LA DETERMINAZIONE CHIMICO-TOSSICOLOGICA DELLE SOSTANZE D'ABUSO

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Daniella Livia Bettini
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1 LA DETERMINAZIONE CHIMICO-TOSSICOLOGICA Maria Augusta Raggi Laboratorio di Analisi Farmaco-Tossicologica Facoltà di Farmacia, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche Università di Bologna Meeting Scientifico LUCE OLTRE LA SIEPE Droghe Alcool Incidenti stradali Come prevenirli? 24 Aprile 2009 Oratorio di S. Filippo Neri Bologna

2 Dipartimento di Pubblica Sicurezza del Ministero dell Interno: 500 morti in un anno raddoppio dei sequestri di Cannabis crescita di quelli di Cocaina

3 ! CONSUMATORI DI CANNABIS è la droga più consumata 166 milioni nel mondo 71 milioni in Europa! AUMENTO DEL CONSUMO! IN ITALIA + 5% nel mondo ( ) + 3% in Europa ( ) prevalenza del consumo nel 2007: 14% consumatori di Cannabis: +45% dal 2005

4 Gli incidenti stradali sono in costante aumento, così come il numero di casi di persone trovate alla guida in stato di ebbrezza o sotto l effetto l di droghe

6 COME PREVENIRE E CONTRASTARE QUESTO FENOMENO? 1) Formazione dei giovani sugli effetti tossici delle droghe 2) Miglioramento delle analisi di sostanze stupefacenti in fluidi biologici Devono essere sviluppati metodi analitici precisi ed accurati, sensibili e selettivi Identificazione delle sostanze assunte Quantificazione delle sostanze assunte Affidabilità analitica

8 Sviluppo di nuovi metodi per una determinazione accurata e selettiva di sostanze d abusod in vari materiali biologici Importante topic dell'attività di ricerca del Laboratorio di Analisi Farmaco-Tossicologica Facoltà di Farmacia - Dipartimento di Scienze Farmaceutiche Università di Bologna

10 COCAINA (metilestere dell acido 3-(benzoilossi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]ottan-2-carbossilico) H 3 C Benzoilmetilecgonina N O CH 3 O Alcaloide del tropano estratto dalle foglie di Erythroxylon coca, pianta originaria del Sud America oppure per sintesi dall'ecgonina O COC O

11 PRINCIPALI EFFETTI Sensazione di benessere Iperattività Euforia Irrequietezza Aumento della pressione sanguigna Aumento del battito cardiaco ABUSO Allucinazioni Deliri paranoici Tachicardia Tachiaritmia Convulsioni EFFETTI COLLATERALI Spasmi Paranoia Impotenza MORTE Insufficienza respiratoria Ictus Emorragia cerebrale Insufficienza cardiaca

12 DIPENDENZA La Cocaina causa forte dipendenza psichica: dopo gli effetti eccitatori, il consumatore si sente spossato, stanco e senza energie Nuova assunzione per tornare a stare bene La dipendenza ha anche un substrato fisico legato al neuroadattamento del sistema nervoso centrale La Cocaina si distingue da altre sostanze psicotrope per l'elevato effetto di adattamento che induce ai ritmi di attività psico-fisica tipici della società post-industriale

13 METODO DI ASSUNZIONE Masticazione delle foglie Assunzione mediante il fumo di sigarette Inalazione dei vapori Iniezione endovenosa Il più frequente è l insufflazione: inalata come polvere, la cocaina è assorbita attraverso le mucose nasali. Ogni dose contiene circa mg di Cocaina METABOLISMO Avviene a livello epatico (CYP3A4) e porta alla formazione di Benzoilecgonina, il principale metabolita, Metilecgonina ed Ecgonina

14 Metodo HPLC con detector spettrofluorimetrico per l analisi di Cocaina nei capelli di presunti consumatori CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Fase stazionaria: colonna Synergi Hydro-RP C18 Fase mobile: tampone fosfato/mecn/meoh (75/15/10) Velocità di flusso: 1.2 ml/min Loop: 50!L! ecc : 230 nm! em : 315 nm Tempi d analisi ridotti (8 minuti)

15 ANALISI DI SOLUZIONI STANDARD COC: t R = 7.5 min 50 ng/ml (5 ng/mg di capelli)

16 PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE BIOLOGICO INCUBAZIONE ESTRATTIVA: 5 mg di frammenti di capelli Aggiunta di 1 ml di HCl 0.1 M Incubazione in stufa per 18 h a 45 C Aggiunta di 1 ml tampone fosfato (ph 6) Aggiunta di 50!L di NaOH 2 M Centrifugazione Prelievo del surnatante ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE) Cartucce: C2 Caricamento: 500 µl di campione Lavaggio: 2 ml H 2 O 1 ml H 2 O/ CH 3 OH (80/20) 50!L CH 3 OH Eluizione: 1 ml CH 3 OH Essiccamento al rotavapor e ridissoluzione con 125!L di fase mobile

17 APPLICAZIONE A CAMPIONI BIANCHI DI CAPELLI COC: t R = 7.5 min 5 ng/mg di capelli (50 ng/ml) LINEARITÀ Range: ng/mg r 2 : LOD: 0.1 ng/mg LOQ: 0.3 ng/mg PRECISIONE INTRADAY RSD < 5.3% PRECISIONE INTERDAY RSD < 6.2% RESA D ESTRAZIONE > 89%

18 ANALISI DI UN CAMPIONE (5 mg) DI CAPELLI DI UN CONSUMATORE DI COCAINA CONCENTRAZIONE TROVATA 1.7 ng/mg di capelli ACCURATEZZA Recupero > 89%

19 SELETTIVITÀ CLASSE COMPOSTO t R (min) SOSTANZE D ABUSO SOSTANZE D'ABUSO ANTIDEPRESSIVI ANTIPSICOTICI SEDATIVO - IPNOTICI Amfetamina, Buprenorfina, LSD, Metadone, Morfina, " 9 -THC MDMA Citalopram, N-demetilcitalopram, N,N-didemetilcitalopram, Fluoxetina, Norfluoxetine, Paroxetina Amisulpride, Aripiprazolo, Clozapina, Aloperidolo, Risperidone, Ziprasidone Clonazepam, Delorazepam Diazepam, Flurazepam, Lorazepam 3.6

20 CONCLUSIONI Il metodo analitico sviluppato: è sensibile (LOQ = 0.3 ng/mg) è selettivo (no interferenze da farmaci SNC e droghe d abuso) dà buone rese d estrazione (> 89%) è preciso (RSD < 5.3%) è accurato (recupero > 89%) Adatto alla determinazione di Cocaina in piccole quantità di capelli

21 WORK IN PROGRESS Determinazione di Cocaina in differenti matrici biologiche:! plasma! urine! saliva

23 CANNABINOIDI (derivati attivi della Cannabis sativa) Principali preparati: " 9 -Tetraidrocannabinolo (" 9 -THC) MARIJUANA Miscela costituita da varie parti essiccate e triturate della pianta HASHISH Resina estratta dalle sommità fiorite della pianta cannabinoide farmacologicamente più attivo Assorbimento ottimale per via inalatoria Assunzione attraverso il fumo di sigarette

24 H 3 C HO CH 3 H Dose usuale (consumo medio): " 9 -THC mg Metabolismo epatico O H H 3 C CH 3 " 9 -THC Dose tossica: " 9 -THC > mg/die HOOC HO CH 3 H O H acido 11-nor-" 9 - THC-9-carbossilico (THC-COOH) H 3 C CH 3 Livelli urinari: THC-COOH ng/ml " 9 -THC 2-20 ng/ml

25 PRINCIPALI EFFETTI - 1! stato euforico (associato a loquacità, allegria, allucinazioni piacevoli)! senso di benessere psicofisico (senso di leggerezza e di abbandono)! aumento dell appetito! stimolo dell attività intellettuale

26 PRINCIPALI EFFETTI - 2 Effetti collaterali a breve termine:! problemi di memoria e apprendimento! distorta percezione (vista, udito, tempo, tatto)! difficoltà di concentrazione! mancanza di coordinazione motoria! aumentata frequenza cardiaca Effetti collaterali nei consumatori cronici:! ansia ed aggressività! orofaringiti, bronchiti ed asma! diminuita pressione arteriosa! stati confusionali (fino al delirio) Dipendenza in alcuni soggetti l utilizzo a lungo termine può portare a dipendenza psicologica

27 Metodo cromatografico per la determinazione di " 9 -THC e THC-COOH in urine e plasma CROMATOGRAMMA DI UNA SOLUZIONE STANDARD DI " 9 -THC E THC-COOH Rivelazione a 220 nm Fase stazionaria: colonna C8 Fase mobile: tamp. fosf. ph 2.7/AcCN (35/65) Gradiente di flusso: ( ml/min) ANALITI SEPARATI, PICCHI SIMMETRICI corsa cromatografica breve (meno di 11 minuti) THC-COOH t R = 5.4 min 800 ng/ml " 9 -THC t R = 10.8 min 400 ng/ml

28 PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE BIOLOGICO 1 - IDROLISI BASICA:500!L di urine + 50!L di KOH 10 M + 50!L di SI a T = 70 C per 45 min 60!L di ac.acetico glaciale + 500!L di ac.fosforico 50 mm

29 2 - ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE) CARTUCCE: C8 (100 mg, 1 ml) CONDIZIONAMENTO: 5 x 1 ml MeOH 5 x 1 ml H 2 O CARICAMENTO: 500!L idrolizzato finale o plasma LAVAGGIO: 2 x 1 ml tamp.fosf. ph ml miscela tamp. fosf ph 2.7 / MeOH (80/20) 100!L MeOH ELUIZIONE: 1 ml MeOH INIETTARE IN HPLC

30 ANALISI DI CAMPIONE DI URINA Consumatore di Cannabis LIVELLI URINARI TROVATI: 175 ng/ml THC-COOH 78 ng/ml " 9 -THC

31 ANALISI DI CAMPIONE DI PLASMA Consumatore di Cannabis LIVELLI PLASMATICI TROVATI: 180 ng/ml THC-COOH 68 ng/ml " 9 -THC

32 Classe terapeutica Composto t R (min) Antidepressivi Sedativo-ipnotici Sostanze d abuso SELETTIVITÀ Amitriptilina Citalopram Fluoxetina Imipramina Mirtazapina Sertralina Venlafaxina Brotizolam Clobazam Clonazepam Diazepam Flurazepam Lorazepam Amfetamina Buprenorfina Codeina MDMA (Ecstasy) Metadone Morfina

33 CONCLUSIONI Il metodo analitico sviluppato: è sensibile (LOQ = 1 ng/ml per " 9 -THC, 0.5 ng/ml per THC-COOH) è selettivo dà ottime rese d estrazione (>91%) è preciso (RSD <6.6%) è accurato (recupero >92%) Risulta idoneo alla determinazione di " 9 -THC e THC-COOH in urine e plasma

34 WORK IN PROGRESS Determinazione di Cannabinoidi in matrici biologiche alternative a plasma ed urine:! capelli! saliva

36 THANKS! Laboratorio di Analisi Farmaco-Tossicologica: Responsabile Prof. Maria Augusta Raggi Dott. Roberto Mandrioli Dott. Francesca Bugamelli Dott. Maria Addolorata Saracino Dott. Laura Mercolini Dott. Chiara Marcheselli Si desidera ringraziare la Fondazione del Monte di Bologna e Ravenna per aver concesso, nell anno 2007, grants che hanno permesso di svolgere ricerche scientifiche nel campo delle analisi tossicologiche di sostanze psicotrope (gruppo Prof. Maria Augusta Raggi) e nel campo della prevenzione degli incidenti stradali (gruppo Prof. Domenico Vasapollo)

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