Metodiche analitiche. Anna Maria Eleuteri

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1 Metodiche analitiche per la rilevazione i di mutazioni i Anna Maria Eleuteri

2 Analisi del DNA dopo PCR Analisi dei prodotti di amplificazione - Elettroforesi su gel di agarosio Metodi per lo studio di mutazioni note - Digestione con enzimi di restrizione (RFLP) - Amplificazione i allele-specifica l (ARMS) - Ibridazione con oligonucleotidi allele specifici Metodi per lo screening di mutazioni ignote - Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) - Analisi dell eteroduplex -DHPLC

3 Elettroforesi su gel d agarosio Principio Le molecole di DNA sono cariche negativamente e migrano in un campo elettrico verso il polo positivo con velocità inversamente proporzionali alle loro dimensioni (in paia di basi= pb). Concentrazione one di agarosio o ( %) Viene scelta in funzione della grandezza delle molecole da separare: alte concentrazioni sono utilizzate per piccoli frammenti di DNA e viceversa. Visualizzazione bande Mediante etidio bromuro (intercalante degli a. nucleici, emette fluorescenza arancio-rossa rossa quando illuminato con luce ultravioletta). Valutazione risultati La grandezza dei frammenti di DNA viene valutata t per confronto con marker di dimensione nota (frammenti di DNA con pb note) che vengono fatti correre sullo stesso gel.

4 Elettroforesi su gel d agarosio Amplificati Condizioni i i sperimentali 1-3: 143 pb Gel: 2% agarosio 4-5: 375 pb Tampone: tris, EDTA, borato, ph : 2000 pb 100 V, 30 min Colorazione: etidio bromuro

5 Digestione con enzimi di restrizione RFLP - Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi di origine batterica in grado di riconoscere specifiche sequenze di 4-8 nucleotidi e di tagliare in quelle posizioni il DNA. Mutazioni che aboliscono un sito di taglio Mutazioni che creano un nuovo sito di taglio - Mutazioni che modificano un sito di restrizione possono essere riconosciute direttamente mediante elettroforesi dopo digestione con l enzima di restrizione i appropriato.

6 Digestione con enzimi di restrizione RFLP Amplificazione DNA (PCR) Digestione dell amplificato con enzima di restrizione creazione /abolizione sito di taglio frammentazione anomala Elettroforesi su gel di agarosio colorazione con etidio bromuro Pattern di frammenti caratteristici creazione sito di taglio: + 1 banda abolizione sito di taglio: - 1 banda

7 Digestione con enzimi di restrizione RFLP

8 Digestione con enzimi di restrizione RFLP

9 Amplificazione allele-specifica PCR-ARMS ( ARMS (Amplification Refractory Mutation System) - Prevede una reazione polimerasica a catena in cui uno dei due primer è costruito in modo che il nucleotide in posizione 3 sia complementare alla sequenza mutata del gene o a quella normale. Il DNA non viene amplificato quando si usa il primer non perfettamente complementare alla sequenza in esame, poiché la Taq polimerasi non riesce ad esplicare l estensione del primer. A: primer normale B: primer mutato Normale: amplificato solo con A Mutato omo: amplificato solo con B Mutato etero: amplificato con A e B - La presenza degli amplificati viene evidenziata mediante elettroforesi su gel di agarosio e colorazione con bromuro di etidio.

10 Amplificazione allele-specifica ARMS Esempio di diagnosi mediante ARMS DNA amplificato con primers mutati per la mutazione β-talassemica IVS 1 che generano un frammento di amplificazione di 407 pb 407pb La comparsa della banda di amplificazione a 407 pb indica la positività per la mutazione. C = frammento di controllo che indica il buon funzionamento della reazione.

11 Ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici ASO probe - La presenza di una mutazione viene riconosciuta facendo reagire il DNA amplificato con sonde oligonucleotidiche complementari alla sequenza mutata o normale (separatamente). - Solo in presenza del 100% di complementarietà tra le sequenze si avrà l ibridazione della sonda con il DNA. - Le sonde sono, in genere, 15-17omeri, con un contenuto in GC del 30-50% ed il nucleotide discriminante localizzato nel mezzo. La tecnica viene realizzata mediante: 1. Dot blot 2. Reverse dot dt blt blot

12 1. Dot blot Amplificazione DNA Denaturazione n Immobilizzazione DNA su filtro + nylon/cellulosa Oligonucleotidi di sintesi marcati ( 32 P, biotina) complementari sequenza normale e mutata Ibridazione con la sequenza complementare di DNA Esposizione filtro a lastra radiografica Autoradiografia Se la reazione di ibridazione è avvenuta si avrà la comparsa di una macchia 1 macchia con oligo mutato: t omozigote per la mutazione 1 macchia con oligo normale: normale 2 macchie con oligo normale e mutato: eterozigote per la mutazione

13 1. Dot blot Amplificazione Dot blot Ibridazione con sonda 1. Isolamento 2. Marcatura Rilevazione

14 2. Reverse dot blot (RDB) Esempio di test per la rilevazione di mutazioni del gene CFTR

15 Single strand conformation polymorphism (SSCP) E basato sulla differenza di mobilità elettroforetica tra DNA mutato a singolo filamento rispetto a quello non mutato

16 Single strand conformation polymorphism (SSCP) - Le mobilità elettroforetiche delle specie di DNA a singolo filamento sono funzione della loro conformazione tridimensionale. - La conformazione è determinata dall appaiamento intra-filamento termodinamicamente più favorito - Questa è direttamente correlata alla sequenza primaria - Se due frammenti di DNA differiscono in sequenza assumeranno conformazioni differenti - differente mobilità elettroforetica

17 Single strand conformation polymorphism (SSCP) Per prevenire il reannealing dei due filamenti singoli, la concentrazione di DNA nel tampone di caricamento viene mantenuta molto bassa. Per visualizzare le bande si ricorre alla marcatura radioattiva del DNA. In alternativa il silver staining assicura adeguata sensibilità ed è sempre più utilizzato. La sensibilità è influenzata da molti fattori: - il tipo di sostituzione - il contenuto in G+C -la posizione on della mutazione in relazione alle estremità tà del frammento - la lunghezza del frammento esaminato E stato dimostrato un effetto pronunciato della lunghezza del frammento sulla sensibilità: - con frammenti di lunghezza intorno a bp, la sensibilità è di circa il 100%. - considerando lunghezze intorno a 500 bp, la sensibilità si abbassa a circa il 50%.

18 Single strand conformation polymorphism (SSCP) Analisi SSCP dell esone 8 del gene p53 da quattro linee cellulari di carcinoma mammario. Corsia 1: controllo wild-type Corsia 2: cellule MDA-MB-231 Corsia 3: cellule MDA-MB-468 Corsia 4: cellule Bt-474 Corsia 5: cellule SkBr3. Le linee cellulari nelle corsie 2-4 contengono mutazioni nell esone 8 risultanti ti in migrazioni i i aberranti dei prodotti di PCR

19 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) E basata sul differente comportamento di denaturazione del DNA mutato rispetto a quello normale. Presenza di una mutazione Alterazione delle caratteristiche di denaturazione del dsdna Di bilità l tt f ti Diversa mobilità elettroforetica su gel denaturante

20 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Principio del metodo: la DENATURAZIONE del DNA, sia con calore che con denaturanti (ioni idrossido, urea o formamide) non avviene in un unico step il DNA denatura in domini i Aumento di T o [denaturante]: la regione o dominio con il più alto contenuto in A+T denaturerà Ulteriore aumento di T o [denaturante]: il dominio con un contenuto in A+T più alto del precedente denaturerà Il processo va avanti fino a quando la regione con il più alto contenuto in G+C denaturerà ed il DNA sarà completamente a singolo filamento.

21 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) L identità dei domini di denaturazione è in funzione della sequenza Una mutazione cambierà il profilo di denaturazione

22 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) -A basse concentrazioni di denaturante il DNA migra come molecola a doppia elica in funzione delle sue dimensioni. - Raggiunta la zona del gel a concentrazione di denaturante uguale al suo punto di denaturazione (Tm), il DNA assume una conformazione ramificata (parziale apertura della doppia elica) e rallenta la sua velocità di migrazione. - La presenza di una mutazione può alterare il Tm del frammento di DNA e di conseguenza la sua mobilità. La variazione nella Tm può essere valutata su gel con gradiente di La ar az on n a m può ss r a utata su g con gra nt denaturante.

23 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Amplificazione del DNA (PCR) Elettroforesi su gel di acrilammide denaturante gradiente di urea/formamide Il DNA mutato t ha caratteristiche ti di denaturazione differenti rispetto al normale e può essere distinto sulla base della sua diversa mobilità Analisi di mutazioni a carico degli esoni 13 e 11 del gene CFTR. Corsie 1, 2, 4, 5: DNA wild type Corsia 3: eterozigosi per la mutazione E822X Corsia 6: eterozigosi per la mutazione G542X

24 Formazione di molecole eteroduplici Viene effettuata per aumentare il potere di risoluzione della DGGE quando la migrazione del DNA mutato è simile a quello del normale. L amplificato viene denaturato e poi sottoposto ad un lento processo di riappaiamento. Queste condizioni i i favoriscono la formazione di eteroduplici. i Molecole omoduplici Dovute all appaiamento tra i due filamenti normali e tra i due filamenti mutati Molecole eteroduplici Dovute all appaiamento di un filamento normale con uno mutato Normale od omozigote: formazione di un unica molecola omoduplex Eterozigote: formazione di 4 molecole 2 omoduplex (riappaiamento i dei 2 filamenti normali e mutati) ti) 2 eteroduplex (formati dalle due combinazioni possibili tra due filamenti normali e due mutati)

25 Formazione di molecole eteroduplici Nell analisi degli eteroduplex, le mutazioni vengono rilevate grazie alle perturbazioni strutturali indotte dalla presenza di mismatch nel duplex di DNA.

26 Formazione di molecole eteroduplici AA: normale Aa: eterozigote per la mutazione aa: omozigote Gli eteroduplex migrano sempre più lentamente dei corrispondenti omoduplex in quanto il misappaiamento in essi contenuto determina un effetto destabilizzante nella molecola che si aprirà più facilmente qualora sottoposta a denaturazione Urea bassa conc. Urea alta conc.

27 HPLC in fase inversa (RP-HPLC) E basato sul principio p della ripartizione in fase inversa e separa i frammenti di DNA sulla base delle loro dimensioni. Colonna C18: fase stazionaria a base polimerica (stirenedivenilbenzene) derivatizzata con catene alchiliche a 18 atomi di carbonio. Ha caratteristiche idrofobiche. Fase mobile: contiene solvente organico (acetonitrile) il e un accoppiante ionico (TEAA, trietilammonioacetato). Eluizione: mediante gradiente di acetonitrile. L acetonitrile rompe il legame TEAA-DNA consentendone l eluizione. I frammenti più corti (minor numero di legami DNA-TEAA) vengono eluiti prima rispetto ai frammenti più lunghi che richiedono, per essere eluiti, una maggiore percentuale di acetonitrile nella fase mobile.

28 Interazione tra fase stazionaria e DNA La fase stazionaria (C18) è neutra ed idrofobica. L agente accoppiante (TEAA) è una molecola bifunzionale con un estremità idrofobica ed una polare con carica Positiva (gruppi ammonio). Il TEAA, con i suoi gruppi ammonio si lega al DNA (carico negativamente) e con la catena alchilica interagisce con la superficie idrofobica della C18, facendo da ponte.

29 Separazione di frammenti di DNA in RP-HPLC

30 HPLC denaturante (D-HPLC) La separazione viene effettuata t in condizioni i ni parzialmente denaturanti, nti cioè termostatando la colonna ad una determinata temperatura (temp di quasi denaturazione). In presenza di una mutazione la denaturazione e l eluizione del frammento sarà diversa rispetto al non mutato. Alla temp di quasi denaturazione gli eteroduplici mostrano una parziale denaturazione in corrispondenza del misappaiamento mentre gli omoduplici, alla stessa temperatura, sono ancora nella forma di doppia elica. Gli eteroduplici hanno un comportamento cromatografico diverso rispetto all omoduplice non mutato e generalmente vengono eluiti più rapidamente. La presenza di una mutazione si evidenzia con la comparsa nel cromatogramma di picchi supplementari rispetto al normale.

31 Procedura : HPLC denaturante (D-HPLC) -Amplificazione di DNA wild-type e mutato - Miscela dei due amplificati in rapporto 1:1 - Denaturazione degli amplificati per 3 minuti a 95 C - Riappaiamento per 30 minuti, raffreddando il campione da 95 a 65 C. In presenza di mutazione si avrà la formazione di homo ed eteroduplex. Il mismatch presente negli eteroduplex causa una minore ritenzione Gli eteroduplex eluiscono prima degli homoduplex

32 HPLC denaturante (D-HPLC) Cromatogrammi di un campione eterozigote per una mutazione ottenuti a diverse temperature. Si nota la differente risoluzione degli eteroduplici in base alla temperatura.