La trascrizione: da DNA ad RNA

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1 La trascrizione: da DNA ad RNA

2 An organism may contain many types of somatic cells, each with distinct shape and function. However, they all have the same genome. The genes in a genome do not have any effect on cellular functions until they are "expressed". Different types of cells express different sets of genes, thereby exhibiting various shapes and functions. Gene expression" means the production of a protein or a functional RNA from its gene. Several steps are required: Transcription: A DNA strand is used as the template to synthesize a RNA strand, which is called the primary transcript. RNA processing: This step involves modifications of the primary transcript to generate a mature mrna (for protein genes) or a functional trna or rrna. For RNA genes (trna and rrna), the expression is complete after a functional trna or rrna is generated. However, protein genes require additional steps: Nuclear transport: mrna has to be transported from the nucleus to the cytoplasm for protein synthesis. Protein synthesis: In the cytoplasm, mrna binds to ribosomes, which can synthesize a polypeptide based on the sequence of mrna. The central dogma According to the above process, the flow of genetic information is in the following direction: DNA > RNA > Protein. This rule was dubbed the "central dogma", because it was thought that the same principle would apply to all organisms. However, we now know that for RNA viruses, the flow of genetic information starts from RNA.

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4 Schematic illustration of transcription. (a) DNA before transcription. (b) During transcription, the DNA should unwind so that one of its strand can be used as template to synthesize a complementary RNA.

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7 Growth of a nucleic acid strand is always in the 5' to 3' direction. This is true not only for the synthesis of RNA during transcription, but also for the synthesis of DNA during replication. The enzymes, called polymerases, are used to catalyze the synthesis of nucleic acid strands. RNA strands are synthesized by RNA polymerases. DNA strands are synthesized by DNA polymerases. The entire transcription process should involve the following essential steps: (i) Binding of polymerases to the initiation site. The DNA sequence which signals the initiation of transcription is called the promoter. Prokaryotic polymerases can recognize the promoter and bind to it directly, but eukaryotic polymerases have to rely on other proteins called transcription factors. (ii) Unwinding (melting) of the DNA double helix. The enzyme which can unwind the double helix is called helicase. Prokaryotic polymerases have the helicase activity, but eukaryotic polymerases do not. Unwinding of eukaryotic DNA is carried out by a specific transcription factor. (iii) Synthesis of RNA based on the sequence of the DNA template strand. RNA polymerases use nucleoside triphosphates (NTPs) to construct a RNA strand. (iv) Termination of synthesis. Prokaryotes and eukaryotes use different signals to terminate transcription. [Note: the "stop" codon in the genetic code is a signal for the end of peptide synthesis, not the end of transcription.] Transcription in eukaryotes is much more complicated than in prokaryotes, partly because eukaryotic DNA is associated with histones, which could hinder the access of polymerases to the promotor.

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9 Transcription is a process in which one DNA strand is used as template to synthesize a complementary RNA. The following is an example: Note that uracil (U) of RNA is paired with adenine (A) of DNA. There are a few different names for these nucleic acid strands. The DNA strand which serves as the template may be called "template strand", "minus strand", or "antisense strand". The other DNA strand may be termed "non-template strand", "coding strand", "plus strand", or "sense strand". Since both DNA coding strand and RNA strand are complementary to the template strand, they have the same sequences except that T in the DNA coding strand is replaced by U in the RNA strand.

10 The function of RNA polymerases Both RNA and DNA polymerases can add nucleotides to an existing strand, extending its length. However, there is a major difference between the two classes of enzymes: RNA polymerases can initiate a new strand but DNA polymerases cannot. Therefore, during DNA replication, an oligonucleotide (called primer) should first be synthesized by a different enzyme. The chemical reaction catalyzed by RNA polymerases is shown. The nucleotides used to extend a growing RNA chain are ribonucleoside triphosphates (NTPs). Two phosphate groups are released as pyrophosphate (PPi) during the reaction. Strand growth is always in the 5' to 3' direction. The first nucleotide at the 5' end retains its triphosphate group. Simplified presentation for the chain elongation. The vertical line represents the pentose and the slanting line denotes the phosphodiester bond. Bases are designated as N1, N2, etc.

11 The chemical reaction catalyzed by RNA polymerases.

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13 Classes of RNA polymerases E. coli An E. coli RNA polymerase is composed of five subunits: two subunits, and one for each, ', and subunit. (151 kd) and ' (156 kd) are significantly larger than (37 kd). Several different forms of subunits have been identified, with molecular weights ranging from 28 kd to 70 98ik98ik4kD. The subunit is also known as the factor. It plays an important role in recognizing the transcriptional initiation site, and also possesses the helicase activity to unwind the DNA double helix. Nucleotide synthesis is carried out by other four subunits, which together are called the core polymerase. The term "holoenzyme" refers to a complete and fully functional enzyme. In this case, the holoenzyme includes the core polymerase and the factor. Eukaryotes There are three classes of eukaryotic RNA polymerases: I, II and III, each comprising two large subunits and smaller subunits. The two large subunits are homologous to the E. coli and ' subunits. Two smaller subunits are similar to the E. coli subunit. However, the eukaryotic RNA polymerase does not contain any subunit similar to the E. coli factor. Therefore, in eukaryotes, transcriptional initiation should be mediated by other proteins. RNA polymerase II is involved in the transcription of all protein genes and most snrna genes. It is undoubtedly the most important among the three classes of RNA polymerases. The other two classes transcribe only RNA genes. RNA polymerase I is located in the nucleolus, transcribing rrna genes except 5S rrna. RNA polymerase III is located outside the nucleolus, transcribing 5S rrna, trna, U6 snrna and some small RNA genes.

14 Transcription Mechanisms in Prokaryotes In prokaryotes, binding of the polymerase's s factor to promoter can catalyze unwinding of the DNA double helix. The most important s factor is Sigma 70, whose structure has been determined by x-ray crystallography, but its complex with DNA has not been solved. (b) (a) The structure of Sigma 70 and its DNA binding site. (a) Structure of Sigma 70, residues 114 to 448. PDB ID = 1SIG. (b) A model for the binding between Sigma 70 and the promoter, based on biochemical studies. Residues Y425, Y430, W433 and W434 are directly involved in the unwinding (melting) of the double helix.

15 The promoter is rich in A and T. The AT pair involves two hydrogen bonds whereas the CG pair involves three hydrogen bonds. Therefore, AT pairs are easier to separate. The DNA replication origin is also rich in A and T. After the DNA strands have been separated at the promoter region, the core polymerase ( ') can then start to synthesize RNA based on the sequence of the DNA template strand. Since the role of the factor is mainly to initiate transcription, it will be released after about 10 ribonucleotides have been polymerized. Elongation of the RNA strand continues until the core polymerase reaches the termination site.

16 Tipi di RNA polimerasi DNA-dipendenti Polimerasi Batteri RNA polimerasi Nuclei eucariotici RNA polimerasi I RNA polimerasi II RNA polimerasi III RNA polimerasi IV (soltanto nei vegetali?) Organelli eucariotici RNA polimerasi mitocondriale RNA polimerasi del cloroplasto (multiple; codificate sia nel cloroplasto che nel nucleo) Geni trascritti Tutti i geni batterici Geni dell RNA ribosomiale (rrna) mrna, snorna, alcuni snrna, mirna trna, 5S rrna, alcuni snrna sirna coinvolti nella formazione di eterocromatina Geni mitocondriali Geni del cloroplasto

17 I promotori batterici hanno due sequenza consenso distinte

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19 Struttura del fattore batterico e dell oloenzima della RNA polimerasi

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21 Cambiamenti conformazionali durante i passaggi di inizio della trascrizione

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23 Terminazione della trascrizione

24 Transcriptional Termination in Prokaryotes In prokaryotes, the transcription is terminated by two major mechanisms: Rho-independent (intrinsic) and Rho-dependent. The Rho-independent termination signal is a stretch of bp sequence, consisting of many GC residues followed by a series of T ( "U" in the transcribed RNA). The resulting RNA transcript will form a stem-loop structure to terminate transcription. The stem-loop structure of the RNA transcript as a termination signal for the transcription of the trp operon.

25 Rho-dependent mechanism Rho is a ~ 50 kd protein, involved in bout half of E. coli transcriptional terminations. It has been well established that six Rho proteins form a hexamer to terminate transcription, but the precise mechanism is not clear. Experiments suggest that two components are essential: (i) the upstream Rho loading site and (ii) the downstream termination site. The Rho hexamer first binds to the RNA transcript at the upstream site which is nucleotides long and rich in C residues. Upon binding, the Rho hexamer moves along the RNA in the 3' direction. If movement of the polymerase is slow, the Rho hexamer will catch up and terminate the transcription at the downstream termination site. Rho has ATPase activity which can induce release of the polymerase from DNA.

26 Correzione delle bozze da parte della RNA polimerasi

27 Regolazione della trascrizione nei procarioti e negli eucarioti

28 Gene's Regulatory Elements Transcriptional regulation is mediated by the interaction between transcription factors and their DNA binding sites which are the cis-acting elements, whereas the sequences encoding transcription factors are trans-acting elements. The cis-acting elements may be divided into the following four types: Promoters Enhancers Silencers Response elements

29 Gene organization. The transcription region consists of exons and introns. The regulatory elements include promoter, response element, enhancer and silencer (not shown). Downstream refers to the direction of transcription and upstream is opposite to the transcription direction. The numbering of base pairs in the promoter region is as follows. The number increases along the direction of transcription, with "+1" assigned for the initiation site. There is no "0" position. The base pair just upstream of +1 is numbered "-1", not "0".

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31 Promoter is the DNA region where the transcription initiation takes place. In prokaryotes, the sequence of a promoter is recognized by the Sigma (s) factor of the RNA polymerase. In eukaryotes, it is recognized by specific transcription factors. E. Coli E. coli has five sigma factors: Sigma 70: Regulate expression of most genes. Sigma 32: Regulate expression of heat shock proteins. Sigma 28: Regulate expression of flagellar operon (involved in cell motion). Sigma 38: Regulate gene expression against external stresses. Sigma 54: Regulate gene expression for nitrogen metabolism.

32 E. coli factors and the consensus sequences of their recognition sites (promoters). Table shows the consensus sequences of the promoters recognized by E. coli factors (except for Sigma 38 which is not clear). The consensus sequence is an ideal sequence for the interaction with its regulatory protein. A promoter should contain an element which is identical to or very close to the consensus sequence.

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34 Direzione della trascrizione intorno al genoma circolare di E. coli

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36 Modello dell operone di Jacob e Monod

37 The lac Operon Promoter The lac operon of E. coli was used by Francois Jacob, Andre Lwoff and Jacques Monod to investigate the transcription mechanism in 1960s, providing the first molecular details. Its promoter sequence is shown in the following figure. The lac operon promoter ( which regulates the transcription of lacz, not laci). (a) Presented so that the genome sequence numbers increase from left to right. Its 5' to 3' sequence is the same as in the database (ACCESSION AE000141). (b) Presented so that the promoter sequence numbers increase from left to right. Its 5' to 3' sequence is comparable to the consensus sequence. (a) (b)

38 (a) (b) E. coli operons. An operon consists of several genes which are transcribed together. (a) The lac operon comprises laca, lacy and lacz. The laci gene is not part of the operon, but encodes a protein which could repress transcription of the lac operon. (b) The trp operon consists of trpa, trpb, trpc, trpd, and trpe. (Numbers represent the genome sequence

39 The DNA's two strands are complementary to each other. Only one strand's sequence is sufficient to represent both strands' information. By convention, the sequence of the 5' to 3' strand (from left to right) is used. From the above figure, the promoter sequence of the lac operon is TATGTT at the -10 region, and TTTACA at the -35 region. The consensus sequence of s70 which regulates the lac operon is TATAAT at the -10 region, and TTGACA at the -35 region. They differ at three positions (two at the -10 region and one at the -35 region). Experimentally, it has been found that binding of the RNA polymerase to the lac promoter is relatively weak. Transcription of the lac operon often requires an activation such as catabolite activator protein (CAP). Transcriptional activation by CAP In the absence of any transcriptional activator, binding of the polymerase to the promoter of the lac operon is weak. The binding site of the catabolite activator protein (CAP) is located just upstream of the promoter. In such case, the activator can enhance transcription by direct contact with the polymerase, making it bind more efficiently to the promoter. Transcriptional inhibition by lac repressor The silencer (also known as operator) of the lac operon is located at the transcriptional start site. When the lac repressor binds to this region, it will block the movement of the polymerase, thereby inhibiting transcription.

40 Dimostrazione sperimentale del legame del repressore lac all operatore

41 Regulation of lac Operon Transcription Regulation of the lac operon transcription. (a) by CAP. (b) by lac repressor

42 Structure of the lac repressor/operator complex. The repressor is a homodimer. Each subunit is represented by a different color. PDB ID = 1LBG.

43 Regolazione dell operone lac da parte di glucosio e lattosio

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45 Complesso CAP-DNA

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50 Dimostrazione sperimentale della formazione di un ansa di DNA

51 L operone del Triptofano (trp) La regolazione dell operone del trp nei batteri è un classico esempio di attenuazione trascrizionale. Due meccanismi di attenuazione: Controllo post-trascrizionale mediante ripiegamento differenziale dell mrna. Controllo dell inizio della trascrizione dell operone trp mediante il legame di un repressore, attivato dal legame con il triptofano, a siti operatori, con conseguente blocco dell accesso della RNA polimerasi al promotore trp.

52 Attenuazione trascrizionale del operone trp di E. coli

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54 Meccanismi d azione dei regolatori trascrizionali Legame cooperativo delle proteine al DNA: importante sia nei procarioti che negli eucarioti; es. della proteina CAP che ha un dominio di legame al DNA ed un dominio detto regione di attivazione che entra in contatto con la RNA polimerasi che si lega al promotore. Modificazioni allosteriche e legame al DNA: ci sono due esempi, 1) il legame del camp alla proteine CAP che induce un cambiamento allosterico in quest ultima per cui si lega più saldamente al DNA; 2) il legame dell allolattosio o dell IPTG alla proteina repressore dell operone lac che induce un cambiamento allosterico nel repressore che fa diminuire la sua capacità di legarsi al DNA. Formazione di anse da parte del DNA: la formazione di anse di DNA permette a proteine, anche distanti, legate sul DNA di interagire con la DNA polimerasi legata al promotore.

55 La trascrizione negli eucarioti e sua regolazione

56 Transcription Mechanisms in Eukaryotes In eukaryotes, there are three classes of RNA polymerases: I, II and III. This section will focus on the RNA polymerase II (Pol II), which is involved in the transcription of all protein genes. Structure of the human TBP core domain complexed with DNA as determined by x-ray crystallography. The DNA includes the TATA element. PDB ID = 1CDW.

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58 Formazione del complesso di preinizio ed inizio della trascrizione

59 Assembly of the Pre-Initiation Complex (PIC) TBP first binds to the promoter and then recruits TFIIB to join TFIID (and TFIIA if present). Before entering PIC, RNA Pol II and TFIIF are bound together, which are recruited by TFIIB. Finally, RNA Pol II recruits TFIIE, which further recruits TFIIH to complete the PIC assembly.

60 Struttura della RNA Pol II

61 General transcription factors associated with RNA Pol II in human cells.

62 Fosforilazione della RNA pol II

63 Attività elicasica di TFIIH

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66 Una regione contenente la TATA box promuove l inizio specifico della trascrizione in vitro

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68 Eukaryotes In eukaryotes, there is a significant difference between the transcription of protein genes and RNA genes. The most common promoter element in eukaryotic protein genes is the TATA box, located at -35 to -20. Its consensus sequence, TATAAA, is quite similar to the -10 region of the Sigma 70 recognition site. Another promoter element is called the initiator (Inr). It has the consensus sequence PyPyAN(T/A)PyPy, where Py denotes pyrimidine (C or T), N = any, and (T/A) means T or A. The base A at the third position is located at +1 (the transcriptional start site). TATA box and initiator are the core promoter elements. There are other elements often located within 200 bp of the transcriptional start site, such as CAAT box and GC box which may be referred to as promoter-proximal elements.

69 Eukaryotic promoter elements. The protein which interacts with the initiator and TATA box is known as the TATA-box binding protein (TBP), because the TATA box was discovered earlier than the initiator. TBP recognizes not only the core promoter of protein genes, but also RNA promoter. It is a subunit of the general transcription factor TFIID. In eukaryotes, transcription requires several different general transcription factors and, in most cases, the regulatory transcription factors.

70 Confronto fra un unità trascrizionale semplice ed una complessa della RNA pol II

71 I motivi del nucleo del promotore della RNA pol II

72 Promotore Posizione Fattore di trascizione Sequenza consenso Elementi a monte del nucleo del promotore BRE TATA Box Iniziatore -37 a a a +4 TFHB TBP TAF1 e TAF2 Elementi a valle del nucleo del promotore MTE DPE +18 a a + 32 TFIID Elementi prossimali del promotore TAF9 e TAF6 (G/C)(G/C)(G/A)CGCC TATA(A/T)AA(G/A) PyPyA +1 N(T/A)PyPy C(G/A)A(A/G)C(G/C) (C/A/G)AACG(G/C) (A/G)G(A/T)(C/T)(G/A/ C) CAAT box GC box -200 a a -70 CBF, NF1, C/EBP Sp1 CCAAT GGGCGG CBF: fattore che lega CAAT; C/EBP: proteina che lega CAAT/enhancer.

73 Initiation RNA Pol II does not contain a subunit similar to the prokaryotic factor, which can recognize the promoter and unwind the DNA double helix. In eukaryotes, these two functions are carried out by a set of proteins called general transcription factors. The RNA Pol II is associated with six general transcription factors, designated as TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH, where "TF" stands for "transcription factor" and "II" for the RNA Pol II. TFIID consists of TBP (TATA-box binding protein) and TAFs (TBP associated factors). The role of TBP is to bind the core promoter. TAFs may assist TBP in this process. In human cells, TAFs are formed by 12 subunits. One of them, TAF250 (with molecular weight 250 kd), has the histone acetyltransferase activity, which can relieve the binding between DNA and histones in the nucleosome. The transcription factor which catalyzes DNA melting is TFIIH. However, before TFIIH can unwind DNA, the RNA Pol II and at least five general transcription factors (TFIIA is not absolutely necessary) have to form a pre-initiation complex (PIC).

74 Regolazione della trascrizione negli eucarioti Concetto di elementi cis-agenti and trans-agenti del DNA e fattori trans-agenti. Fattori che intervengono nella regolazione della trascrizione negli eucarioti: Interazioni DNA-proteina; Interazioni proteina-proteina; Struttura della cromatina; Architettura del nucleo; Compartimentazione cellulare.

75 Il controllo dell espressione genica negli eucarioti può essere esercitato a molti livelli oltre che a livello trascrizionale.

76 Regolazione della trascrizione negli eucarioti La RNA polimerasi II è responsabile della trascrizione della grande maggioranza dei geni eucariotici: Geni codificanti per mrna; Geni codificanti per snorna; Geni codificanti per alcuni snrna; Geni codificanti per microrna. Negli eucarioti esistono altre due RNA polimerasi: RNA polimerasi I localizzata nel nucleolo responsabile della sintesi dell rrna grande; RNA polimerasi III si trova nel nucleoplasma ed è responsabile della sintesi dell trna, dell rrna 5S e di alcuni snrna.

77 Elementi regolatori dei geni codificanti proteine Fattori di trascrizione (attivatori o repressori) CREB, CTCF, FOG-1, GATA-1, NF-E2, NF- B, Sp1. Macchinario generale della trascrizione RNA pol II, TFIIB, TFIID (TBP + TAF), TFIIE, TFIIF, TFIIH, Mediatore. Coattivatori e corepressori complessi di modificazione della cromatina (HAT, HDAC, CBP, HMT, LSD1), complessi di rimodellamento della cromatina (SWI/SNF, ISWI, SWR1). Fattori di allungamento FACT, allungatore, TFIIS.

78 Elementi regolatori a lungo raggio Questi elementi degli eucarioti multicellulari comprendo: Enhancer; Silenziatori; Isolatori; Regioni di controllo del locus (LCR); Regioni di attacco alla matrice (MAR). Alcuni enhancer che sono negli introni contribuiscono all espressione tessuto-specifica enhancer nel secondo introne del gene dell apolipoproteina B (apob delle LDL).

79 Enhancer e silenziatori Questi elementi sono di solito a o più bp di distanza dal sito di inizio della trascrizione. Gli enhancer si possono trovare sia a monte che a valle del gene, o dentro un introne, e possono funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto al promotore. Un enhancer è lungo 500 bp e contiene 10 siti di legame per fattori di trascrizione diversi. I silenziatori sono elementi simili agli enhancer, ma reprimono l espressione del gene.

80 Tre caratteristiche cruciali di un elemento enhancer Enhancer e silenziatori: A distanza di o più bp dal sito di inizio Della trascrizione.

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83 Histone Acetylation Acetylation of the lysine residues at the N terminus of histone proteins removes positive charges, thereby reducing the affinity between histones and DNA. This makes RNA polymerase and transcription factors easier to access the promoter region. Therefore, in most cases, histone acetylation enhances transcription while histone deacetylation represses transcription. Acetylation and deacetylation of the lysine residue. Histone acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylation is catalyzed by histone deacetylases (denoted by HDs or HDACs). Several different forms of HATs and HDs have been identified. Among them, CBP/p300 is probably the most important, since it can interact with numerous transcription regulators.

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88 Isolatori Un isolatore è una sequenza di DNA, di solito lunga bp, che ha la funzione di: Marcatore di un confine di cromatina, tra regioni di eucromatina ed eterocromatina; Attività di blocco di un enhancer o di un silenziatore. Contiene un gruppo di siti di legame per proteine che legano sequenze specifiche di DNA.

89 Gli isolatori funzionano come marcatori dei confini della cromatina e hanno attività di blocco degli enhancer Isolatore HS4: sito ipersensibile alla digesione da DNAasi I. Gli elementi isolatori sono riconosciuti da almeno tre proteine diverse che legano il DNA: fattore che lega CCCTC (CTCF), fattori Di stimolazione a monte (USF) 1 e 1.

90 Regioni di controllo del locus (LCR) Le LCR sono sequenze di DNA che organizzano e mantengono un dominio funzionale di cromatina attiva e fanno aumentare la trascrizione dei geni a valle. Siti ipersensibili (HS) alla DNasi a monte del gruppo dei geni della -globina. Le LCR sono presenti in altri loci genici fra cui: i gruppi di geni che codificano le -globine, i pigmenti visivi, le proteine del complesso maggiore di istocompatibilità, gli ormoni della crescita umani, le serpine, le citochine delle cellule T helper di tipo 2.

91 Regione di controllo del locus (LCR): prototipo di LCR è stato caratterizzato come un gruppo di siti ipersensibili alla Dnasi I a monte del gruppo dei geni della β-globina. LCR per altri loci: Gruppi di geni codificanti le α-globine; Gruppi di geni codificanti i pigmenti visivi; Gruppi di geni codificanti le proteine del complesso maggiore di istocompatibilità; Gruppi di geni codificanti gli ormoni della crescita umani; Gruppi di geni codificanti le serpine; Gruppi di geni codificanti le citochine delle cellule T helper di tipo 2.

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93 Regioni di controllo del locus (LCR) L intero locus dei geni della -globina occupa 200 kb. La LCR è necessaria per la trascrizione ad alto livello di tutti i geni della famiglia della -globina. La regolazione della formazione di anse di cromatina è il meccanismo che controlla l espressione durante lo sviluppo dei geni della -globina. La LCR interagisce con un solo promotore genico alla volta, così da garantire l espressione differenziale dei diversi geni durante lo sviluppo.

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95 Regioni di attacco alla matrice (MAR) L organizzazione tridimensionale della cromatina ha anche un ruolo centrale nel controllo della trascrizione negli eucarioti. Organizzazione in anse indipendenti della cromatina. La formazione di queste anse dipende da elementi specifici di sequenza del DNA che sono sparsi in tutto il genoma ad intervalli di kb. Queste sequenze di DNA sono chiamate regioni di attacco alla matrice (MAR). Le MAR organizzano il genoma in anse di cromatina con una dimensione media di 70 kb.

96 Regioni di attacco alla matrice (MAR) I geni attivi tendono a far parte di domini ad ansa piccoli, mentre quelli inattivi sono associati a domini più grandi. Più del 70% delle MAR sono ricche di sequenze AT Le MAR si trovano vicino agli enhancers. Conferiscono specificità tissutale e controllo durante lo sviluppo dell espressione genica reclutando fattori di trascrizione e richiamando gli enzimi di rimodellamento della cromatina. MAR strutturali servono come ancore; MAR funzionali sono dinamiche e aiutano a portare i geni sulla matrice nucleare.

97 Modello della regolazione trascrizionale da parte delle regioni di attacco alla matrice (MAR)

98 I fattori di trascrizione La regolazione dell attività trascrizionale dei geni avviene mediante cambiamenti della quantità o dell attività dei fattori di trascrizione. Questi fattori influenzano la velocità di trascrizione dei geni target positivamente o negativamente tramite interazioni specifiche con gli elementi regolatori del DNA e tramite interazioni con altre proteine.

99 Meccanismi di regolazione della quantità e dell attività dei fattori di trascrizione

100 Meccanismi con cui agiscono fattori di trascrizione attivatori per aumentare l attività trascrizionale 1) Stimolazione del reclutamento e del legame dei fattori generali di trascrizione e della RNA pol II sul nucleo del promotore per formare un complesso di preinizio. 2) Induzione di un cambiamento conformazionale od di una modificazione post-traduzionale che stimola l attività enzimatica del macchinario generale di trascrizione. 3)Interazione con i complessi di rimodellamento e di modificazione della cromatina per permettere una migliore accessibilità dei fattori generali di trascrizione o di attivatori specifici al DNA.

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103 Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA Motivo elica-giro-elica (HTH) (es. repressore del trp, proteina CAP, repressore lac, ecc.) l omeodominio (60 amminoacidi) è una variante del motivo HTH classico che è presente in molti fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo (anche nei mammiferi).

104 Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA L omeodominio: un -elica contatta il solco maggiore del DNA riconoscendo una sequenza di 6 pb (come nel HTH), mentre un braccio flessibile interagisce specificamente con il solco minore del DNA.

105 Dominio a dito di Zn del recettore dei glucocorticoidi (GR) Motivo a dita di Zn

106 Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA Motivo a dita di zinco: deriva il nome dallo schema della sua struttura un atomo di Zn coordina dei residui di cisteine e di istidine, formando un ansa che ricorda la forma di un dito. Struttura diffusa in molte famiglie di attivatori trascrizionali (es. fattore Sp1, recettori degli ormoni steroidei).

107 Domini a cerniera di leucina Questo motivo è stato descritto per la prima volta nella proteina C/EBP che lega CAAT box presente in molti enhancer. Appartiene a questo gruppo di attivatori la proteina AP-1, un eterodimero formato dall unione di due protooncogeni c-jun e c-fos, che regola l espressione genica in risposta a vari stimoli, quali, stress, infezioni virali e batteriche, e l attivazione da parte delle citochine.

108 Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA Domini a cerniera lampo (leucine zipper): due lunghe strutture ad -elica che contengono, contemporaneamente, il dominio di dimerizzazione ed il dominio di legame al DNA. Queste strutture possono formare sia omodimeri che eterodimeri.

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110 Domini elica-ansa-elica basico (BHLH) E una struttura caratterizzata da due -eliche connesse da un ansa. I fattori con questo motivo sono in genere eterodimeri, formati da un elica più lunga che lega il DNA attraverso amminoacidi basici. Appartengono a questa famiglia molti attivatori che hanno un ruolo nello sviluppo, come Myo-D che svolge una funzione fondamentale nel differenziamento delle cellule muscolari. Un altro esempio è la proteina c- Myc, che è coinvolta nella trasformazione tumorale (linfoma di Burkitt).

111 Controllo combinatoriale della trascrizione Gli attivatori e gli inibitori sono coinvolti nella regolazione di numerosi geni. E la combinazione tra diversi attivatori ed inibitori che rende molto specifico il meccanismo di regolazione.

112 Sequenze di importazione ed esportazione nucleare Il traffico fra nucleo e citoplasma avviene attraverso i complessi dei posi nucleari (NPC). I fattori di trascrizione, sintetizzati nel citoplasma, devono attraversare questi pori per giungere nel nucleo. Le proteine sono indirizzate al nucleo da una sequenza amminoacidica specifica chiamata sequenza di localizzazione nucleare (NLS); ne esistono diverse, ma le più studiate sono le sequenze ricche di a.a basici (Arg e Lys). Per l uscita dal nucleo, le proteine devono anche avere una sequenza di esportazione nucleare (NES); le meglio caratterizzate sono le piccole sequenze idrofobiche ricche di Leu. Per il passaggio attraverso i pori le proteine con sequenze di localizzazione e/o esportazione, si avvalgono di una famiglia di recettori solubili, importine od esportine (carioferine).

113 Importazione nucleare regolata I recettori degli ormoni steroidei

114 Importazione nucleare regolata di NF- B

115 Risposta al camp e fattore CREB P-CREB si lega a siti sul DNA chiamati CRE (camp Response Element). CREB è strettamente correlato, sia per struttura che per funzione, a CREM (camp Response Element Modulator) ed a ATF-1 (Activating Transcription Factor-1).

116 DNA Methylation Methylation on the DNA's cytosine base is commonly used to repress transcription

117 Transcription of RNA Genes The products of RNA genes include rrna, trna and small RNA molecules. In the mammalian genome, the three rrna genes, 28S, 18S, and 5.8S, are clustered as a pre-rrna gene. which is transcribed by RNA polymerase I. trna, 5S rrna and the U6 snrna genes are transcribed by RNA polymerase III. Most snrna genes are transcribed by RNA polymerase II using the same mechanism as transcribing protein genes. Transcription by RNA Polymerase I RNA polymerase I is devoted to the synthesis of pre-rrna. Like RNA polymerase II, a pre-initiation complex (PIC) has to be formed before RNA polymerase I can exert its function. The PIC assembly for RNA polymerase I. The regulatory region of pre-rrna gene contains a core element and an upstream control element (UCE). Binding of two upstream binding factors (UBF) to both elements may induce DNA looping, and subsequently recruiting TATA-binding protein (TBP) and TBP-associated factors (TAFI). Finally, RNA polymerase I joins the complex and completes the assembly process.

118 Transcription by RNA Polymerase III Transcription of trna gene The regulatory region of trna gene contains A box and B box located inside the transcription unit. The PIC assembly begins with the binding of TFIIIC to both elements The PIC assembly for the transcription of trna gene.

119 Duplicated Genes Most proteins do not need duplicated genes, because the mrna molecule transcribed from one gene can be translated into many copies of its protein product. However, rrna and trna are the final gene products. In order to accelerate the production process, all species contain an array of tandemly repeated RNA genes. The number of repeats ranges from tens to 24,000. Number of RNA genes. *The X chromosome of fruit fly contains 250 copies of Pre-rRNAs, Y chromosome contains 150 copies.

120 Most proteins do not need duplicated genes, There are four types of rrna in mammalian cells: 28S, 5.8S, 5S and 18S. In the human genome, 28S, 5.8S and 18S are clustered together. They form a single transcription unit which will be separated by specific enzymes after transcription. " Pre-rRNA" refers to their precursor. In humans, a repeat unit for the pre-rrna has about 40 kb in length, including a 13-kb transcription unit and a 27-kb untranscribed spacer region. The transcription unit contains three spacers: ETS, ITS1 and ITS2. They will be removed during RNA processing.