Protocollo di campionamento

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1 Progetto pilota per la sorveglianza della mortalità delle colonie di api Italia Protocollo di campionamento

2 Le buone pratiche di campionamento Il prelievo dei campioni: i campioni vengono effettuati per: valutare il tasso di infestazione delle api da V. destructor. Ma anche per confermare l eventuale sospetto clinico di: Varroa destructor, AFB, EFB, nosemiasi, paralisi cronica, Aethina tumida e Tropilaelaps E fondamentale la corretta identificazione, conservazione e spedizione dei campioni ai lab. IZS E anche importante capire le ragioni per le quali i campioni sono eventualmente respinti dal laboratorio

3 Indice 1. Le matrici da campionare 2. Localizzazione del campione nella visita 3. Come effettuare il campionamento 4. Come conservare appropriatamente i campioni 5. Come spedire il materiale campionato al laboratorio IZS

4 1. Le matrici da campionare In base al periodo dell anno (ed al numero della visita) vanno campionate diverse matrici

5 In tutte le visite (al fine di rilevarne la prevalenza) Realizzare campionamenti sulle matrici in cui sono rinvenibili sintomi: A carico della covata: Varroatosi Peste americana Peste europea A carico delle api adulte: Varroatosi Paralisi cronica Nosemiasi A carico della covata e/o all interno del nido: Aethina tumida (Piccolo coleottero dell alveare) Tropilaelaps spp.

6 Obiettivi specifici delle diverse visite in apiario 1. In autunno 2012: Determinazione del tasso di infestazione da varroa per apiario; determinazione dei livelli di infezione da ABPV e DWV 2. Primavera 2013 (prima del nomadismo): Determinazione del tasso di mortalità invernale degli alveari 3. Estate 2013 (durante la stagione attiva): Determinazione del tasso di mortalità stagionale degli alveari

7 La qualità dei risultati analitici dipende dalla: capacità diagnostica della visita degli alveari e buone prassi igieniche di campionamento

8 Le matrici da campionare Api adulte e covata

9 Prima della visita Assicurarsi che si abbia a disposizione tutto il materiale per realizzare i campionamenti Preparare «pronto all uso» (es.: numerazione dei contenitori) il materiale per i campionamenti, soprattutto in caso di campionamenti programmati (es.: tasso di infestazione della varroa). Questo velocizza e rende più efficaci le visite (a volte le condizioni climatiche quali vento o pioggia rallentano le operazioni).

10 Le visite in apiario: aspetti pratici (1) 1. Spiegare prima all apicoltore gli obiettivi e la tempistica del piano; 2. utilizzare la modulistica prevista per la raccolta dei dati generali sull apiario; 3. effettuare la visita esterna generale dell apiario; 4. selezionare in maniera casuale il numero di colonie prefissate secondo l entità dell apiario e la tabella relativa alla prevalenza attesa (20%). Nota: al fine di evitare distorsioni statistiche, non scegliereglialvearimortieventualmente presenti in apiario; inserire invece le eventuali colonie deboli che vengono casualmente selezionate;

11 Le visite in apiario: aspetti pratici (2) 5. identificare gli alveari selezionati; 6. visitare prima solo dall esterno e poi anche aprendoli, tutti gli alveari selezionati; 7. effettuare i campionamenti previsti (programmati o da realizzare per la conferma di sospetti clinici). 8. E opportuno che nella fase di campionamento ci siano 2 persone: una persona dedicata al campionamento delle api e della covata; una persona dedicata alla preparazione ed alla identificazione dei contenitori con le diverse matrici.

12 Visita esterna degli alveari (1) Si effettua prima di procedere alla apertura degli alveari Nello specifico si verifica: 1. lo stato del predellino; 2. il tetto degli alveari; 3. le zone immediatamente vicine all alveare (es. sotto la porticina di volo/a terra davanti all alveare)

13 Visita esterna degli alveari (2) Cosa verificare: 1) Ci sono api morte? 2) Le api presentano comportamenti anomali? 3) Le api presentano anomalie morfologiche 4) Sono presenti segni di diarrea? 5) Sono presenti api striscianti o appese a fili d erba? nota: l allontanamento dei fuchi dal nido è normale in estate! Se vi sono api con sintomi clinici: campionare 20 api Se vi sono api morte (senza sintomi clinici): campionare 60 api morte

14 Visita esterna degli alveari (3) Prima di iniziare la visita degli alveari, analizzare: L attività di volo di ogni alveare; Se sono presenti api morte o incapaci di volare Lo stato del predellino

15 Stato del predellino Presenzadi barba presenza di api incapaci di volare espulsione di api morte (covata calcificata) predellino affollato Micosi Barbe

16 Segni di paralisi cronica riconoscibili a livello del predellino di volo Espulsione/mancata accettazione Aggressività Tremolio Api annerite Api morte davanti all alveare

17 Errore: valutare il predellino di volo dopo l ispezione interna dell alveare

18 Mortalità di api adulte fuori dall alveare (1) E necessario quantificare il fenomeno

19 Mortalità di api adulte fuori dall alveare (2) Considerare la visibilità delle api morte in funzione della superficie del terreno su cui si trovano

20 Mortalità di api adulte all interno dell alveare

21 Campioni di api sintomatiche o morte Campionamento di api vive prelevare api sane solo in caso di campionamento sistematico (es. tasso varroa) ; prelevare api con sintomi di malattia (20 api). Campionamento di api morte (60 api) in assenza o in caso di scarsità di api sintomatiche (<20) evitare il campionamento di api putrefatte (morte da più di una settimana) Non mescolare api vive malate con api morte

22 Api vive malate (o morte) Tipo di campione da effettuare: Api vive sintomatiche (se possibile esterne) Morte (NB: che non siano secche o decomposte) NB: Separare le api morte dalle api vive malate; campionare almeno 20 api per tipo di campione

23 Dove mettere le api campionate Come prelevare il campione di api? usando pinze/mano Prendere le api una ad una: minimo di 30 api Richiede tempo, ma è affidabile Le api campionate vanno in piccoli contenitori di plastica: Tipo contenitori per urine (40 ml) Evitare di schiacciare le api

24 Modulo di campionamento api sintomatiche

25 Visita interna degli alveari Osservare il predellino di volo Osservare le api all apertura dell alveare; Osservare tutti i favi contenenti covata: tirarli fuori dall alveare per ispezionarli e per rilevare la presenza di potenziali sintomi, sia a carico della covata che delle api adulte Compilare il modulo specifico In presenza di sintomatologia: eseguire il campionamento (Api e/o covata e/o parassiti sospetti)

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27 Covata malata Campionamento della covata: prelevare un pezzo di covata di 10 x10 cm con almeno 15 larve e/o pupe di aspetto patologico che motivano la richiesta di analisi di laboratorio

28 Campionamento di singole larve o pupe malate: Prelevare larve e/o pupe con sintomi di malattia, (esempio: scaglie di peste, larve torte, ingiallite, di colore bruno, etc.) NB: Per ogni sospetto di malattia, eseguire campionamenti separati (es. AFB, EFB ) ed elencare il sospetto clinico nella scheda d ispezione

29 Covata malata Preparazione del campione da inviare Porzione di favo di covata: Scatola di plastica o cartone come involucro esterno All interno: busta presto/chiusa Kraft (per il congelatore) Non usare buste di plastica, attenzione a non schiacciare il contenuto Larve o pupe singole con sintomatologia patologica provetta Eppendorf da 1.5 ml campionamento con spatola monouso Contenitore in plastica da 40 ml in cui mettere le provette Eppendorf. Tutti i campioni vanno correttamente identificati.

30 Campionamento del favo di covata

31 Campionamento di singole larve/pupe per peste

32 Campionamento per peste

33 Campionamento per peste

34 Campionamento per peste

35 Scheda di campionamento covata malata

36 Parassiti sospetti campioni di: coleotteri adulti, larve o uova sospette acari diversi da Varroa destructor

37 Larve Coleotteri adulti Acari diversi da varroa

38 Parassiti sospetti Come campionarli: con pinze o con le dita Come conservarli per il trasporto: in soluzione alcolica (99%) in Provette Eppendorf

39 Scheda di ispezione parassiti sospetti

40 Solo nella 1 a visita (autunno 2012) alla fine della visita di ogni alveare, prelevare un campione di 300 api interne al nido (c.d. «campionamento sistematico» od «ordinario»). Per valutare: Infestazione da varroa Infestazione da DWV e ABPV (caso controllo) NB: prima di eseguire il campione, verificare, con l aiuto dell apicoltore, che sia presente la regina

41 Campionamento «sistematico» od «ordinario» di api Come eseguire il campione? Utilizzando il «metodo del vasetto»: un contenitore di plastica da 180 ml (barattolo per le urine) riempito completamente di api Oppure Utilizzare il «metodo della busta»: una busta prestochiusa od una grande busta di plastica per il congelatore (tipo Kraft), in cui graffetteremo poi gli angoli per chiuderla

42 In pratica Eseguire un campione di 300 api adulte/alveare: dopo aver controllato che non ci sia la regina* Spazzolare/scuotere un telaino del nido in un contenitore 300 api = circa 100 ml segna il volume corrispondente sul contenitore del campione Nel caso della busta è possibile scrollare le api dal telaino già nella busta NB: Graffettare gli angoli della busta: le api non devono uscire Lee, 2010 *Campionare la regina in questa stagione comporterà il mancato superamento dell inverno dell alveare

43 Campionamento «sistematico» od «ordinario»di api adulte

44 Altra opzione Metodo del cappello

45 Campione di 300 api dall interno Il campione di api può essere prelevato da favi periferici e/o da altri favi dell alveare Verificare, con l apicoltore, che non ci sia la regina In laboratorio: Tenere da parte 60 api congelate per lo studio casocontrollo che si dovrà fare (eventualmente) in primavera Utilizzare le restanti api per calcolare il livello di infestazione da Varroa: 1) contare le api; 2) mescolare con una soluzione in grado di staccare le varroe; 3) contare le varroe; 4) esprimere il livello di infestazione come n varroe su 100 api.

46 La identificazione dei campioni 1. Assegnare ad ogni apiario un numero 2. Dare un codice alla visita in apiario: A12 (Autunno 2012); P13; E Identificare con n progressivo gli alveari 4. Abbreviare le diverse matrici campionate Api = HB; Covata= BR; Parassita = PAR 5. Indicare il numero di matrici inviate al laboratorio Numero dell apicoltore / A12 (Autunno 2012) / Numero della colonia / Matrice + Numero (= 1, 2,3 ) Numero individuale dell apiario/a12/n della colonia/matrice+numero Es: Per il primo campione di api prelevate dalla colonia numero 7 del primo apiario durante la prima ispezione (autunno 2012): /A12/107/HB1

47 Igiene Nelle visite in apiario indossare sempre una tuta pulita Utilizzare guanti monouso o cambiare guanti dopo ogni ispezione di colonie malate (es. Peste americana/peste europea) Portare in apiario un disinfettante in cui immergere le leve (es. varechina) o comunque flambarle dopo ogni ispezione di colonie malate (es. Peste americana/peste europea) Usare materiale usa e getta pulito per l invio dei campioni

48 Igiene Usare materiale mono uso, nei limiti del possibile es.: spatola di plastica per prelevare covata malata/morta, bisturi monouso per tagliare il favo In caso di materiale multi uso (es.: pinzetta) Disinfettarla quando passi da una colonia ad un altra e dopo ogni visita Disinfetta gli strumenti utilizzati nell alveare (es. Leva) con la fiamma, soprattutto dopo l ispezione di una colonia ammalata

49 Sicurezza Le ispezioni possono essere effettuate in condizioni meteo svantaggiose per le famiglie Effettuare quindi ispezioni veloci (ma accurate e complete!) per evitare di compromettere la sopravvivenza della colonia Attenzione alla regina! I favi devono essere manipolati dall apicoltore ed esaminati dal medico veterinario Prima di eseguire qualsiasi campionamento l apicoltore dovrà verificare che non sia presente l ape regina

50 CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

51 Conservazione del campione fino alla consegna al laboratorio: precauzioni per garantire la qualità dei risultati In base alle indicazioni del laboratorio: 1. Conservazione mediante il freddo Sul campo refrigerare I campioni mediante: borsa frigo portatile confezioni di ghiaccio Mettere poi i campioni a 20 C 2. Conservazione mediante etanolo In ogni caso, evitare : Schiacciamento Macerazione/putrefazione dei campioni

52 SPEDIZIONE DEL CAMPIONE AL LABORATORIO

53 Spedizione del campione al laboratorio Nel caso della conservazione mediante la catena del freddo: Nel veicolo Congelamento: il transporto refrigerato non garantisce la corretta conservazione del campione congelato Le siberine non sono sufficienti una volta che i campioni sono stati congelati trasportare i campioni in una borsa frigo con ghiaccio secco per mantenerli a temperatura adeguata catena a freddo Non va interrotta Se i campioni sono congelati, devono rimanere congelati fino all analisi Trasporto Rapido: non inviate i campioni prima del weekend, prima di un giorno di festa o di uno sciopero programmato In ogni caso: Allegare al campione una copia delle schede di visita e campionamento

54 In caso di sospetto di malattia soggetta a denuncia o di parassiti esotici Allertare le autorità competenti ed il Laboratorio di referenza nazionale Spedire con urgenza al laboratorio i campioni con i parassiti sospetti Coleottero sospetto Larva sospetta Acaro diverso dalla varroa

55 Conclusioni La qualità del campione è fondamentale per garantire la qualità dei risultati analitici Ma serve anche un po di flessibilità per adattarsiagliostacoli/vincolideterminatidalle condizioni di campo

56 Grazie per l attenzione eurl.bee@anses.fr