di latte degli alpeggi Burro di malga

12 Le normative a confronto D.P.R. n 54 / 97 (linee direttrici) (linee direttrici) - Reg.CE 2073/05.CE 2073/05(criterio (criterio di igiene di processo) Microrganismo Prodotti Valori Coliformi D.P.R. 54/97 E. coli Reg.. CE 2073/05 Burro Burro e panna a base di latte crudo o di latte sottoposto a trattamento termico a temperatura inferiore a quella della pastorizzazione m=0 M= 10 ufc/g n=5, c=2 m=10 ufc/g M=100 ufc/g n=5, c=2

13 La produzione del burro La produzione di burro con le panna di affioramento che non siano state preventivamente risanate termicamente non consente di ottenere un prodotto con i parametri microbiologici previsti dalla normativa ( coliformi 10ufc/g E.coli 100ufc/g ) Il burro è perciò un prodotto estremamente delicato igienicamente per la cui produzione è fatto obbligo di pastorizzare le panne a temperature superiori a 90 C per garantire il necessario risanamento microbico. La sua produzione in alpeggio è possibile solamente se si dispone di un impianto che consenta di praticare tale pastorizzazione

14 Campioni di burro analizzati criteri di sicurezza Criterio microbiologico (fino 30.11) Salmonella spp presente/assente in 25 g L. Monocytogenes presente/assente in 25 g * Campylobacter termofili presente/assente in 25 g Enterotossine stafilococciche presente/assente assente assente assente assente assente assente assente assente assente assente assente 1 positivo assente assente assente assente assente assente assente assente assente * Indagine non obbligatoria 1 campione di burro riscontrato positivo per L.monocytogenes con una carica di 10 ufc/g

15 Campioni prelevati nella malghe del Friuli anni ANN O 2006 MATRICE LISTERIA MONOCYTOGENES ESITO E I N P BURRO FORMAGGI LATTE ACIDIFICATO YOGURT 1 1 LATTE CRUDO LATTE DERIVATI 2 2 LATTE DERIVATI PANNA LATTE DERIVATI RICOTTA Totale Totale complessivo BURRO FORMAGGI LATTE CRUDO AZIENDALE 1 1 LATTE DERIVATI 1 1 LATTE DERIVATI RICOTTA MATERIA PRIMA ANIMALE -SIERO DI LATTE 1 1 TAMPONE AMBIENTALE ATTREZZATURA Totale Totale complessivo

16 Campioni di burro analizzati criteri d igiened Criterio microbiologico Stafilococchi coag (fino 30.11) non conformi DPR 54/97 (10 4 ufc/g) E.coli non conformi Reg 2073/05 (10 2 ufc/g)

17 Campioni di burro analizzati criteri d igiene Criterio microbiologico (fino 30.11) Stafilococchi coag non conformi DPR 54/97 (10 4 ufc/g) E.coli non conformi Reg 2073/05 (10 2 ufc/g)

18 Burro: microrganismi indicatori di igiene del processo Burro: Stafilococchi coagulasi positivi 35,00 30, : 48,15% 2003: 42,11% 2004: 56,25% CUT-OFF 2002: 51,85% 2003: 57,89% 2004: 43,75% % campioni positivi 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3>10^3 & <=10^4>10^4 & <=10^5 >10^ CLASSI DI VALORI (ufc/g)

19 Burro : Microrganismi indicatori di igiene del processo Burro : Stafilococchi coagulasi positivi 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% Burro: % campioni per livello di contaminazione da Stafilococchi coagulasi positivi 2005: 60.0% 2006:82.9% 2007:50.0% 10 4 ufc/g 2005: 40.0% 2006:17.7% 2007:50.0% 0,0% <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >=10000 >10000 >= >

20 Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi ( Friuli ) BURRO: RICERCA STAFILOCOCCHI 10 5 ufc/g : 88,46% 2007: 82,5% 2006: 11,57% 2007: 17,50% % campioni positivi <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^ CLASSI DI VALORI (ufc/g)

21 Burro : germi indicatori coliformi 40,00 % campioni positivi 30,00 20,00 10,00 10 ufc/g 0,00 <=10^2 >10^2 & >=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 & <=10^6 >10^ CLASSI DI VALORI (ufc/g)

22 Burro : Microrganismi indicatori di igiene del processo Burro : E.coli Burro: % campioni per livello di contaminazione da E.coli 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% 2006:47.6% 2007:44.4% 10 2 ufc/g <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >= :52.4% 2007:55.6% 10 >10 e 10 2 >10 2 e 10 3 >10 3 e 10 4 ufc/ml

23 Microrganismi indicatori di igiene del processo E.coli 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Burro: % campioni per livello di contaminazione da E.coli 2005: 24.0% 2006:47.6% 2007:44.4% 10 2 ufc/g <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >= : 76.0% 2006:52.4% 2007:55.6%

24 Criterio di sicurezza: enterotossine stafilococciche Burro: % campioni positivi per enterotossine stafilococciche 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% 0,00% 0,00% : introduzione di un nuovo metodo di ricerca delle enterotossine stafilococciche direttamente dall alimento alimento.

25 Aspetti microbiologici nei prodotti a base di latte degli alpeggi Ricotta di malga

26 Prodotti lattiero caseari di malga : la Ricotta La ricotta è un prodotto a base di latte ottenuta dalla lavorazione del siero e quindi non può essere definita un formaggio.si deve considerare genericamente un latticino Non contiene i batteri lattici vivi presenti nel latte che contrastano la contaminazione di microrganismi patogeni e inoltre non va incontro ad un processo di acidificazione come avviene nel formaggio, perciò è un prodotto molto delicato da un punto di vista igienico- sanitario.

27 Prodotti lattiero caseari di malga : la Ricotta Riscaldamento del siero C Aggiunta di ingredienti (panna, latte) Acidificazione Riscaldamento a 90 C Coagulazione delle sieroproteine Raccolta della ricotta in stampi Drenaggio Raffreddamento Affumicatura ( eventuale )

28 Campioni di ricotta analizzati Criterio microbiologico (fino 30.11) Salmonella spp presente/assente in 25 g assente assente assente L. Monocytogenes presente/assente in 25 g assente assente 1 positivo Stafilococchi coag E.coli campione di ricotta riscontrato positivo per L.monocytogenes con una carica batterica <10 ufc/g

29 Campioni prelevati nella malghe del Friuli anni ANN O 2006 MATRICE LISTERIA MONOCYTOGENES ESITO E I N P BURRO FORMAGGI LATTE ACIDIFICATO YOGURT 1 1 LATTE CRUDO LATTE DERIVATI 2 2 LATTE DERIVATI PANNA LATTE DERIVATI RICOTTA Totale Totale complessivo BURRO FORMAGGI LATTE CRUDO AZIENDALE 1 1 LATTE DERIVATI 1 1 LATTE DERIVATI RICOTTA MATERIA PRIMA ANIMALE -SIERO DI LATTE 1 1 TAMPONE AMBIENTALE ATTREZZATURA Totale Totale complessivo

30 Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi Ricotta : % campioni per livello di contaminazione da Stafilococchi coagulasi positivi 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >=

31 Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi ( Friuli ) RICOTTA: ANALISI STAFILOCOCCHI % campioni positivi <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 CLASSI DI VALORI (UFC/g)

32 RICOTTA : piano malghe CARICA MESOFILA TOTALE 59,26 60,00 % campioni positivi 50,00 40,00 30,00 20,00 11,11 29,63 10,00 0,00 <=10^7 >10^7 & <=10^8 >10^8 CLASSI DI VALORI (UFC/g)

33 RICOTTA : piano malghe ,00 COLIFORMI TOTALI 45,16 % campioni positivi 40,00 30,00 20,00 9,68 9,68 9,68 22,58 10,00 3,23 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 & <=10^6 >10^6 CLASSI DI VALORI (UFC/g)

34 RICOTTA : piano malghe ,00 28,13 25,00 ESCHERICHIA COLI % campioni positivi 20,00 10,00 6,25 18,75 18,75 3,13 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 & <=10^6 >10^6 CLASSI DI VALORI (UFC/g)

35 RICOTTA : piano malghe ,00 31,25 37,5 STAFILOCOCCHI COAG + 31,25 % campioni positivi 30,00 20,00 10,00 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 CLASSI DI VALORI (UFC/g)

36 Biotipizzazione dello Stafilococco aureo coagulasi + mediante prove biochimiche Prove per la biotipizzazione Produzione di stafilochinasi Produzione di emolisina Capacità di coagulare il plasma bovino in 6 h Crescita e aspetto su agar Cristal Violetto Test per la proteina A

37 Tabella di lettura dei Biotipi di S. aureus Biotipo K βh BC CV pa UMANI A/C BOVINO A OVINO C AVIARE A - POULTY LIKE A + NHS C NHS A NHS C K= Stafilochinasi CV= tipo di crescita su agar violetto H= beta emolisi PA= proteina A BC= Coagulazione plasma bovino NHS= non ospite specifico

38 Biotipizzazione ceppi di Stafilococco coag.+ ( Friuli ) Matrice Positivi Umani Animale Latte crudo Burro Ricotta TOTALI

39 Biotipizzazione ceppi di Stafilococco coag.+ ( Trentino ) Matrice Positivi Umani Animale NHS Latte crudo Formaggi Burro TOTALI

40 Biotipizzazione ceppi di Stafilococco coag.+ ( Ricerca corrente ) Matrice Positivi Umani Animale NHS Formaggi Ricotta 3 1 / 1 Burro 2 1 / 1 TOTALI

41 In conclusione : Proposta per il miglioramento igienico-sanitario dei prodotti lattiero-caseari di malga Controllo dello stato sanitario della mammella degli animali destinati alla monticazione Verifica analitica della presenza di stafilococchi coag.+ nel latte Miglioramento delle condizioni igieniche di mungitura Lavaggio e disinfezione sistematica delle attrezzature Educazione igienico-sanitaria permanente al personale ( malghesi ) sulle B.P.L. nella filiera produttiva della produzione in malga antagonismo batterico con flora lattica?

42 Grazie per l attenzione