Lezione 7. Allineamento di sequenze biologiche

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1 Lezione 7 Allineamento di sequenze biologiche

2 Allineamento di sequenze Determinare la similarità e dedurre l omologia

3 Allineare Definire il numero di passi necessari per trasformare una sequenza nell altra utilizzando passaggi mutazionali come -sostituzione -inserzione/delezione mismatch 1 LA CASA È NUOVA 2 LA CASSA È VUOTA 1 LA CAS-A È NUO-VA 2 LA CASSA È V-UOT-A 5 indels gap 1 LA CASA È NUOVA 2 LA CASSA È VUOTA 1 LA CAS-A È NUOVA 2 LA CASSA È VUOTA match 1 indels + 2 sostituzioni Tra le due soluzioni mostrate (ce ne sono altre!), quale scegliamo? Esistono criteri e algoritmi che ci possono aiutare

4 Perchè allineare? Per fornire una misura di quanto sequenze nucleotidiche o aminoacidiche siano imparentate, abbiano in comune Questa parentela ci permette di fare inferenze biologiche in termini di relazioni strutturali relazioni funzionali relazioni evolutive Alignment-based database searching

5 Terminologia La misura QUANTITATIVA: Similarità Si esprime in genere come % di identità, quantifica i cambiamenti che sono avvenuti dal momento della divergenza tra due specie (sostituzioni, Indels) Identifica i residui cruciali per mantenere la struttura o la funzione di una proteina Alti livelli di similarità possono indicare una divergenza recente tra le sequenze, una storia evolutiva comune, simile funzione biologica

6 Terminologia Una valutazione di STATO: Omologia Implica l esistenza di relazioni evolutive Geni omologhi: geni che si sono originati per divergenza da un antenato comune I geni SONO o NON SONO omologhi, non esiste una misura quantitativa dell omologia

7 Eyeless ha un ruolo importante nel dirigere lo sviluppo dell occhio in drosofila; Pax6 lo stesso nel topo Eyeless e Pax6 sono decisamente simili in sequenza e funzione probably > 500 MYA

8 Terminologia Ortologhi: Geni che si sono separati in seguito ad un evento di speciazione Le sequenze discendono da un antenato comune Molto probabilmente codificano per proteine con domini simili e simili strutture tridimensionali Spesso mantengono funzioni simili Possono essere usati per predire funzioni geniche in genomi nuovi Paraloghi: Geni che si sono evoluti per duplicazione in una specifica linea evolutiva E meno probabile che mantengano funzioni simili, più comunemente evolvono nuove funzioni

9 Homologous sequences. Orthologs and Paralogs are two types of homologous sequences. Orthology describes genes in different species that derive from a common ancestor. Orthologous genes may or may not have the same function. Paralogy describes homologous genes within a single species that diverged by gene duplication.

10 Globale Allineamenti globali e locali trova l allineamento ottimale sul totale della lunghezza delle sequenze È la soluzione migliore per sequenze di lunghezza simile ed omologhe Al dimiuire del grado di similarità (es. aumento distanza evolutiva, alto tasso di ricombinazione) i metodi di allineamento globale tendono a peggiorare molto in efficienza

11 Cercare in GENE di NCBI PAX6 and mouse > scaricare il cds in format FASTA > incollare nell allineatore di BLAST PAX6 and chimpanzee > scaricare il cds in format FASTA > incollare nell allineatore di BLAST Cosa otteniamo?

12 Locale Allineamenti globali e locali Ha lo scopo di trovare regioni simili (es. domini) in due sequenze ( paired subsequences ) Le regioni fuori dalle aree di allineamento locale vengono escluse Può essere generato più di un allineamento locale per ogni coppia di sequenze confrontate Scelta indicata nel caso di due sequenze a similarità ridotta o di differenti lunghezze

13 Local vs. Global Alignment Global Alignment --T -CC-C-AGT -TATGT-CAGGGGACACG A-GCATGCAGA-GAC AATTGCCGCC-GTCGT-T-TTCAG----CA-GTTATG T-CAGAT--C Local Alignment migliore per trovare regioni conservate tcccagttatgtcaggggacacgagcatgcagagac aattgccgccgtcgttttcagcagttatgtcagatc

14 Allineamenti locali: perchè? Due geni in specie diverse possono essere simili in corte regioni conservate e diversi nel resto della sequenza. Esempio: I geni Homeobox (chiaramente omologhi) hanno corte regioni chiamate omeodomini altamente conservate tra specie. Un allineamento globale non troverebbe gli omeodomini perchè cercherebbe di allineare l INTERA sequenza

15 Allineamento: ipotesi circa l omologia posizionale (discendenza da antenato comune) di due residui in due (o più) sequenze Sequenza ancestrale (prima della speciazione: antenato comune delle due sequenze. Non direttamente osservabile (a meno di avere il DNA antico), ma ricostruibile base nr GCGGTCCATCAGCTGGTTGGTGG passato T > C pos 5 C > G pos 13 G > A pos 15 G > T pos 4 Del AG pos 11 e 12 Ins T pos 23 GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTGG GCGTTCCATCCTGGTTGGTGTG Sequenza della specie 1 sequenza della specie 2 presente

16 Un allineamento a coppie consiste di una serie di residui o basi accoppiati, una per sequenza. Ci sono tre tipi di coppie: (a) match = stesso nucleotide (o AA) in entrambe le sequenze (b) mismatch = diverso nucleotide (o AA) in una delle sequenze (c) gap = una base (o AA) in una sequenza e niente nell altra Specie1 GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTG-G Specie2 GCGTTCCATC--CTGGTTGGTGTG aaabbaaaaaccbabaaaaaaaca Come si può fare in modo non manuale??

17 Nelle prossime diapositive cercheremo di rispondere alla domanda: su che cosa si basa un allineatore (algoritmo di allineamento) per operare un allineamento? Come si può fare in modo non manuale??

18 1. Matrici di punteggio e 2. Penalità per i gap Sostituzioni o mismatch In/del o gap Il vero allineamento tra due sequenze è quello che riflette in modo accurato le loro relazioni evolutive (vedi i numerini nell esempio precedente: omologia posizionale). Poichè il vero allineamento non è conosciuto in pratica si cerca l allineamento ottimale: minimizza i mismatches e i gaps secondo certi criteri.purtroppo mms gaps gaps mms

19 ( ( ( Matches Mismatches Gaps (1 terminal) Matches Mismatches Gaps Matches Mismatches Gaps (both terminal)

20 Matrici di punteggio e penalità per i gap Lo schema di punteggio include una penalizzazione per le in-del (gap penalty) e una matrice di punteggio (scoring matrix) M(a,b), che specifica ogni tipo di match (a = b) o di mismatch (a b). Le unità nella matrice di punteggio possono essere nucleotidi nelle sequenze di DNA o RNA, i codoni nelle regioni codificanti, o gli aminoacidi nelle sequenze proteiche.

21 Sostituzioni : mismatches Cos è una matrice di punteggio? Matrice che associa un punteggio ad ogni coppia di entità che troviamo in un allineamento Ogni linea e ogni colonna rappresentano un residuo (4 nucleotidi o 20 aminoacidi) La diagonale è l identità Il triangolo inferiore corrisponde alle sostituzioni e il superiore è simmetrico (non necessario) I valori negativi indicano penalità per certe sostituzioni, l algoritmo di allineamento cercherà di evitarle I valori positivi indicano sostituzioni accettate in termini evoolutivi, strutturali o funzionali

22 Sostituzioni : mismatches Perché è importante capire le matrici di punteggio? Compaiono in ogni analisi che implichi un confronto tra sequenze Implicano un determinato percorso evolutivo Possono influenzare fortemente il risultato delle analisi

23 Sostituzioni : mismatches DNA scoring matrices Di solito sono semplici. La più semplice: M(a,b) assegna valori positivi se a = b (match), altrimenti negativi (mismatch) M(a,b) 0 if a b 0 if a b

24 Sostituzioni : mismatches DNA scoring matrices Matrici più complesse possono distinguere ad esempio tra transizioni e trasversioni (le prime avvengono più facilmente trattandosi di molecole più simili, però ci sono 4 possibili trasversioni e solo 2 transizioni)

25 Sostituzioni : mismatches Amino acid/protein scoring matrices Margareth Dayhoff 1965: Atlas of potein sequences contenente le sequenze aminoacidiche di 65 proteine Inizio delle collezioni di dati da cui avranno origine le banche dati elettroniche Dayhoff et al. nel decennio hanno proposto una procedura per il calcolo di matrici di punteggio per quantificare la propensione di AA a mutare l uno nell altro durante l evoluzione (matrici 20 x 20). Alla base c è l osservazione delle proteine note: MATRICI DI SOSTITUZIONI EMPIRICHE

26 Sostituzioni : mismatches Amino acid/protein scoring matrices Empirical substitution matrices PAM matrix (Percent/Point Accepted Mutation Matrix) BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)

27 ogni valore indica la probabilità che l AAx sia sostituito con l AAy attraverso una o più mutazioni accettate in uno specifico intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due aminoacidi siano stati allineati per caso Sostituzioni : mismatches P > 0 P = 0 P < 0 lo scambio AAx AAy si osserva più frequentemente di quanto atteso per caso la frequenza della sostituzione è indistinguibile da quella casuale lo scambio AAx AAy è più raro di quanto atteso per caso

28 Sostituzioni : mismatches BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix) Henikoff and Henikoff (1992): matrice basata su molte più osservazioni della PAM: scambi aminoacidici calcolati su circa 2000 «blocchi» Blocco: regione conservata di una famiglia di proteine senza indels Direttamente calcolate sulla base di allineamenti locali Probabilità di sostituzione (conservazione) Frequenza degli aminoacidi

29 Default in BLAST Sostituzioni : mismatches E: Asp D: Glu Maggiore il punteggio (score) maggiormente imparentate sono le sequenze

30 Sostituzioni : mismatches Maggiore è il valore, più simili sono le proteine utilizzate nel calcolo della matrice

31 In/Dels : gaps Gap penalties Quanto è probabile una Costo delle indels (GAP) certa sostituzione (matrici) Costo dell introduzione di un gap (Gap opening penalty: G) Costo dell estensione di un gap (Gap extension penalty: L*n) Costo complessivo: G+Ln Questi sono valori usati spesso, ma si possono cambiare!

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34 Algoritmi di allineamento Obiettivo: trovare il miglior allineamento, cioè il massimo numero di simboli identici e il minor numero di gap (=minor numero di mutazioni = più breve percorso evolutivo) Per due sequenze di DNA di 200 basi ci sono possibili allineamenti.meglio non farli a mano!

35 Dynamic programming = tecnica computazionale. Si usa per effettuare ricerche complesse dividendole in una successione di piccoli passaggi, inizialmente semplici e poi più complessi. L ultimo passaggio contiene la soluzione complessiva

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37 Algoritmi di allineamento Esausitivi o esatti: esplorano tutte le possibili soluzioni e scelgono la migliore (lenti, computazionalmente intensi, precisi) Euristici: prendono scorciatoie e cercano di arrivare ad una soluzione ottimale basandosi su ipotesi plausibili Algoritmi di allineamento comuni Algoritmo Esaustivo? Loc/Glo Mul align Db searches Needleman -Wunsch Smith- Waterman Si Global Si No Si Local Si Si FASTA No Local Si Si BLAST No Local No Si

38 Needleman-Wunsch Exact global alignment method Non adatto in molti casi (es. db searches, ricerca di piccole regioni di similarità, allinemanti tra sequenze con grosse differenze di lunghezza) Il più rigoroso e completo se lo scopo è di allineare sequenze che non si sono evolute per exon shuffling, inserzione/delezione di domini, etc. Il metodo migliore se le sequenze sono di lunghezze simili e si sono evolute da un antenato comune attraverso mutazioni di punto, piccole ind/dels

39 Smith-Waterman Exact local alignment method Modifica del N-W che permette di allineare in locale (non serve allineare tutta la seq) Allineamento molto buono per db searching, allineamento multiplo e a coppie Esaustivo, quindi può essere molto lento. A differenza del N-W considera qualunque allineamento che parta da qualunque posizione della sequenza, non solo quelli che cominciano all inizio e terminano alla fine

40 L algoritmo deve identificare le sequenze omologhe e non omologhe separate da un valore soglia Ricerche in database Query (sequenza sonda) ricerca Sequenze nelle banche dati FP: falsi positivi Caso 1: buon lavoro dell algoritmo Sequenze non omologhe Sequenze omologhe VP: veri positivi FN: falsi negativi VN: veri negativi Caso 2: c è una zona in cui non è possibile discriminare omologhe e non VN Regione di sovrapposizione FN FP VP Punteggio soglia

41 FASTA: Pearson WR (1996) Effective protein sequence comparison. Academic Press Inc Pearson WR and Lipman DJ (1998) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS 85:2444 Euristico locale Prima identifica regioni di identità tra la sequenza sonda ( query ) e le sequenze in db. (KTUP) I geni o proteine con la densità maggiore di segnale vengono riesaminati L allineamento viene esteso ad entrambi i lati delle regioni di match aggiungendo gaps e mismatches sulla base di matrici di punteggio L allineamento ottiene un punteggio NB: leggere l HELP del programma

42 E value: significatività statistica Non si interpretano come p values dove p < 0.05 sono generalmente considerati significativi Regola generale E values < 10-6 sono molto probabilmente significativi < E values < 10-3 meritano una seconda occhiata. E values < 10-3 andrebbero scartati (ci aspettiamo di trovare sequenze non correlate alla nostra-falsi positivi- che ottengono un punteggio superiore a quell S).